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1、荧光光度法测定样品中核黄素的含量 基础化学实验（仪器分析实验）化学国家级实验教学示范中心化学国家级实验教学示范中心Northwest University日立日立日立日立F-4500F-4500F-4500F-4500荧光分光光度计的使用（第一次训练）荧光分光光度计的使用（第一次训练）荧光分光光度计的使用（第一次训练）荧光分光光度计的使用（第一次训练）荧光激发光谱和发射光谱的制作（第一次训练）荧光激发光谱和发射光谱的制作（第一次训练）荧光激发光谱和发射光谱的制作（第一次训练）荧光激发光谱和发射光谱的制作（第一次训练）工作曲线法（巩固训练）工作曲线法（巩固训练）工作曲线法（巩固训练）工作曲线法（
2、巩固训练）实验技能训练要点实验技能训练要点一、实验目的二、实验原理三、实验步骤四、结果处理五、思考题六、实验延伸一、实验目的一、实验目的一、实验目的一、实验目的学习荧光分光光度法测定样品中维生素学习荧光分光光度法测定样品中维生素学习荧光分光光度法测定样品中维生素学习荧光分光光度法测定样品中维生素B2B2的分的分的分的分析原理。析原理。析原理。析原理。掌握日立掌握日立掌握日立掌握日立F-4500F-4500荧光分光光度计的使用方法，荧光分光光度计的使用方法，荧光分光光度计的使用方法，荧光分光光度计的使用方法，并了解此仪器的主要构造。并了解此仪器的主要构造。并了解此仪器的主要构造。并了解此仪器的主
3、要构造。了解分子荧光产生的机理。了解分子荧光产生的机理。了解分子荧光产生的机理。了解分子荧光产生的机理。常常常常温温温温下下下下，处处处处于于于于基基基基态态态态的的的的分分分分子子子子吸吸吸吸收收收收一一一一定定定定的的的的紫紫紫紫外外外外可可可可见见见见光光光光的的的的辐辐辐辐射射射射能能能能成成成成为为为为激激激激发发发发态态态态分分分分子子子子，激激激激发发发发态态态态分分分分子子子子通通通通过过过过无无无无辐辐辐辐射射射射跃跃跃跃迁迁迁迁至至至至第第第第一一一一激激激激发发发发态态态态的的的的最最最最低低低低振振振振动动动动能能能能级级级级，再再再再以以以以辐辐辐辐射射射射跃跃跃跃迁
4、迁迁迁的的的的形形形形式式式式回回回回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。二、实验原理二、实验原理二、实验原理二、实验原理激发光谱：固定测量波长激发光谱：固定测量波长激发光谱：固定测量波长激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长选最大发射波长选最大发射波长选最大发射波长)，化合物发射的，化合物发射的，化合物发射的，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，荧光强度与照射光波长的关系曲线。激
5、发光谱曲线的最高处，荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。处于激发态的分子最多，荧光强度最大。处于激发态的分子最多，荧光强度最大。处于激发态的分子最多，荧光强度最大。发发发发射射射射光光光光谱谱谱谱：固固固固定定定定激激激激发发发发光光光光波波波波长长长长(选选选选最最最最大大大大激激激激发发发发波波波波长长长长),),化化化化合合合合物物物物发发发发射射射射的的的的荧光强度与发射光波长关系曲线荧光强度与发射光波长关系曲线荧光强度与发射光波长关系曲线荧光强度与发射光波长关系曲线荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱激发光谱激发光谱激发光谱激发光谱发
6、射光谱发射光谱发射光谱发射光谱 固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。是本实验的关键。荧光分析法荧光分析法 在稀溶液中在稀溶液中在稀溶液中在稀溶液中，荧光强度，荧光强度，荧光强度，荧光强度I IF F与物质的浓度与物质的浓度与物质的浓度与物质的浓度c c有以下的关系：有以下的关系：有以下的关系：有以下的关系：当实验条件一定时，荧
7、光强度与荧光物质的浓度成线性关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。这是荧光光谱法定量分析的理论依据。这是荧光光谱法定量分析的理论依据。这是荧光光谱法定量分析的理论依据。I I I IF F F F-荧光强度荧光强度荧光强度荧光强度 F F F F-荧光量子产率荧光量子产率荧光量子产率荧光量子产率b-b-b-b-吸收光程吸收光程吸收光程吸收光程 -摩尔吸光系数摩尔吸光系数摩尔吸光系数摩尔吸光系数C C C C-荧光物质浓度荧光物质浓度
8、荧光物质浓度荧光物质浓度a.a.与紫外与紫外与紫外与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。敏度。敏度。敏度。b.b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。谱来鉴定物质。谱来鉴定物质。谱来鉴定物质。c.c.所需试样量少、操作方法简便。所需试样量少、操作方法简便。所需试样量少、操作方法简便。所需试样量
9、少、操作方法简便。荧光分析法的特点荧光分析法的特点荧光分析仪器荧光分析仪器 常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：器和显示记录器五部分构成，如下图所示：器和显示记录器五部分构成，如下图所示：器和显示记录器五部分构成，如下图所示：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：a.
10、a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；b.b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。光并消除其它杂散光干扰。光并消除其它杂散光干扰。光并消除其它杂散光干扰。光源的要求：光源的要求：vv发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱发射强度
11、足够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱vv光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小vv有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：常用气体放电灯类型：氙灯光源氙灯光源氙灯光源氙灯光源 高压汞光源高压汞光源高压汞光源高压汞光源氙灯氙灯氙灯氙灯光栅：光栅：光栅：光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距等宽度等间距等宽度等间距等宽度等间距条痕条痕条痕条
12、痕(600(600、12001200、24002400条条条条/mm)/mm)。原理原理原理原理：利用光通过光栅时利用光通过光栅时利用光通过光栅时利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光发生衍射和干涉现象而分光发生衍射和干涉现象而分光发生衍射和干涉现象而分光.单色器单色器检测器检测器检测器检测器光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管样品池：四面透光，石英玻璃制样品池：四面透光，石英玻璃制样品池：四面透光，石英玻璃制样品池：四面透光，石英玻璃制1.1.1.1.样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样可
13、见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样2.2.2.2.吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围波长范围波长范围波长范围3.3.3.3.使用注意事项使用注意事项使用注意事项使用注意事项容易破碎容易破碎容易破碎容易破碎问题：问题：问题：问题：紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光
14、光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？样品池有什么区别？样品池有什么区别？样品池有什么区别？沾污问题沾污问题沾污问题沾污问题O维生素维生素维生素维生素B2B2（又叫核黄素，（又叫核黄素，（又叫核黄素，（又叫核黄素，VB2VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：维生素维生素维生素维生素B B2 2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为
15、光黄素，光黄素在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，用氯仿萃取后可进行荧光测定。的荧光比核黄素的荧光强的多，用氯仿萃取后可进行荧光测定。的荧光比核黄素的荧光强的多，用氯仿萃取后可进行荧光测定。的荧光比核黄素的荧光强的多，用氯仿萃取后可进行荧光测定。但通常采用简化的方法测定维生素但通常采用简化的方法测定维生素但通常采用简化的方法测定维生素但通常采用简化的方法测定维生素B B2 2。溶液在。溶液在。溶液在。溶液在420420450 nm450 nm蓝光的照蓝光的照蓝光的照蓝光的照射下，发出绿色荧光，其
16、峰值波长为射下，发出绿色荧光，其峰值波长为射下，发出绿色荧光，其峰值波长为射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm525 nm。VBVB2 2的荧光在的荧光在的荧光在的荧光在pH=6pH=67 7时时时时最强，在最强，在最强，在最强，在pH=11pH=11时消失。故测时消失。故测时消失。故测时消失。故测VBVB2 2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，的荧光时溶液要控制在酸性范围内，的荧光时溶液要控制在酸性范围内，的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。且在避光条件下进行。且在避光条件下进行。且在避光条件下进行。核黄素(VB2)光黄素药片中维生素药片中维生素药片中维生素药片中维生素
17、B B2 2含量的测定含量的测定含量的测定含量的测定1日立F-4500型荧光光度计及其附件。2容量瓶：50mL。3维生素B2标准贮备液（20gmL-1）：准确称取20mg维生素B2，用1/10(v/v)的醋酸定容至1000mL容量瓶中，保存于冰箱中。醋酸：1/10(v/v)。仪器与试剂仪器与试剂仪器与试剂仪器与试剂 1 1绘制工作曲线绘制工作曲线绘制工作曲线绘制工作曲线 准确移取维生素准确移取维生素准确移取维生素准确移取维生素B B2 2标准溶液液标准溶液液标准溶液液标准溶液液0 0，0.500.50，1.501.50，2.502.50，3.503.50和和和和5.00 mL5.00 mL，分
18、别加入，分别加入，分别加入，分别加入6 6个个个个50 mL50 mL容量瓶中，用去离子水定容，摇容量瓶中，用去离子水定容，摇容量瓶中，用去离子水定容，摇容量瓶中，用去离子水定容，摇匀，其浓度分别为匀，其浓度分别为匀，其浓度分别为匀，其浓度分别为0 0，0.200.20，0.600.60，1.001.00，1.401.40，2.002.00 g gmLmL-1-1。三、实验步骤三、实验步骤三、实验步骤三、实验步骤2 2样品的准备样品的准备样品的准备样品的准备 准确称取粉碎后的核黄素样品准确称取粉碎后的核黄素样品准确称取粉碎后的核黄素样品准确称取粉碎后的核黄素样品0.10.2g0.10.2g，用
19、，用，用，用30mL1/10(v/v)30mL1/10(v/v)醋酸溶解，必要时低温加热使其溶解完全，然后用水定容至醋酸溶解，必要时低温加热使其溶解完全，然后用水定容至醋酸溶解，必要时低温加热使其溶解完全，然后用水定容至醋酸溶解，必要时低温加热使其溶解完全，然后用水定容至100mL100mL。由于样品中存在辅助的添加剂，如淀粉，使溶液浑浊，。由于样品中存在辅助的添加剂，如淀粉，使溶液浑浊，。由于样品中存在辅助的添加剂，如淀粉，使溶液浑浊，。由于样品中存在辅助的添加剂，如淀粉，使溶液浑浊，不利于荧光测定，所以需要对其进行干过滤，过滤后，准确移不利于荧光测定，所以需要对其进行干过滤，过滤后，准确移
20、不利于荧光测定，所以需要对其进行干过滤，过滤后，准确移不利于荧光测定，所以需要对其进行干过滤，过滤后，准确移取滤液取滤液取滤液取滤液0.50mL0.50mL于于于于50mL50mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度。容量瓶中，用去离子水定容至刻度。容量瓶中，用去离子水定容至刻度。容量瓶中，用去离子水定容至刻度。3 3维生素维生素维生素维生素B B2 2的激发光谱和发射光谱的绘制的激发光谱和发射光谱的绘制的激发光谱和发射光谱的绘制的激发光谱和发射光谱的绘制 激发光谱的制作激发光谱的制作激发光谱的制作激发光谱的制作:按仪器的使用方法准备好仪器。待仪器稳定按仪器的使用方法准备好仪器。待仪器稳定按仪器的使
21、用方法准备好仪器。待仪器稳定按仪器的使用方法准备好仪器。待仪器稳定后，将后，将后，将后，将2.002.00 g gmLmL-1-1的维生素的维生素的维生素的维生素B B2 2标准溶液润洗样品池，然后装标准溶液润洗样品池，然后装标准溶液润洗样品池，然后装标准溶液润洗样品池，然后装入溶液，放入仪器中，首先固定荧光的发射波长入溶液，放入仪器中，首先固定荧光的发射波长入溶液，放入仪器中，首先固定荧光的发射波长入溶液，放入仪器中，首先固定荧光的发射波长（400nm600nm400nm600nm），然后扫描激发光波长，以所测得的该发射），然后扫描激发光波长，以所测得的该发射），然后扫描激发光波长，以所测得
22、的该发射），然后扫描激发光波长，以所测得的该发射波长下的荧光强度对激发光波长作图，即可得到荧光化合物的波长下的荧光强度对激发光波长作图，即可得到荧光化合物的波长下的荧光强度对激发光波长作图，即可得到荧光化合物的波长下的荧光强度对激发光波长作图，即可得到荧光化合物的激发光谱，从光谱中可以得到最大激发波长激发光谱，从光谱中可以得到最大激发波长激发光谱，从光谱中可以得到最大激发波长激发光谱，从光谱中可以得到最大激发波长 。发射光谱的制作发射光谱的制作发射光谱的制作发射光谱的制作 固定荧光的激发波长为固定荧光的激发波长为固定荧光的激发波长为固定荧光的激发波长为 ，扫描发射单，扫描发射单，扫描发射单，扫
23、描发射单色器，然后记录发射荧光强度，以所测得的各波长荧光强度色器，然后记录发射荧光强度，以所测得的各波长荧光强度色器，然后记录发射荧光强度，以所测得的各波长荧光强度色器，然后记录发射荧光强度，以所测得的各波长荧光强度对发射波长作图，即可得发射光谱，从光谱中可以得到最大对发射波长作图，即可得发射光谱，从光谱中可以得到最大对发射波长作图，即可得发射光谱，从光谱中可以得到最大对发射波长作图，即可得发射光谱，从光谱中可以得到最大发射波长发射波长发射波长发射波长 以以以以 为激发波长，以为激发波长，以为激发波长，以为激发波长，以 为荧光发射波长，为荧光发射波长，为荧光发射波长，为荧光发射波长，分别测定标
24、准系列溶液和样品溶液的荧光强度。分别测定标准系列溶液和样品溶液的荧光强度。分别测定标准系列溶液和样品溶液的荧光强度。分别测定标准系列溶液和样品溶液的荧光强度。4 4 4 4标准系列与样品溶液的测定标准系列与样品溶液的测定标准系列与样品溶液的测定标准系列与样品溶液的测定1 1 1 1列表记录各项实验数据。列表记录各项实验数据。列表记录各项实验数据。列表记录各项实验数据。2 2 2 2以荧光强度为纵坐标，标准系列溶液浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，标准系列溶液浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，标准系列溶液浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，标准系列溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。绘制标准曲线。绘制
25、标准曲线。绘制标准曲线。3 3 3 3根据样品溶液的荧光强度，在标准曲线上查得对应的根据样品溶液的荧光强度，在标准曲线上查得对应的根据样品溶液的荧光强度，在标准曲线上查得对应的根据样品溶液的荧光强度，在标准曲线上查得对应的浓度浓度浓度浓度CxCxCxCx，然后计算样品中维生素，然后计算样品中维生素，然后计算样品中维生素，然后计算样品中维生素B2B2B2B2的百分含量。的百分含量。的百分含量。的百分含量。四、数据处理四、数据处理四、数据处理四、数据处理1激发波长与荧光波长有何关系？为什么？2测定过程中应注意哪些问题？五、思考题五、思考题五、思考题五、思考题六、实验延伸六、实验延伸六、实验延伸六、
26、实验延伸1 1、蛋白质是生物大分子，它能在溶液中与某些染料静电吸、蛋白质是生物大分子，它能在溶液中与某些染料静电吸、蛋白质是生物大分子，它能在溶液中与某些染料静电吸、蛋白质是生物大分子，它能在溶液中与某些染料静电吸引或氢键结合，可用紫外可见光度法或荧光测定蛋白质。引或氢键结合，可用紫外可见光度法或荧光测定蛋白质。引或氢键结合，可用紫外可见光度法或荧光测定蛋白质。引或氢键结合，可用紫外可见光度法或荧光测定蛋白质。蛋白质的荧光，主要是构成它的色氨酸，络氨酸和苯丙氨蛋白质的荧光，主要是构成它的色氨酸，络氨酸和苯丙氨蛋白质的荧光，主要是构成它的色氨酸，络氨酸和苯丙氨蛋白质的荧光，主要是构成它的色氨酸，
27、络氨酸和苯丙氨酸具有的荧光，通过蛋白质的天然荧光用荧光法检测比紫酸具有的荧光，通过蛋白质的天然荧光用荧光法检测比紫酸具有的荧光，通过蛋白质的天然荧光用荧光法检测比紫酸具有的荧光，通过蛋白质的天然荧光用荧光法检测比紫外吸收法灵敏。荧光探针是一类比蛋白质荧光发射较强荧外吸收法灵敏。荧光探针是一类比蛋白质荧光发射较强荧外吸收法灵敏。荧光探针是一类比蛋白质荧光发射较强荧外吸收法灵敏。荧光探针是一类比蛋白质荧光发射较强荧光的染料，它吸附或共价结合到蛋白质上，荧光特性会发光的染料，它吸附或共价结合到蛋白质上，荧光特性会发光的染料，它吸附或共价结合到蛋白质上，荧光特性会发光的染料，它吸附或共价结合到蛋白质上
28、，荧光特性会发生变化，从而可以利用荧光分析研究蛋白质的结构和测定生变化，从而可以利用荧光分析研究蛋白质的结构和测定生变化，从而可以利用荧光分析研究蛋白质的结构和测定生变化，从而可以利用荧光分析研究蛋白质的结构和测定蛋白质。蛋白质。蛋白质。蛋白质。2 2、探讨蛋白质的激发光谱和发射光谱。、探讨蛋白质的激发光谱和发射光谱。、探讨蛋白质的激发光谱和发射光谱。、探讨蛋白质的激发光谱和发射光谱。参考文献参考文献参考文献参考文献1、杨建男徐大庆马勇FIA荧光光度法测定粮食中的核黄素。分析仪器1990，V04，p11.2、荧光分析原理(影印)（美）拉科维兹编著，科学出版社2008年03月第三版3、仪器分析教程叶宪曾，张新祥等编著，北京大学出版社2007年01月第2版