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1、多能干细胞免疫染色多能干细胞免疫染色及畸胎瘤石蜡切片的制作流程及畸胎瘤石蜡切片的制作流程成璐成璐复旦大学复旦大学生物医学研究院生物医学研究院第一部分第一部分多能干细胞免疫染色过程多能干细胞免疫染色过程铺细胞铺细胞细胞的固定细胞的固定细胞的荧光染色细胞的荧光染色观察荧光染色并拍照观察荧光染色并拍照提纲提纲铺细胞铺细胞ES细胞或细胞或iPS细胞的密度要求细胞的密度要求无滋养层细胞较好无滋养层细胞较好n传代后至克隆形态良好，密度适中。n通常传至24孔板中。因为用Hochest染核对照也会将滋养层细胞的核同时染上，影响克隆定位。Oct4/DAPI铺细胞铺细胞细胞的固定细胞的固定细胞的荧光染色细胞的荧光
2、染色观察荧光染色并拍照观察荧光染色并拍照提纲提纲材料材料细胞的固定细胞的固定流程流程把细胞固定在4PFA中，室温放置30min 4多聚甲醛（4PFA,Paraformaldehyde）固定细胞之前，将培养基吸弃，用PBS涮涮2次 n0.1M的PBS配制（PH7.4），100mL PBS加4克多聚甲醛。n由于多聚甲醛难溶于水，需用磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60以下。铺细胞铺细胞细胞的固定细胞的固定细胞的荧光染色细胞的荧光染色观察荧光染色并拍照观察荧光染色并拍照提纲提纲细胞的荧光染色细胞的荧光染色材料材料流程流程n阳性阳性染色对照染色对照：染色呈阴性时，证实染色的有效性n阴性染色对照阴性染色对
3、照：染色呈阳性时，证实染色的特异性n一抗、二抗、一抗、二抗、Hoechst（DAPI）：分别发挥如下作用：识别特异抗原、特异一抗及细胞核n抗体稀释液抗体稀释液：稀释抗体n封闭液封闭液：封闭非特异性反应洗涤细胞洗涤细胞透膜（仅限染核抗体）透膜（仅限染核抗体）一抗孵育一抗孵育二抗孵育二抗孵育染核定位（染核定位（Hochest）细胞的荧光染色细胞的荧光染色材料材料n阳性阳性染色对照染色对照：以多能干细胞标记物染色为例，阳性染色对照细胞是确定表达相应抗体的细胞，如ES细胞或经过验证的iPS细胞n阴性染色对照阴性染色对照：是确定不表达相应抗体的细胞，如成纤维细胞等。n一抗一抗：要确保所购买的一抗识别所染
4、细胞的物种；要做预实验以确定最适的抗体浓度n二抗二抗：要根据所染细胞自身所带的荧光类型决定相应的二抗的荧光类型，二者应不同。nHoechst：英文名称：bisBenzimide（Sigma B1155）；以PBS配制成1mg/ml 的母液，分装后于-20保存；常用的可置于4 ，染色时以1XPBS 1000倍稀释。n抗体稀释液抗体稀释液：0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于1XPBS；4 保存；尽量现用现配，因含蛋白成分，容易变质，长菌。n封闭液封闭液：含1%BSA+4%normal serum+0.4%TritonX100的1XPBS溶液；4 保存；尽量现用现配，因含蛋白成分，容易
5、变质，长菌。细胞的荧光染色细胞的荧光染色流程流程l所有洗涤，浸泡步骤都在摇床上进行。目的是为了洗涤，浸泡充分均匀。l“洗涤”指将平板置于摇床上摇洗35分钟 把细胞固定在把细胞固定在4PFA中，室温放置中，室温放置30min 1X PBS 洗涤洗涤2次次 抗体稀释液洗涤两次抗体稀释液洗涤两次 无水乙醇中浸泡两次，每次无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或（或3次，次，10min/次）次）(此步仅限于核蛋白染色，如此步仅限于核蛋白染色，如Oct4，Nanog或或Rex1等，不能用于膜蛋白等，不能用于膜蛋白)1X PBS洗涤洗涤1次次 封闭液封闭细胞，室温，封闭液封闭细胞，室温，1h 将一抗稀释在抗
6、体稀释液中，加到样品上，室温将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或或4 放置过夜放置过夜(以以24孔板为例，孔板为例，一抗的体积：一抗的体积：200ul/孔孔)细胞的荧光染色细胞的荧光染色流程流程吸弃一抗，用吸弃一抗，用PBT（0.1%TritonX100 in PBS）洗涤细胞）洗涤细胞35次次将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到样品孔里，室温放置将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到样品孔里，室温放置1h;(以以24孔板为例，孔板为例，二抗的体积：二抗的体积：200ul/孔孔)注意：从以下步骤开始，样品要注意避光！注意：从以下步骤开始，样品要注意避光！注意：从以下步骤开始，样品要注意避光！
7、注意：从以下步骤开始，样品要注意避光！用用PBT洗涤洗涤3次，约次，约5min/次次 用用PBS洗涤两次，洗涤两次，5min/次次 再用再用4PFA室温固定室温固定30min 最后再用最后再用PBS洗涤两次，每次洗涤两次，每次5min Hoechst染核染核,室温放置室温放置5min 铺细胞铺细胞细胞的固定细胞的固定细胞的荧光染色细胞的荧光染色观察荧光染色并拍照观察荧光染色并拍照提纲提纲观察荧光染色并拍照观察荧光染色并拍照iPS细胞染色实例细胞染色实例n多能干细胞标记物的常用抗体：n膜抗体：SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4n胞浆抗体：Tra-1-60、Tra-1-81n核抗体：Oct4
8、、Nanog、Rex1h阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照Rat-iPSCs观察荧光染色并拍照观察荧光染色并拍照iPS细胞染色实例细胞染色实例阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照hhESCsTra-1-60观察荧光染色并拍照观察荧光染色并拍照iPS细胞染色实例细胞染色实例Pig-iPSCs观察荧光染色并拍照观察荧光染色并拍照iPS细胞染色实例细胞染色实例Human-iPSCs EB 分化染色分化染色Sox17AFPNestin-actinSMATuj1内胚层内胚层中胚层中胚层外胚层外胚层第二部分第二部分畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤畸胎瘤的获得的获得畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片
9、的制备畸胎瘤石蜡切片的畸胎瘤石蜡切片的HE染色染色畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 提纲提纲畸胎瘤的获得畸胎瘤的获得ES细胞或细胞或iPS细胞的收集细胞的收集n细胞数量：一个细胞数量：一个T75长到长到80-90%满时，细胞数大约为满时，细胞数大约为1000万万个，可以打两个点，即每个点约个，可以打两个点，即每个点约300-500万个细胞；万个细胞；n细胞处理：细胞处理：小鼠及大鼠小鼠及大鼠iPS细胞：将细胞消化成单细胞；细胞：将细胞消化成单细胞；1200rpm离心离心5min后弃上清；以小于后弃上清；以小于400ul的的10%DMEM重悬；重悬；人人iPS细胞：将
10、消化下来的细胞吹打成较小块；静置至细胞细胞：将消化下来的细胞吹打成较小块；静置至细胞团块沉底，并弃上清；以小于团块沉底，并弃上清；以小于400ul的的hES培基重悬；培基重悬；n收集细胞到收集细胞到1ml注射器内并注射。注射器内并注射。畸胎瘤的获得畸胎瘤的获得ES细胞或细胞或iPS细胞的注射细胞的注射n材料：多重免疫缺陷小鼠（NODSCID小鼠）n注射部位：后腿内侧肌肉注射畸胎瘤的生长和摘取畸胎瘤的生长和摘取畸胎瘤的获得畸胎瘤的获得n通常注射30-40天之后，畸胎瘤就长成直径大概1-2cm左右的球体n当畸胎瘤长到一定体积时，手术摘除畸胎瘤n通常畸胎瘤都是实质性的，也有个别呈空泡状。约约1-2c
11、m畸胎瘤畸胎瘤的获得的获得畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的畸胎瘤石蜡切片的HE染色染色畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 提纲提纲流程流程固定固定畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备包埋包埋切片切片材料材料n4%PFA：固定畸胎瘤组织用n石蜡石蜡（熔点约50-60度）：包埋组织n石蜡包埋机石蜡包埋机（非必须）：包埋组织，还需要包埋盒、包埋底n石蜡切片机石蜡切片机（必须）：切半薄“Semi-thick”石蜡切片n染色缸、染色架、载玻片、盖玻片染色缸、染色架、载玻片、盖玻片n溶液溶液：n载玻片：载玻片：防脱片；也可以自制“蛋白胶”涂在切片上晾干
12、乙醇（EtOH）、二甲苯（Xylene）、氯仿（Chloroform）HE染色液（H：Hematoxyline苏木精、E：Eosin 伊红）封片树脂染色架染色架染色缸染色缸捞片、展片捞片、展片染色染色流程流程固定固定畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备在在4%PFA中固定，中固定，4（浸泡）过夜（浸泡）过夜换成新鲜的换成新鲜的 4%PFA，再次，再次4浸泡过夜浸泡过夜（过长时间浸在固定液中会降低样品的抗原性，影响后续的免疫染色）（过长时间浸在固定液中会降低样品的抗原性，影响后续的免疫染色）l4固定是为了更好的保持标本的抗原性，室温也可以流程流程固定固定畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制
13、备包埋之脱水、透明包埋之脱水、透明70 EtOH 1h80 EtOH 1h90 EtOH 1h95 EtOH 1h100EtOH 1hFresh 100EtOH 1h Fresh 100EtOH overnight氯仿氯仿 1h新鲜氯仿新鲜氯仿 1h新鲜氯仿新鲜氯仿 overnight 脱水脱水透明透明流程流程畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备包埋包埋石蜡包石蜡包埋盒埋盒经透明处经透明处理的样品理的样品溶解溶解石蜡石蜡1h2h溶解溶解石蜡石蜡50-60，取决于石蜡的融点，取决于石蜡的融点固定固定包埋之包埋包埋之包埋流程流程固定固定畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备包埋包埋 之之 包
14、埋包埋n如果没有石蜡包埋机，可以用60 烘箱代替；n利用酒精灯加热镊子可代替高温镊子；n将样品快速放到石蜡包埋底内，盖上包埋盒的底座，直至石蜡全部凝结；n修整蜡块形状、备用。溶解蜡存放槽出蜡口冷冻台高温镊子石蜡包埋盒和包埋底存放槽各种规格的石蜡包埋底各种规格的石蜡包埋底n用单面刀片修整蜡块，并达到以下要求：n（1）蜡块呈正方形或长方形，蜡块各面要平直，样品位于蜡块正中央；n（2）样品边缘与蜡块边缘的距离约3mm。流程流程固定固定畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备包埋包埋 之之 修整蜡块修整蜡块样品与蜡块样品与蜡块边缘有一定边缘有一定距离，以便距离，以便切片能够连切片能够连成蜡带成蜡带平行
15、平行流程流程固定固定畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备包埋包埋切片切片蜡块固定座刀片切片厚度微调旋钮手动切片转轮切片厚度：切片厚度：5微米微米蜡带毛笔固定固定包埋包埋切片切片捞片、展片捞片、展片流程流程畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备37蒸馏水蒸馏水载玻片置于37-42 的烘片台（平面）上样品切片样品切片切片借助水的表面张力展开至平整吸除多余水分，37 烤片过夜,备用做好样品ID的标记流程流程畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备烤片机烤片机37 烤片过夜，防止脱片烤片过夜，防止脱片展片温水槽展片温水槽温度设定：温度设定：37-42左右左右固定固定包埋包埋切片切片捞片、展片、烤
16、片捞片、展片、烤片畸胎瘤畸胎瘤的获得的获得畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的畸胎瘤石蜡切片的HE染色染色畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 提纲提纲流程流程 脱蜡亲水脱蜡亲水畸胎瘤石蜡切片的畸胎瘤石蜡切片的HE染色染色100%EtOH浸泡浸泡2次次 10min/次次95%EtOH 5min90%EtOH 5min80%EtOH 5min70%EtOH 5min蒸蒸馏馏水浸洗水浸洗3次，次，5min/次次Xylene1Xylene3Xylene2Xylene4脱蜡脱蜡亲水亲水（非一次性使用，可反复多次使用）二甲苯浸泡二甲苯浸泡4次次 5min/次次
17、流程流程 染色染色畸胎瘤石蜡切片的畸胎瘤石蜡切片的HE染色染色在在盐盐酸酒精溶液内浸一下至酸酒精溶液内浸一下至变变成接近成接近红红色，此步色，此步骤骤称称为为“盐盐酸分化酸分化”(1%盐盐酸酒精溶液：指染色缸中酸酒精溶液：指染色缸中70酒精中含酒精中含1%盐盐酸酸)将切片将切片 在自来水在自来水龙头龙头下流水冲洗下流水冲洗15-20分分钟钟，至切片呈理，至切片呈理想的紫想的紫蓝蓝色，此步色，此步骤骤称称“蓝蓝化化”（颜颜色的适宜度取决于染色者的色的适宜度取决于染色者的经验经验）蒸蒸馏馏水中涮洗一下水中涮洗一下切片在切片在Eosin溶液中染溶液中染5min自来水涮洗至水接近无色自来水涮洗至水接近
18、无色蒸蒸馏馏水涮洗一下水涮洗一下切片在切片在 Hematoxylin 溶液中浸泡溶液中浸泡 10min自来水中涮洗自来水中涮洗2、3次至水接近无色次至水接近无色蒸蒸馏馏水中涮洗水中涮洗1次次流程流程 脱水封片脱水封片畸胎瘤石蜡切片的畸胎瘤石蜡切片的HE染色染色100%EtOH浸泡浸泡2次次 10min/次次脱水脱水二甲苯浸泡二甲苯浸泡4次次 5min/次次Xylene1Xylene3Xylene2Xylene4透明透明（非一次性使用，可反复多次使用）70%EtOH short time80%EtOH short time90%EtOH short time树树脂封片，脂封片，显显微微镜镜下下观
19、观察察(以上几步一方面是为了脱水，另一方面是为了脱去多余以上几步一方面是为了脱水，另一方面是为了脱去多余的的Eosin颜色，所以，要注意观察切片颜色的变化。颜色，所以，要注意观察切片颜色的变化。70和和80的酒精只要稍稍浸一下即可，的酒精只要稍稍浸一下即可，90的酒精是调整的酒精是调整颜色的关键步骤，在这一步要依靠染色者根据切片颜色颜色的关键步骤，在这一步要依靠染色者根据切片颜色自觉调整时间。新鲜的无水酒精没有脱色作用自觉调整时间。新鲜的无水酒精没有脱色作用)流程流程畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备在样品中央滴一滴封片树脂固定固定包埋包埋切片切片捞片、展片捞片、展片封片封片封片封片树脂
20、树脂避免气泡通风橱内操作为宜！通风橱内操作为宜！末端末端蘸有少蘸有少量二甲苯的量二甲苯的盖玻片盖玻片畸胎瘤畸胎瘤的获得的获得畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的制备畸胎瘤石蜡切片的畸胎瘤石蜡切片的HE染色染色畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别 提纲提纲畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别分化良好的畸胎瘤分化良好的畸胎瘤畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别外胚层外胚层神经上皮神经上皮色素上皮色素上皮角质上皮角质上皮畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别中胚层中胚层脂肪组织脂肪组织肌肉组织肌肉组织软骨组织软骨组织骨组织骨组织畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别畸胎瘤石蜡切片各胚层组织的辨别内胚层内胚层呼吸上皮呼吸上皮腺体组织腺体组织原始肾脏组织原始肾脏组织