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1、4.5 4.5 细菌的遗传分析与基因定位细菌的遗传分析与基因定位4.5.14.5.1细菌的转化和基因定位细菌的转化和基因定位转化转化：指某些细菌能通过其细胞膜指某些细菌能通过其细胞膜摄取摄取周围供体的染色周围供体的染色体片段，将此外源体片段，将此外源DNADNA片段通过片段通过重组重组加入自己染色体组加入自己染色体组的过程。的过程。19281928年，格里费斯年，格里费斯(Griffith F.)(Griffith F.)在肺炎双球菌中发现在肺炎双球菌中发现转化现象。转化现象。19441944年，阿委瑞年，阿委瑞(Avery O.T.)(Avery O.T.)成功地进行了肺炎双球菌成功地进行了
2、肺炎双球菌转化试验；证实遗传物质是转化试验；证实遗传物质是DNADNA；转化是细菌交换基因的；转化是细菌交换基因的方法之一。方法之一。细菌中的大部分的转化工作是用下面细菌中的大部分的转化工作是用下面三种细菌完三种细菌完成成的：的：肺炎双球菌，枯草杆菌和流感嗜血杆菌。肺炎双球菌，枯草杆菌和流感嗜血杆菌。转化主要分为二个步骤进行转化主要分为二个步骤进行:(一一)供体供体DNADNA与受体细胞间的接触与互作与受体细胞间的接触与互作 肺炎双球菌转化：肺炎双球菌转化：DNADNA片断至少有片断至少有800800个碱基对；个碱基对；枯草杆菌的转化：枯草杆菌的转化：DNADNA片断至少有片断至少有16000
3、16000个碱基对。个碱基对。转化的第一步是使转化转化的第一步是使转化DNADNA与受体细菌间的成功地与受体细菌间的成功地相互作用，这包括：相互作用，这包括：转化片段的大小、形态、浓度和转化片段的大小、形态、浓度和受体细胞的生理状态。受体细胞的生理状态。.转化片断的大小：转化片断的大小：.供体供体DNADNA分子存在的数目：分子存在的数目：对特定基因来说，供体对特定基因来说，供体DNADNA分子数目与成功转化有关。分子数目与成功转化有关。链霉素抗性基因转化：链霉素抗性基因转化：在每个细胞含有在每个细胞含有1010个个DNADNA分子之前，分子之前，抗性转化体数目一直与抗性转化体数目一直与DNA
4、DNA分子存在数目成正比。分子存在数目成正比。原因：原因：在细菌的细胞壁或细胞膜上有固定数量的在细菌的细胞壁或细胞膜上有固定数量的DNADNA接受接受座位，座位，故一般细菌摄取的故一般细菌摄取的DNADNA分子数分子数小于小于1010个。个。受体的生理状态：受体的生理状态：受体细胞受体细胞必须在生理上必须在生理上处于感受态处于感受态。这种感受态只能发生在细菌生长周期的这种感受态只能发生在细菌生长周期的某一时间某一时间范围内范围内，在感受态内，活跃合成的蛋白质的细菌细胞，在感受态内，活跃合成的蛋白质的细菌细胞壁多少发生改变而壁多少发生改变而易于接受转化易于接受转化DNADNA。、转化转化DNAD
5、NA的摄取和整合过程：的摄取和整合过程：细菌中的转化，包括细菌中的转化，包括供体供体DNADNA的结合与穿入，联会和整合的结合与穿入，联会和整合。当细菌处于当细菌处于感受态感受态时，外源双链时，外源双链DNADNA分子可结合在分子可结合在受体细胞表面的受体细胞表面的接受座位上接受座位上。细菌在摄取外源。细菌在摄取外源DNADNA时，时，由由DNADNA移位酶降解其中一条链，并利用降解这条链产生移位酶降解其中一条链，并利用降解这条链产生的能量，将另一条链拉进细胞中。的能量，将另一条链拉进细胞中。.结合与穿入：结合与穿入：供体单链供体单链DNADNA片段一旦进入细胞，按各个不同的片段一旦进入细胞，
6、按各个不同的位点与其相应的受体位点与其相应的受体DNADNA片段联会。片段联会。.联会：联会：单链的转化单链的转化DNADNA通过与受体通过与受体DNADNA对应位点的对应位点的置换置换从而稳定从而稳定地参入到受体地参入到受体DNADNA中。中。整合整合(重组重组)：(三三)转化和基因重组作图转化和基因重组作图 例如：黎德伯格等用枯草杆菌进行转化和重组试验例如：黎德伯格等用枯草杆菌进行转化和重组试验 DNA DNA 片段进入受体细胞之后，可与受体染色体发片段进入受体细胞之后，可与受体染色体发生重组。生重组。紧密连锁紧密连锁的两个基因有较多的机会包括在同的两个基因有较多的机会包括在同一个一个DN
7、ADNA片段中，并同时整合到受体染色体中。片段中，并同时整合到受体染色体中。Trp2 his2 tyr1 三者并发转化的频率最高，故这三者并发转化的频率最高，故这3 3个基因是连锁的，个基因是连锁的，其中其中his2his2和和tyr1tyr1连锁紧密：连锁紧密：单交换时，染色体开环易降解，故不存在单交换类型；单交换时，染色体开环易降解，故不存在单交换类型；只有双交换和偶数的多交换才有效的。只有双交换和偶数的多交换才有效的。4.5.24.5.2细菌的细菌的接合接合和基因定位和基因定位1.1.接合：接合：是指原核生物的遗传物质从是指原核生物的遗传物质从供体供体(donor)(donor)转移转移
8、到到受体受体(receptor)(receptor)内的过程。内的过程。特点：特点：需通过需通过细胞的直接接触细胞的直接接触。B B菌株：菌株：Met+bio+thr-leu-Met+bio+thr-leu-，需加需加苏氨酸苏氨酸和和亮氨酸亮氨酸。不同营养缺陷型的大肠杆菌：不同营养缺陷型的大肠杆菌：A A菌株：菌株：Met-bio-thr+leu+Met-bio-thr+leu+，需加需加甲硫氨酸甲硫氨酸和和生物素生物素。4.5.2.14.5.2.1黎德伯格和塔特姆（黎德伯格和塔特姆（19461946年）：年）：A A菌株和菌株和B B菌株营养缺陷型，不能在基本培养上生长。菌株营养缺陷型，不能
9、在基本培养上生长。A A+B B菌株混合培养菌株混合培养，在完全培养基上，几小时后离心，涂，在完全培养基上，几小时后离心，涂布基本培养布基本培养,长出原养型长出原养型(Met+bio+thr+leu+)(Met+bio+thr+leu+)菌落。菌落。这种原养型细胞如何出现？这种原养型细胞如何出现？转化？转化？细胞间直接接触而发生遗传物质交换和重组细胞间直接接触而发生遗传物质交换和重组?A A、B B菌株分别培养在基本菌株分别培养在基本培养基上培养基上 一边加压和吸引使一边加压和吸引使培养液充分混合培养液充分混合 结果任何一臂的培养基上均未长出原结果任何一臂的培养基上均未长出原养型细菌养型细菌。
10、直接接触直接接触(接合接合)是是原养型细胞出现的必要原养型细胞出现的必要条件。条件。大分子可通过，细大分子可通过，细菌不能通过菌不能通过Hayes(1952)Hayes(1952)试验证明试验证明：接合过程是一种接合过程是一种单向单向转移，转移，A A菌株遗传物质菌株遗传物质 B B菌株，菌株，从供体从供体“donor”“donor”到受体到受体“receptor”“receptor”。F F 因子：因子：致育因子致育因子(性因子性因子)，是一种附加体。，是一种附加体。携带携带F F因子的菌株称为供体菌或雄性，用因子的菌株称为供体菌或雄性，用F F表示。表示。未携带未携带F F因子的菌株为受体
11、菌或雌性，用因子的菌株为受体菌或雌性，用F F表示。表示。5.4.2.25.4.2.2细菌遗传物质的转移是单向的细菌遗传物质的转移是单向的F F 因子的组成：因子的组成：染色体外遗传物质，染色体外遗传物质，环状环状DNADNA；40-6040-60个蛋白质基因；个蛋白质基因；2-42-4个个/细胞细胞(雄性内雄性内)。4.5.2.34.5.2.3F F 因子的三种状态：因子的三种状态：以大肠杆菌为例：以大肠杆菌为例：一个自主状态一个自主状态F F因子，即因子，即F F；带有一个整合的带有一个整合的F F因子的细胞叫高频重组细胞，因子的细胞叫高频重组细胞，HfrHfr细胞。细胞。没有没有F因子，
12、即因子，即F；自主状态时自主状态时F F 因子独立进行分裂。因子独立进行分裂。F FFF：先形成接先形成接合管，合管，F F因子的因子的DNADNA边边转移边复制，转移边复制，F F细胞细胞 F F细胞。细胞。F F因子整合到细菌染色体上因子整合到细菌染色体上(F(F HfrHfr细胞细胞)，其繁殖其繁殖与细菌染色体同步进行与细菌染色体同步进行。此时，细菌基因的此时，细菌基因的重组频重组频率增加率增加4 4倍倍以上，因此染色以上，因此染色体上整合有体上整合有F F因子的菌株，因子的菌株，称为称为HfrHfr菌株菌株。、HfrHfr细胞的形成及染色体的转移细胞的形成及染色体的转移：细菌染色体由一
13、小段单细菌染色体由一小段单链的链的F F因子为前导而转移因子为前导而转移到到F F-受体受体 边进入边边进入边合成。一般情况下仅小合成。一般情况下仅小部分细菌染色体能够转部分细菌染色体能够转入，接合中断入，接合中断 受体受体细胞仍为细胞仍为F F，F F因子仍留因子仍留在供体内。在供体内。部分二倍体中发生交换部分二倍体中发生交换:单数交换单数交换：打开环状染色体，产：打开环状染色体，产生一个线性染色体，这种细胞是生一个线性染色体，这种细胞是不能成活的。不能成活的。偶数交换偶数交换：产生可遗传的重组体：产生可遗传的重组体和片段。和片段。部分二倍体：部分二倍体：当当F F或或HfrHfr的细菌染色
14、体进入的细菌染色体进入F F后，在后，在一个短时期内，一个短时期内，F F细胞内的细胞内的某些位点就会成为二倍体某些位点就会成为二倍体的的DNADNA。4.5.2.5中断杂交作图中断杂交作图中断杂交：中断杂交：就是将两个菌株就是将两个菌株（例如（例如Hfr a+strsF-a-strr）在培养液中进行通风培养，）在培养液中进行通风培养，每隔一定时间取样，把菌液每隔一定时间取样，把菌液放入组织捣碎器里搅拌以中放入组织捣碎器里搅拌以中断杂交，经过稀释接种到鉴断杂交，经过稀释接种到鉴别培养基上，待形成菌落后别培养基上，待形成菌落后鉴定它们的基因型。鉴定它们的基因型。1955年年Wollman和和Ja
15、cob首次进行中断杂交实验：首次进行中断杂交实验：供体菌：供体菌：HfrH strs thr+leu+azis tons lac+gal+受体菌：受体菌：F-strr thr leu-azir tonr lac-gal-将大约将大约10倍的倍的F-菌与菌与 Hfr对数期菌混合，轻轻振荡培养对数期菌混合，轻轻振荡培养在不同时间间隔取样，然后在组织搅拌中剧烈振荡在不同时间间隔取样，然后在组织搅拌中剧烈振荡,中断杂交中断杂交振荡后的培养物涂布于加了链霉素的基本培养基上振荡后的培养物涂布于加了链霉素的基本培养基上筛选不同于两个亲本的筛选不同于两个亲本的thr+leu+strr重组子重组子再对每一个重组
16、子的非选择性标记再对每一个重组子的非选择性标记azi ton lac gal 进行测定。进行测定。azi：叠氮化钠抗性，：叠氮化钠抗性，ton：噬菌体：噬菌体T1抗性抗性n中断杂交实验过程中断杂交实验过程n中断杂交实验结果中断杂交实验结果n（1）不同的非选择标记进入受体且重组的时间不同，但都是稳定的；n（2）各基因的重组频率随着时间的增加而增加，直至极值；n（3）按时间顺序，先重组和后重组的基因，重组率的极值在逐步减少；该方法主要根据基因转移的先后次序，以时间为单位，求基因间的遗传距离。n利用中断杂交实验作图利用中断杂交实验作图 大肠杆菌染色体是环形的大肠杆菌染色体是环形的u不同不同Hfr菌株
17、进行中断杂交实验，菌株进行中断杂交实验，基因转移的顺序、起点和转移方向基因转移的顺序、起点和转移方向各不相同。各不相同。u推断大肠杆菌的染色体为环形，而推断大肠杆菌的染色体为环形，而F因子在细菌染色体上有许多插入位因子在细菌染色体上有许多插入位点，且插入方向不同。点，且插入方向不同。Hfr H o thr azi lac tsx gal trp mal xyl metB thi F C o tsx lac azi thr thi metB xyl mal trp gal F J4 o thi metB xyl mal trp gal tsx lac azi thr F P72 o metB t
18、hi thr azi lac tsx gal trp mal xyl F Trp malGal xyltsx metB lac thi azi thr C P72 H J4细菌染色体为环状细菌染色体为环状 当转移时间间隔在两分钟之内，当转移时间间隔在两分钟之内，如已知如已知lac与与ade紧密连紧密连锁，距离约为锁，距离约为1分钟，中断杂交作图就不可靠，须用传统的分钟，中断杂交作图就不可靠，须用传统的重组作图重组作图(recombination mapping)。紫红色菌落：紫红色菌落：lac+ade+780（亲本型）（亲本型）白色或粉红色菌落：白色或粉红色菌落：lac-ade+220（重组型
19、）（重组型）Hfr:lac+ade+strs X F-:lac-ade-strr 混合混合60min F-：ade+strr 1000 MM+str影印影印EMB五、重组作图五、重组作图 二个基二个基因紧密因紧密连锁连锁:lac-：乳糖不乳糖不发酵发酵 ade-：腺嘌呤腺嘌呤缺陷型缺陷型1、重组子的产生重组子的产生lac-ade+strrlac+ade+strrlac+ade+strs lac-ade-strrlac-ade-strslac+ade+strs lac-ade-strrlac+ade-strs 2、重组频率的计算重组频率的计算1分钟相当于分钟相当于20%重组值，即：重组值，即：1
20、min=20cMRFlac-ade =*100%lac-ade+lac+ade+lac-ade+=*100%=22%=22cM 220 1000 3、大肠杆菌的遗传图谱、大肠杆菌的遗传图谱图距单位：图距单位：分钟分钟总长度：总长度：100分钟分钟起点（起点（0分钟）分钟）：thr座位座位大肠杆菌的环形遗传学图大肠杆菌的环形遗传学图4.5.3细菌的转导和作画细菌的转导和作画n1.定义：以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物定义：以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程，称质重组的过程，称转导。转导。n2.发现发现Lederbery及其研究生及其研究生Zinder（1951）首）首先在鼠伤寒沙门氏菌
21、（先在鼠伤寒沙门氏菌（Salmenellatyphimurium）中发现转导现象。）中发现转导现象。发现过程发现过程他们用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸营养缺陷他们用苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌和甲硫氨酸、组氨酸营养型的鼠伤寒沙门氏菌和甲硫氨酸、组氨酸营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌共同培养，相当让两缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌共同培养，相当让两种不同缺陷型的菌杂交。杂交过程和结果如下：种不同缺陷型的菌杂交。杂交过程和结果如下：LT22phe-try-tyr-LT2met-his-（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）（苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）（甲硫氨酸、组氨酸）（甲硫氨酸、组氨酸）营养缺陷型营养
22、缺陷型营养缺陷型营养缺陷型原养型的菌落（即出现个别正原养型的菌落（即出现个别正常型的细菌）常型的细菌）n那么这些原养型菌落的出现是由接合引起的？那么这些原养型菌落的出现是由接合引起的？还是由转化引起的？还是由转化引起的？他们先进行他们先进行U形管实验形管实验（P159），结果在），结果在LT22一臂获得原养型的菌株，一臂获得原养型的菌株，由此推测可能有一种可通过滤膜的过滤性因子由此推测可能有一种可通过滤膜的过滤性因子（FA）在起作用。进一步利用）在起作用。进一步利用DNA酶处理，结果酶处理，结果FA不受不受DNA酶影响，从而消除了转化作用的可能酶影响，从而消除了转化作用的可能性。最后认为性。最
23、后认为FA是一种噬菌体，发现了转导。是一种噬菌体，发现了转导。n3.转导的机制转导的机制转导是在噬菌体包装中因为错误将细菌染色转导是在噬菌体包装中因为错误将细菌染色体片段包装进去成为内含细菌染色体片段体片段包装进去成为内含细菌染色体片段“假假噬菌体噬菌体”而发生的。具体过程如下：而发生的。具体过程如下：（1）噬菌体侵染细菌。）噬菌体侵染细菌。（2）噬菌体）噬菌体DNA使细菌染色体形成片段，合使细菌染色体形成片段，合成噬菌体成噬菌体DNA和外壳。和外壳。（3）新噬菌体包装，偶尔将细菌染色体片段）新噬菌体包装，偶尔将细菌染色体片段也包装进去成为内含细菌染色体片段也包装进去成为内含细菌染色体片段“假
24、噬菌假噬菌体体”。“假噬菌体假噬菌体”和真噬菌体一起释放出来。和真噬菌体一起释放出来。（4）“假噬菌体假噬菌体”和真噬菌体一样可再侵染细和真噬菌体一样可再侵染细菌，其中菌，其中“假噬菌体假噬菌体”侵染时，就将外来的侵染时，就将外来的细菌基因注入，经过基因重组改变遗传性细菌基因注入，经过基因重组改变遗传性状，完成转导的过程。状，完成转导的过程。目前根据转导的机制，已广泛应用在体目前根据转导的机制，已广泛应用在体外包装外包装“假噬菌体假噬菌体”，即将外源基因导入，即将外源基因导入“假假噬菌体噬菌体”中，再侵染细菌，进行基因表达的中，再侵染细菌，进行基因表达的研究。研究。n1.普遍性转导普遍性转导普
25、遍性转导：指普遍性转导：指P1、P22等可以转导沙等可以转导沙门氏菌染色体组的任何不同的部分。门氏菌染色体组的任何不同的部分。如果两个基因始终是一起转导或同时转如果两个基因始终是一起转导或同时转导（共转导或并发转导）频率较高，那导（共转导或并发转导）频率较高，那么证明两基因连锁，而且频率越高，则么证明两基因连锁，而且频率越高，则两基因距离越近。两基因距离越近。n如：如：a基因和基因和b基因共转导频率高，基因共转导频率高，a和和c共转导频率也高，共转导频率也高，b和和c共转导频率低，共转导频率低，则则3个基因顺序为个基因顺序为bacn若同时观察若同时观察3因子转导分析，则只做一次实验就可因子转导
26、分析，则只做一次实验就可推出其次序。推出其次序。举例：利用普遍性转导测知举例：利用普遍性转导测知leu，thr，azi三个基三个基因顺序。因顺序。方法：方法：（1）用噬菌体）用噬菌体P1侵染带侵染带leu+，thr+和和azi+的大的大肠杆菌。肠杆菌。（2）用从该大肠杆菌释放出来的噬菌体，再侵）用从该大肠杆菌释放出来的噬菌体，再侵染染leu-、thr-和和azi-的大肠杆菌。的大肠杆菌。(3)把受体菌接种到不含把受体菌接种到不含thr的选择培养基上的选择培养基上对对thr+进行选择，凡具进行选择，凡具thr+的细菌都可生长，的细菌都可生长，把此菌接种到其他培养基上，结果在选出把此菌接种到其他培
27、养基上，结果在选出的的thr+重组子只有重组子只有3%leu+，但无一个同时，但无一个同时也是也是azi+。若选择。若选择leu+重组子，则约有重组子，则约有50%同时也是同时也是azi+，因此，因此3基因次序应为基因次序应为thr+leu+azi+。P1652.特异性（局限性）转导特异性（局限性）转导概念：概念：只能转移细菌染色体特定部分基因的转导只能转移细菌染色体特定部分基因的转导.2 2 局限性转导的过程局限性转导的过程 3 3 转导的机制转导的机制:是因为噬菌体在细菌染色体的特定位是因为噬菌体在细菌染色体的特定位 点上整合。点上整合。4 4 低频转导与高频转导低频转导与高频转导 噬菌体
28、噬菌体 感染感染供体菌供体菌裂解液裂解液(转导噬菌体转导噬菌体)非溶源非溶源 (溶源菌溶源菌)(10(10-6-6)性细菌性细菌溶源性转导子溶源性转导子重组性转导子重组性转导子低频转导：低频转导：指指溶源性细菌溶源性细菌经诱导所释放的噬菌体所经诱导所释放的噬菌体所 进行的转导进行的转导.4.6 噬菌体的重组作图噬菌体的重组作图n4.6.1噬菌体的结构和形态噬菌体的结构和形态二二噬菌体噬菌体n1951年 Esther Lederberg 发现K12中有原噬菌体，并命名为。n附加体附加体(episome)n合子诱导合子诱导（zygoticinduction）Hfr（）F 无重组子Hfr F（）有重组子 4.6.2 4.6.2噬菌体的重组作画噬菌体的重组作画n菌苔菌苔（lawn）n噬菌斑噬菌斑（plaque）四、四、T2的环形遗传图的环形遗传图噬菌体的DNA环状排列与末端重复n一、线性DNA具有环状遗传图 末端重复也称末端冗余：是指T4或T2双链DNA分子两端带有相同的碱基序列。环状排列又称致环交换。1）感染初期 2）感染后期环状排列与末端重复的形成