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1、2023年动物双歧杆菌吃什么可以增加akk菌 动物双歧杆菌，分别自trubiotics，分别利用BS固体培育基，液体发酵利用TPY液体培育基 BS培育基100ml 蛋白胨 1g TPY液体培育基 100ml 肝浸粉 0.5g 胰蛋白胨 1g 牛肉膏 0.3g 酵母粉 0.25 酵母粉 0.5g 大豆蛋白冻 0.5g 胰酪蛋白胨 0.8g 吐温80 100ul 可溶性淀粉 0.05 葡萄糖 0.5g 氯化钠 0.1 磷酸氢二钾 0.2g 磷酸氢二钾 0.1 氯化镁 0.05g 磷酸二氢钾 0.1 硫酸锌 0.025g 葡萄糖 1g 氯化钙 0.015 FeSO4.7H2O 0.01 氯化铁 微量
2、 MnSO4 0.005 盐酸半胱氨酸 0.05g L-半胱氨酸 0.05 PH 6.5 琼脂 2g PH 7.0 分别方法： 1、取trubiotics一粒加入9ml灭菌水中，稀释成10-1，按此方法依次稀释到10-7， 从10-7中取100ul稀释液于MRS培育基上涂布匀称。37厌氧培育48h。 2、48h后从平板上挑取单菌落划线分别纯化，37厌氧培育，获得纯的单菌落。 鉴定方法 鉴定方法： 1、显微视察：载玻片中心滴一滴水，用接种环挑取单菌落于载玻片水中，镜检视察，显微镜（400）下菌体短杆状，有的弯曲，或呈v型 2、 革兰氏染色： a) 取菌涂片，涂片要薄而匀称，否则菌体群集往往呈现假
3、阳性。 b) 滴结晶紫液于固定的涂片上，染色约1min,用水冲洗。 c) 用媒染剂碘液冲去残水，并覆盖1min,水洗，吸干。 d) 倾斜载玻片，尽量削减玻片上残留的水分，流滴95%乙醇脱色2030s， 至无紫色，并立即用水缓缓冲洗饿，脱色时间不行过长，以免呈现假阴性。 e) 用番红液复染12mi，使已脱色的细胞重新着色，便于鉴定视察。水洗， 待干，镜检。 f) 镜检（400）视察单独分散的菌体，菌体呈蓝紫色，为革兰氏阳性细菌。 3、液体发酵，提取DNA。 1）配置TPY液体培育基，分装于试管中，每管大约10ml，用接种环挑取单菌落，接种于液体培育基中，37过夜培育。 发酵之后取发酵液300ul
4、加入300ul50%的甘油，保存三管。 2）根据试剂盒操作步骤提取菌体的基因组DNA。 4、利用细菌的16s rDNA的保守区引物（引物:27F 5 AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3；1492R 5 TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3）利用聚合酶链式反应进行PCR，获得所筛菌的16s rDNA。 Taq 酶（5u/ul） 0.125ul 10PCR buffer (含镁离子) 2.5ul Primer1（10uM） 1ul Primer2 （10uM） 1ul dNTP （2.5mM） 2ul 模板 2ul ddH2O 16.5ul 25ul
5、体系 Pcr 扩增程序为： PCR程序：94 4min 94 30s 60 40s 30个循环 72 1.5min 72 10min PCR结束后进行电泳检测:将PCR反应各产物5ul上样于1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。与NCBI核酸数据库进行blast,为所筛得到菌进行归类。 D：动物双歧杆菌 5、经电泳检测合格后，并送交华大基因测序，测序结果经拼接，得到16srDNA序列: GGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCG
6、ATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTA
7、AGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACA
8、CCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCC
9、ATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCAT 与NCBI核酸数据库进行blast,经比对结果为动物双歧乳亚种。 菌种保存：将提取DNA之前保存的菌种贴好标签，于-80冰箱保存。