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1、2023年sds凝胶电泳配胶双向凝胶电泳缺陷胶及其原因 ， 文章编号：（） 生物技术通讯 技术方法 双向凝胶电泳缺陷胶及其缘由 王鸿丽，刘锋，赵永强，李萍，杨松成，魏开华 国家生物医学分析中心，北京摘要 双向凝胶电泳是蛋白质组学探讨中的关键技术之一，涉及较多的试验步骤和试剂，常出现缺陷胶而导致试验失 败。从数千张电泳胶图中选取了张典型的缺陷胶图，对它们进行了归类和总结，分析和探讨了形成缺陷胶的多种缘由，提出了试验改进的方法和留意事项。关键词 双向电泳；缺陷胶；蛋白质组学 中图分类号 文献标识码 ， ， （）， ， RR 蛋白质构型和电荷状态的变更可能会使它们沉淀出来，导致其次向胶上这些蛋白斑点
2、数削减；不同上样方式对蛋白斑点数目有影响。 样品精确定量是双向电泳前的一项重要工作，是保证明验高重复性的重要步骤，以的总蛋白浓度为宜。蛋白提取包括蛋白质溶解、二硫键还原、变性解聚等步骤，溶解度差的蛋白须加入一些增溶剂和表面活性剂等，以增加溶解度，提高蛋白质的提取率。蛋白上样量较大时，杯式上样的图谱斑点数较常规上样方式多。 双向凝胶电泳（，）是蛋白质组学的经典分别方法，它利用蛋白质等电点和相对分子质量的不同而将混合蛋白质分开，具有结果直观、辨别率较高、技术成熟等优点。从图上，我们可获得细胞、组织等生物体中蛋白质的表达谱及差异谱，协作适当的显示技术，还可简便地获得蛋白质的修饰谱。但是，双向电泳操作
3、繁琐、涉及试剂多、缺陷胶（劳动强度大，简单出现一些异样的电泳结果，即“ 或“坏胶（）”。已有很多文献报道了产生缺陷胶的原）” 我们从数千份图谱中归纳出类最常因，但大都特别笼统。 见的缺陷胶，并对其形成缘由进行了分析。 蛋白斑点积累 上样量过大可使相对分子质量和等电点相近的蛋白质斑点 具有代表性的缺陷胶图谱 从近几年的图谱中收集、整理出张具有代表性的缺 部分重叠或积累（图）；胶条上某个区域溶胀不充分或在操作过程中损坏，会导致该区域没有蛋白质聚焦或蛋白质积累（图 ）；样品中盐离子浓度过高，没有达到预期电压，聚焦不够；胶 条选择不合适。 双向电泳样品最佳的盐浓度是左右，最高不宜超过，常用透析除去盐成
4、分，对于稍低浓度的盐可用水浸湿的滤纸作为盐桥。依据样品的实际状况合理选择胶条，窄范围梯度的胶条可以提高辨别率和灵敏度。 某些样品如结核杆菌含有较多的多糖，这些多糖可以与载体两性电解质及蛋白质发生亲和作用，干扰胶上蛋白点的分别并产生条纹（图），提取此类蛋白时建议采纳净化试剂盒进行处理。 收稿日期 作者简介王鸿丽（），女，本科，试验师通讯作者魏开华，（） 陷胶的图谱作为范例进行分析，包括蛋白斑点过少，图谱中出现横、竖条纹，蛋白斑点扭曲等异样现象（图）。 缺陷胶形成的缘由及对策 蛋白斑点过少 蛋白斑点过少是较普遍的现象。样品未精确定量常导致上 样量过低，造成信息缺失（图）；蛋白提取不完全（图）；没有
5、（图）；样品浓度过高使得完全溶解的物质在胶上造成“污染”蛋白质溶解不充分，造成低表达蛋白在胶上不行见（图）；某些膜蛋白和纤维蛋白可溶于样品裂解液，但在等电聚焦过程中 ， 生物技术通讯 图常见的缺陷胶图谱 ：蛋白斑点较少；：蛋白斑点大量丢失；：斑点模糊；：蛋白斑点少于实际斑点；：大部分蛋白斑点积累；：碱性端蛋白大量积累；：部分蛋白斑点分别效果差；：点横向拖尾（一）；：点横向拖尾（二）；：存在大量横条纹；：小部分点有纵向拖尾；：大部分点呈竖条纹状；：出现空白条带；：出现宽空 白条带；：银染色不匀；：有手印和脏乱条纹；：扭曲的点（一）；：扭曲的点（二）；：扭曲的点（三）；：低分子量蛋白流失；： 蛋白
6、点偏上 王鸿丽等：双向凝胶电泳缺陷胶及其缘由 全分开（图）。 出现较多的水平条纹 过低浓度的去污剂、尿素、，低压运行时间过短等会导致 核酸横拖尾（图）；蛋白上样量过大也会导致横拖尾（图）。会阻碍蛋白进入一向胶条并影响蛋白在胶内的迁移；另外，核酸和蛋白质可形成复合物，造成“假斑点”，在二向胶上产生条纹，可利用核酸内切酶去除核酸。选择偏碱性如的胶条，常会出现大量水平条纹（图），此时要求更长的聚焦时间；对于 结语 蛋白质双向电泳分别技术是多步骤、多试剂的实践性很强 的试验技术，受样品制备、浓度测定、上样方式、上样量、试剂配制、试验细微环节、染色方法等多个因素影响。样品制备是双向电泳胜利的关键步骤，其
7、详细方法依据探讨目的不同而略有差异，须要考虑的因素包括：蛋白质的等电点范围、电荷数、相对分子质量；样品的溶解性和疏水性；蛋白质变性和还原；蛋白质相互作用去除；核酸及其他干扰分子去除；高丰度或不相关蛋白质去除等。要防止样品在聚焦时发生蛋白聚集、沉淀和样品制备过程中最大数量的蛋白发生提取后化学修饰，为了得到较好的辨别率、 分别距离和点、少的条纹和弱背景，应考虑到值梯度的宽窄、样品蛋白的困难程度。试验细微环节是另外一个胜利的关键，双向电泳操作人员在试验过程中要严格限制每一步骤，仔细检查每一个试剂，这样才能获得高质量、高重复性的电泳图谱。 胶条，聚焦时间应增加倍；对于胶条，聚焦时间 增加倍。采纳杯式上
8、样时，上样杯位置不正确也可导致该现象出现，建议将上样杯放在与要分别蛋白相反的位置。 出现垂直条纹 上样量过大或某种蛋白的表达量太高会产生纵向拖尾（图 ）；其次向电泳的电极缓冲液的值配制不正确或电极缓冲 液中过少（建议含量为）会引起胶上蛋白点拖尾（图 ）；硝酸银染色时间过长，同时伴有凝胶背景底色过黑。 出现空白垂直条纹 空白垂直条纹通常是指在胶面上看到的空白无蛋白斑点的垂直条纹，约的凝胶有此现象，其缘由为胶条和其次向凝胶之间有气泡（图）或空隙（图）。建议放胶条前将残留的水溶液用滤纸吸干净，并用琼脂糖溶液补充空隙。 参考文献 ，（）：， ，（）： 丁勤学，刘进，胡潇华，等上样方式对蛋白质组双向电泳
9、图谱质量的影响比较中国生物化学与分子生物学报，（）： 背景色不匀称 电极缓冲液存放过程中受到污染（图）；胶条进行二向转 移时，固定胶条的琼脂糖含有杂质或被污染；银染色时用手触摸胶体或重叠染胶，在凝胶上染出手印、划痕或背景显示杂乱等（图）；显色时甲醛浓度过低造成染色时间的延长，使凝胶背景变深显得杂乱。建议电极缓冲液存放于干净的容器内，重复运用不超过次。 蛋白斑点扭曲 其次向凝胶顶端不平造成一向胶条与二向胶接触不好，或 ，：，： ，：，（）： 陈主初，梁宋平肿瘤蛋白质组学长沙：湖南科学技术出版社， 上胶条时为使胶条与胶面紧密接触而过于用力挤压胶条造成凝胶部分出现变形；局部凝胶聚合不完全或聚合过快（图）；聚合过程中凝胶液出现微漏（图）；胶与玻璃之间存有水分或气泡导致蛋白斑点扭曲（图）。 其他 配制（）缓冲液的实际值过高会导致电泳 时间过长，出现低分子量蛋白流失（图），造成试验结果信息的丢失；相反，则电泳时间过短，溴酚蓝已到达终点，而蛋白仍未完 ：