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1、关于重组技术的基本工具讲课第一页，本课件共有50页你还记得我们吗？你还记得我们吗？氢键氢键磷酸二酯键磷酸二酯键DNA聚合酶聚合酶限制性内切酶限制性内切酶DNA连接酶连接酶运载体运载体第二页，本课件共有50页第三页，本课件共有50页专题专题1.基因工程基因工程的基本内容的基本内容 基因工程的概念基因工程的概念1.1 基因工程的基本工具基因工程的基本工具1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 基因工程的发展史基因工程的发展史1.3 基因工程的应用基因工程的应用1.4 蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起第四页，本课件共有50页基因工程的概念：基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进
2、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过行严格的设计，并通过体外体外DNA重组重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在因工程是在DNA分子水平上分子水平上进行设计进行设计和施工的，因此和施工的，因此又叫做又叫做DNA重组技术重组技术或基因拼接技术。或基因拼接技术。第五页，本课件共有50页别名：别名：操作环境：操作环境：原理：原理：操作水平：操作水平：结果：结果：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设基因工程是指按照人们
3、的愿望，进行严格的设计，并通过计，并通过体外体外DNA重组和转基因等技术，赋予重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上分子水平上进行设计和施工的，因此进行设计和施工的，因此又叫做又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。重组技术或基因拼接技术。基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因重组基因重组DNA分子水平分子水平定向定向地改造生物的遗传性状，获得人地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。类所需
4、要的品种。第六页，本课件共有50页基因工程的产物基因工程的产物第七页，本课件共有50页第八页，本课件共有50页这就要用到这就要用到定向改造生物定向改造生物的新技术的新技术基因工程基因工程第九页，本课件共有50页 基因工程的概念基因工程的概念 基因工程的发展史基因工程的发展史（自学了解）（自学了解）第十页，本课件共有50页普通棉花普通棉花抗虫棉抗虫棉第十一页，本课件共有50页基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花普通棉花(无抗虫基因无抗虫基因)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体DNA拼接拼接导入导入棉花细胞棉花细胞(含抗虫基
5、因含抗虫基因)转基因棉花植株转基因棉花植株上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？第十二页，本课件共有50页解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因与棉花抗虫基因与棉花DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”运载体运载体第十三页，本课件共
6、有50页1、简称：简称：2、分布：、分布：一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”主要在主要在原核生物原核生物中中限制酶限制酶寻根问底寻根问底(P4)你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？是什么吗？第十四页，本课件共有50页 原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵的入侵，但，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶限制酶就是细就是细菌的一种菌的一种防御性工具防御性工具，当外源，当外源DNA侵入时
7、，会侵入时，会利用限制酶利用限制酶将外源将外源DNA切割切割掉，以保证自身掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到到切割外源切割外源DNA、使之失效使之失效，从而达到，从而达到保护自身保护自身的目的的目的。限制酶在原核生物中的作用限制酶在原核生物中的作用第十五页，本课件共有50页思考与探究思考与探究 P72、为什么限制酶不剪切细菌本身的、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，含有某种限制酶的通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其细胞，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备不具备这种限制酶这种限制酶的的识别切割序列识别切割序列
8、，或者通过甲基化酶，或者通过甲基化酶将甲基将甲基转移转移到所到所识别序列识别序列的碱基上，使的碱基上，使限制酶不能限制酶不能将其切开将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的酶也不会使自身的DNADNA被切断，并且可以被切断，并且可以防止外源防止外源DNADNA的入侵。的入侵。第十六页，本课件共有50页以中轴线双侧的以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列上碱基呈反向对称，重复排列如：如：GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC限制酶所识别的序列有什么特点第十七页，本课件共有50页EcoR（在G与A之间切割）Sma（在G与C之间切割）Hi
9、nd（在A与A之间切割）GAATTCCTTAAGCCCGGGGGGCCCAAGCTTTTCGAA中轴线中轴线（专一性）（专一性）限制酶的识别特点限制酶的识别特点第十八页，本课件共有50页3、特点、特点:识别特定核苷酸列识别特定核苷酸列,切割特定切点切割特定切点（专一性）（专一性）4.切点：切点：磷酸二酯键磷酸二酯键第十九页，本课件共有50页第二十页，本课件共有50页第二十一页，本课件共有50页EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端GobackGoback第二十二页，本课件共有50页什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个带有几
10、个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，它们之间正好，它们之间正好互补配互补配对对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。第二十三页，本课件共有50页Sma平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端第二十四页，本课件共有50页4、结果：结果：产生黏性未端和平末端产生黏性未端和平末端第二十五页，本课件共有50页以中轴线双侧的以中轴线双侧的DNA上碱基呈上碱基呈反向对称重复排列反向对称重复排列如：如：GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC限制酶所识别的序列有什么特点第二十六页，本课件共有50页3、特点、特点:4、结果：、结果：1、简称：、简称：2、分布：、分布：一、一、限制性核酸内切酶限
11、制性核酸内切酶主要在主要在原核生物原核生物中中限制酶限制酶识别特定核苷酸列识别特定核苷酸列,切割特定切点切割特定切点（专一性）（专一性）产生黏性未端或平末端产生黏性未端或平末端笔记第二十七页，本课件共有50页要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性切几个切口？可产生几个黏性(平平)末端？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性(平平)末端。末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来用同一种限制酶来切割，会怎样呢？切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性相同的黏性(平平)末端末端，然后让两
12、者，然后让两者的黏性的黏性(平平)末端末端黏合黏合起来，就似乎可以合成重组起来，就似乎可以合成重组的的DNA分子了。分子了。思考思考?第二十八页，本课件共有50页GobackGobackGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGCTTAAGCTTAAGEcoRGGGGAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGGGGAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGG不同来源的不同来源的不同来源的不同来源的DNADNA片段混合片段混合片段混合片段混合将不同种来源的将不同种来源的DNA
13、片段连接起来片段连接起来片段连接起来片段连接起来生物生物A基因片段基因片段生物生物生物生物B基因片段基因片段基因片段基因片段GGAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAACTTAACTTAAGGGGGGAATTCAATTCAATTCAATTCCTTAACTTAAGG酶切酶切酶切酶切第二十九页，本课件共有50页1、作用、作用:把把DNA片段片段拼接成新的拼接成新的DNA，2、作用原理：、作用原理：催催化化磷磷酸酸二二酯酯键键形形成成,（不是氢键不是氢键）二、二、DNADNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”第三十页，本课件共有50页 可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝
14、隙“缝合缝合”起来，起来，即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键第三十一页，本课件共有50页T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶第三十二页，本课件共有50页3、类型：、类型：EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T4 4DNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌T T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体只能连接只能连接黏性末端黏性末端能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和 平末端平末端
15、平末端平末端第三十三页，本课件共有50页寻根问底寻根问底(P6)DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶聚合酶是一回事吗是一回事吗?为什么为什么?将将单个核苷酸单个核苷酸连接到连接到已有的核酸片段上，已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键作用作用对象对象DNA复制复制基因重租基因重租4、DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶比较聚合酶比较第三十四页，本课件共有50页3、类型类型Ecoli DNA连接酶连接酶 来源：大肠杆菌来源：大肠杆菌作用特点：只连接作用特点：只连接黏性末端黏性末端 T4DNA连接酶连接酶 来源：来源：T4噬菌
16、体噬菌体作用特点：连接作用特点：连接黏性末端和平末端黏性末端和平末端 2、作用原理：、作用原理：催化催化磷酸二酯键磷酸二酯键形成形成1、作用、作用:：二、二、DNA连接酶连接酶 把把DNA片段片段拼接成新的拼接成新的DNA，笔记第三十五页，本课件共有50页 1、载体必须具备的条件：载体必须具备的条件：能够在宿主细胞中能够在宿主细胞中复制并稳定地保存复制并稳定地保存；具有一至多个具有一至多个限制酶切点限制酶切点，以便与，以便与 外源基因连接外源基因连接具有某些具有某些标记基因标记基因，便于进行筛选。，便于进行筛选。对受体细胞无害对受体细胞无害 三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体
17、 “分子运输车分子运输车”第三十六页，本课件共有50页2、常用的载体：、常用的载体：质粒，质粒，噬菌体的衍生物，噬菌体的衍生物，动植物病毒等动植物病毒等第三十七页，本课件共有50页能能能能复制复制复制复制并带着并带着并带着并带着插入的目的基插入的目的基插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制因一起复制因一起复制有有有有切割位点切割位点有有标记基因标记基因标记基因标记基因3、质粒、质粒本质：小型本质：小型本质：小型本质：小型环状环状DNA分子。分子。分布：许多细菌、分布：许多细菌、酵母菌等生物酵母菌等生物酵母菌等生物酵母菌等生物第三十八页，本课件共有50页三、三、运载体运载体1、质粒：2 2
18、、需要的条件、需要的条件：有1多个限制酶切点能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的 染色体DNA上复制有某些标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。对受体细胞无害3 3、常用运载体、常用运载体：质粒、噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物或某些动植物病毒 笔记第三十九页，本课件共有50页1、在基因工程中，切割运载体和、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的含有目的基因的DNA片段，需使用片段，需使用（）A.同种限制酶同种限制酶B.两种限制酶两种限制酶C.同种连接酶同种连接酶D.两种连接酶两种连接酶反馈练习：反馈练习：第四十页，本课件共有50页2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是、不属于质粒被选为基因
19、运载体的理由是 A、能复制、能复制 （）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD第四十一页，本课件共有50页3 3、下列不适合用于基因工程的运载体、下列不适合用于基因工程的运载体是（是（）A A、质粒、质粒 B B、噬菌体、噬菌体 C C、细菌、细菌 D D、病毒、病毒选我C4、下列说法正确的是、下列说法正确的是：（：（）A、限制酶的切口一定是、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列碱基序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、重组技术所用的工具酶是限制酶、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体
20、连接酶、运载体 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因、利用运载体在宿主细胞内对目的基因 进行大量复制的过程可称为进行大量复制的过程可称为“克隆克隆”选我D审题审题第四十二页，本课件共有50页2和7能连接形成ACGTTGCA；4和8能连接形成GAATTCCTTAAG；3和6能连接形成GCGCCGCG；1和5能连接形成CTGCAGGACGTC。教材教材P7思考与探究思考与探究1第四十三页，本课件共有50页1)基因转移载体的发现基因转移载体的发现2)工具酶的发现工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明技术发明命使基因工程的实施成为可能技术发明命使基因工程的实施成为可能1967年
21、年罗罗思思和和赫赫林林斯斯基基发发现现细细菌菌质质粒粒有有自自我我复复制制能能力力,为为基因转移基因转移找到一种运载工具找到一种运载工具.1970年年阿阿尔尔伯伯(W.Arber)、内内森森斯斯(D,Nathans)、史史密密斯斯(H.C.Smith)细菌中细菌中发现了第一个限制酶发现了第一个限制酶1977年科学家又年科学家又发明了发明了DNA序列分析方法序列分析方法1965年桑格年桑格发明了氨基酸序列分析技术发明了氨基酸序列分析技术第四十七页，本课件共有50页4)DNA体外重组的实现体外重组的实现1972年年伯伯格格(P.Berg)首首先先在在体体外外进进行行了了DNA改改造造的的研研究究,
22、成成功功地地构构建建了了第第一一个人工体外重组个人工体外重组DNA分子分子.第四十八页，本课件共有50页1973年年博博耶耶和和科科恩恩使使重重组组DNA转转入入大大肠肠杆杆菌菌中中,转转录录出出相相应应的的mRNA,并并使使外外源源基基因因可可以以在在原原核核细细胞胞中中成成功功表表达达,至此表明至此表明基因工程正式问世基因工程正式问世.1973年科学家才将质粒作为基因的载体使用年科学家才将质粒作为基因的载体使用这是基因工程发展史上第一个成功的基因克隆实验这是基因工程发展史上第一个成功的基因克隆实验1973年科恩第一个建成年科恩第一个建成“基因工程菌基因工程菌”，并创立，并创立基因工程模式基因工程模式1973年称这年称这“基因工程元年基因工程元年”，科恩被称为基因工程发展史上的创始人科恩被称为基因工程发展史上的创始人科恩并向美国申报了世界上第一个基因工程的专利科恩并向美国申报了世界上第一个基因工程的专利技术技术5)重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功第四十九页，本课件共有50页感谢大家观看第五十页，本课件共有50页