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1、关于酶工程酶的生产和分离纯化第一页，本课件共有53页Contents of chapter 2二、酶的提取与分离纯化技术路线三、细胞破碎四、酶的提取五、酶的分离方法六、酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的生产第二页，本课件共有53页1.对酶源的要求对酶源的要求2.微生物作为酶的优势微生物作为酶的优势3.对酶生产菌的要求对酶生产菌的要求一、酶的生产一、酶的生产动植物、微生物动植物、微生物生物合成生物合成化学合成化学合成第三页，本课件共有53页1.对酶源的要求对酶源的要求1）酶含量丰富）酶含量丰富2）提取、纯化方便）提取、纯化方便一、酶的生产一、酶的生产第四页，本课件共有53页2.微生物作为酶的优势微生物
2、作为酶的优势1）微生物种类多，易得到所需的酶类）微生物种类多，易得到所需的酶类2）可以控制微生物培养条件，易获得高产菌株）可以控制微生物培养条件，易获得高产菌株3）生产成本低）生产成本低4）微生物繁殖快、生长周期短）微生物繁殖快、生长周期短5）生产易管理）生产易管理6）提高微生物产酶能力的途径较多）提高微生物产酶能力的途径较多7）微生物易改造，可提高酶产量或改造酶）微生物易改造，可提高酶产量或改造酶一、酶的生产一、酶的生产第五页，本课件共有53页3.对酶生产菌的要求对酶生产菌的要求1）不是致病菌，也不产毒素）不是致病菌，也不产毒素2）不易变异退化，不易感染噬菌体）不易变异退化，不易感染噬菌体3
3、）产酶量高，而且最好产生胞外酶）产酶量高，而且最好产生胞外酶4）原料廉价，周期短，易培养）原料廉价，周期短，易培养一、酶的生产一、酶的生产第六页，本课件共有53页主要产酶菌：主要产酶菌：大肠杆菌：大肠杆菌：应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内酶。因为其遗传背应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内酶。因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的优良性状的“工程菌工程菌”。也常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱。也常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、门冬氨酸酶、限制性核酸内切酶等。羧酶、门冬氨酸酶、限制性核酸内切酶等。枯
4、草杆菌：枯草杆菌：工业上应用最广泛的产酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖氧化工业上应用最广泛的产酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等的产酶菌。酶、碱性磷酸酯酶等的产酶菌。啤酒酵母：啤酒酵母：工业上广泛应用，主要产转化酶、醇脱氢酶、丙酮工业上广泛应用，主要产转化酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶等。酸脱羧酶等。曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：糖化酶、蛋白酶、果胶酶、氨基酰化酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶等多种酶。葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶等多种酶。第七页，本课件共有53页细胞结构与酶分布细胞结构与酶分布第八页，本课件共有53
5、页细胞破碎细胞破碎酶提取酶提取酶分离纯化酶分离纯化酶浓缩酶浓缩酶贮存酶贮存动物、植物或微生物细胞动物、植物或微生物细胞发酵液发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。取分离，结晶分离等。二、酶的提取与分离纯化技术路线二、酶的提取与分离纯化技术路线第九页，本课件共有53页许多酶存在于细胞内。为许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D
6、超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细细胞胞破破碎碎珠珠高高压压细细胞胞破破碎碎机机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机三、细胞破碎三、细胞破碎第十一页，本课件共有53页机械破碎机械破碎捣碎法捣碎法研磨法研磨法匀浆法匀浆法 物理破碎物理破碎温度差破碎法温度差破碎法压力差破碎法压力差破碎法超声波破碎法超声波破碎法 化学破碎化学破碎有机溶剂：有机溶剂：甲苯、丙酮甲苯、丙酮丁醇、氯仿丁醇、氯仿表面活性剂：表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎酶促破碎自溶法自溶法外加酶制剂法外加酶制剂法通过机械运动产生的通过机械运动产生的剪切力，使组织、细剪切力，使组织、细胞破碎。胞破碎。通过各种物理因素
7、的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞胞膜的作用，而使细胞破碎破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理第十二页，本课件共有53页l酶的提取酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶
8、液中的过程。也称为酶的抽提。的过程。也称为酶的抽提。l酶提取时首先应根据酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。l酶都能溶解于水，通常可酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则
9、可用有机溶剂提取。的非极性基团，则可用有机溶剂提取。四、酶的提取四、酶的提取第十三页，本课件共有53页提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、缩短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。速度，从而增大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、过程中还要注意控制好温度、pHpH值等提取条件。值等提取条件。四、酶的提取四、酶的提取第十四页，本课件共有53页提取方法提取方法使用的溶使用的溶剂剂或溶液或溶液
10、提取提取对对象象盐盐溶液提取溶液提取0.020.020.5mol/L0.5mol/L的的盐盐溶溶液液用于提取在低用于提取在低浓浓度度盐盐溶液中溶解溶液中溶解度度较较大的大的酶酶酸溶液提取酸溶液提取pH2pH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且且稳稳定性定性较较好的好的酶酶碱溶液提取碱溶液提取pH8pH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大用于提取在稀碱溶液中溶解度大且且稳稳定性定性较较好的好的酶酶有机溶有机溶剂剂提提取取可与水混溶的有机溶可与水混溶的有机溶剂剂 用于提取那些与脂用于提取那些与脂质结质结合牢固或合牢固或含有含有较较
11、多非极性基多非极性基团团的的酶酶大多数蛋白类酶都溶于水，而大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为增加，这称为盐溶现象盐溶现象。四、酶的提取四、酶的提取第十五页，本课件共有53页五、酶的分离方法五、酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离GoGoGoGo5、电泳分离Go第十六页，本课件共有53页1 1、沉淀分离、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质
12、分离的技术过程。而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理盐盐析沉淀法析沉淀法利用不同蛋白利用不同蛋白质质在不同的在不同的盐浓盐浓度条件下溶解度条件下溶解度不同的特性，通度不同的特性，通过过在在酶酶液中添加一定液中添加一定浓浓度度的中性的中性盐盐，使，使酶酶或或杂质杂质从溶液中析出沉淀，从溶液中析出沉淀，从而使从而使酶酶与与杂质杂质分离分离等等电电点沉淀法点沉淀法利用两性利用两性电电解解质质在等在等电电点点时时溶解度最低，以溶解度最低，以及不同的两性及不同的两性电电解解质质有不同的等有不同的等电电点点这这一特一特性，通性，通过调节过调节溶液的溶液的p
13、HpH值值，使，使酶酶或或杂质杂质沉淀沉淀析出，从而使析出，从而使酶酶与与杂质杂质分离分离第十七页，本课件共有53页1 1、沉淀分离、沉淀分离沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理分离原理有机溶有机溶剂剂沉淀沉淀法法利用利用酶酶与其它与其它杂质杂质在有机溶在有机溶剂剂中的溶解度不中的溶解度不同，通同，通过过添加一定量的某种有机溶添加一定量的某种有机溶剂剂，使，使酶酶或或杂质杂质沉淀析出，从而使沉淀析出，从而使酶酶与与杂质杂质分离分离复合沉淀法复合沉淀法在在酶酶液中加入某些物液中加入某些物质质，使它与，使它与酶酶形成复合形成复合物而沉淀下来，从而使物而沉淀下来，从而使酶酶与与杂质杂质分离分离选择性变性
14、选择性变性沉淀法沉淀法选择选择一定的条件使一定的条件使酶酶液中存在的某些液中存在的某些杂质变杂质变性沉淀，而不影响所需的性沉淀，而不影响所需的酶酶，从而使，从而使酶酶与与杂杂质质分离分离第十八页，本课件共有53页 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为以硫酸铵最为常用常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫不影响酶的活性，分离效果好，
15、而且价廉易得。然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。在盐浓度达到某一界限在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为度升高而降低，这称为盐析现象盐析现象。盐析盐析第二十页，本课件共有53页影响蛋白质盐析沉淀的因素影响蛋白质盐析沉淀的因素a.蛋白质的浓度蛋白质的浓度:2.5-3.0%b.介质的介质的pH:接近等电点接近等电点 c.温度温度:一般在室温，特殊在一般在室温，特殊在4度度 d.盐类型盐类
16、型:单价盐很差单价盐很差1 1、沉淀分离、沉淀分离盐析盐析第二十一页，本课件共有53页空间排阻学说：空间排阻学说：PEG分子在溶液中形成网状结分子在溶液中形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。1 1、沉淀分离、沉淀分离PEG沉淀沉淀第二十二页，本课件共有53页影响因素影响因素 a.蛋白质的分子质量蛋白质的分子质量大，沉降好大，沉降好 b.蛋白质浓度蛋白质浓度:浓度高，易于沉淀；太高，分段作用减弱浓度高，易于沉淀；太高，分段作用减弱 c.pH值值:接近等电点接近等电点 d.离子
17、强度离子强度:低离子强度影响不大，过高影响分段效果低离子强度影响不大，过高影响分段效果 e.温度温度:030度度 f.PEG聚合度聚合度:越高，用量越少；过高操作不便，多用越高，用量越少；过高操作不便，多用PEG60001 1、沉淀分离、沉淀分离PEG沉淀沉淀第二十三页，本课件共有53页 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出，主要是由于有机溶剂的存在有机溶剂之所以能使酶沉淀析出，主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，会使溶液的介电常数降低。例如，2020时水的介电常数为时水的介电常数为8080，而，而8282乙醇水溶液的介电常数为乙醇水溶液的介电常数为4040。溶液的介电常数降低，就使
18、溶质溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 有机溶剂有机溶剂第二十四页，本课件共有53页等电点沉淀法等电点沉淀法蛋白质在等电点（蛋白质在等电点（I）处，净电荷为）处，净电荷为0，易于沉淀。易于沉淀。热变
19、性沉淀法热变性沉淀法可用其他辅助因子、底物等方法，使目的可用其他辅助因子、底物等方法，使目的酶的热变性温度提高。酶的热变性温度提高。1 1、沉淀分离、沉淀分离第二十五页，本课件共有53页 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗颗粒大小、密度和特性的不同粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。离心方法和离心条件。2 2、离心分离离心分离第二十六页
20、，本课件共有53页低速离心机低速离心机,其最大转速在其最大转速在8000 r/min以内，在酶的分离纯化以内，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。高速离心机高速离心机的最大转速为（的最大转速为（12.5）104 r/min，在酶的分离，在酶的分离中主要用于沉淀细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心中主要用于沉淀细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中过程中,温度升高而造成酶的变性失活温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装
21、设有冷有些高速离心机装设有冷冻装置冻装置,谓之高速冷冻离心机。谓之高速冷冻离心机。超速离心机超速离心机的最大转速达的最大转速达(2.512)104 r/min，超速离心主，超速离心主要用于要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。质量的测定等。2 2、离心分离离心分离第二十七页，本课件共有53页区带离心法区带离心法等密度平衡离心法等密度平衡离心法高速离心法的比较高速离心法的比较第二十八页，本课件共有53页 蛋白质蛋白质分子在离心时，其分
22、子在离心时，其 分子量、分子密度、分子量、分子密度、组成、形状组成、形状等，均会影响其沉降速率，等，均会影响其沉降速率，沉降系数沉降系数 即即用來描述此沉降性质；用來描述此沉降性质；其单位为其单位为 S S(Svedberg unit)(Svedberg unit)。每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。正比。不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法分离。心法分离。2 2、离心分离离心分离第二十九页，本课件共有53页3 3、过滤与膜分离、过滤与膜分离过滤是借助于过滤是借助于过滤介质过滤介质将不同大小、不同形状的物质
23、分离的技术过程。将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。过滤过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质 第三十页，本课件共有53页过滤过滤的分的分类类及其特性及其特性(根据根据过滤过滤介介质质截留的物截留的物质颗质颗粒大小不同粒大小不同)类别类别截留截留颗颗粒大小粒大小截留的主要物
24、截留的主要物质质过滤过滤介介质质粗粗滤滤 2m 2m酵母、霉菌、酵母、霉菌、动动物物细细胞、胞、植物植物细细胞、固形物等胞、固形物等滤纸滤纸、滤滤布、布、纤维纤维多孔陶瓷、多孔陶瓷、烧结烧结金金属等属等微微滤滤0.20.22m2m细细菌、灰菌、灰尘尘等等微微滤滤膜、微孔陶瓷膜、微孔陶瓷超超滤滤2020 0.2m0.2m病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等超超滤滤膜膜反渗透反渗透 20 20 生物小分子、生物小分子、盐盐、离子、离子反渗透膜反渗透膜第三十一页，本课件共有53页膜分离加压膜分离加压膜分离 微滤微滤超滤超滤反渗透反渗透电场膜分离电场膜分离 电渗析电渗析 离子交换膜电渗析离子交换膜电渗
25、析 扩散膜分离扩散膜分离 透析透析第三十二页，本课件共有53页4 4、层析分离、层析分离层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的混合物中各组分的物理化学性质物理化学性质的差别，使各组分以不同的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相称为固定相)，另一个相则流过此固定相，另一个相则流过此固定相(称为流动相称为流动相)并使各组分以不同速度并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。移动，从而达到分离。分子的大小和形状、分分子的大小和形状、分子极性、吸附
26、力、分子子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数亲和力和分配系数第三十三页，本课件共有53页 层层析方法析方法分离依据分离依据离子交离子交换层换层析析利用离子交利用离子交换剂换剂上的可解离基上的可解离基团团（活性基（活性基团团）对对各种离子的各种离子的亲亲和力不同而达到分离和力不同而达到分离目的目的凝胶凝胶过滤层过滤层析析以各种多孔凝胶以各种多孔凝胶为为固定相，利用流固定相，利用流动动相中相中所含各种所含各种组组分的相分的相对对分子分子质质量不同而达到量不同而达到物物质质分离分离亲亲和和层层析析利用生物分子与配基之利用生物分子与配基之间间所具有的所具有的专专一而一而又可逆的又可逆的亲亲和力，使生物
27、分子分离和力，使生物分子分离纯纯化化4 4、层析分离、层析分离第三十四页，本课件共有53页离子交换层析是利用离子交离子交换层析是利用离子交换剂上的换剂上的可解离基团（活性可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离不同而达到分离目的的一目的的一种层析分离方法。种层析分离方法。离子交换层析离子交换层析第三十五页，本课件共有53页按活性基团的性质不同，离按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为子交换剂可以分为阳离子交阳离子交换剂换剂和和阴离子交换剂阴离子交换剂。由于。由于酶分子具有两性性质，所酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也以可用阳离子交换剂，也可用阴
28、离子交换剂进行酶可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。的分离纯化。离子交换剂离子交换剂是含有若干是含有若干活性基团的不溶性高分活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上高分子物质（母体）上引入若干可解离基团引入若干可解离基团（活性基团）而制成。（活性基团）而制成。第三十六页，本课件共有53页凝胶层析又称为凝胶层析又称为凝胶过滤，凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层分子排阻层析，分子筛层析析等。是指以各种多孔凝等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分子质量不同而达到物质分离的一
29、种层析技术。离的一种层析技术。凝胶过滤层析凝胶过滤层析第三十七页，本课件共有53页凝胶层析柱中装有凝胶层析柱中装有多孔凝胶多孔凝胶，当，当含有各种组分的混合溶液流经凝含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使外，这就使小分子物质向下移动小分子物质向下移动的速度比大
30、分子的速度慢，从而的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的层析柱，而达到分离的目的。第三十八页，本课件共有53页常用的凝胶：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 第三十九页，本课件共有53页亲和层析是利用生物分子与配基之亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。而使生物分子分离纯化的技术。亲和层析亲和层析第四十页，本课件共有53页酶与底物酶与
31、底物,酶与竞争性抑制剂酶与竞争性抑制剂,酶与酶与辅助因子辅助因子,抗原与抗体抗原与抗体，RNARNA与与互补的互补的RNARNA分子或片段分子或片段,RNARNA与互与互补的补的DNADNA分子或片段分子或片段等之间等之间，都都是具有专一而又可逆亲和力的生是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此物分子对。故此,亲和层析在酶的亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用分离纯化中有重要应用.亲和层析亲和层析第四十一页，本课件共有53页根据欲分离组分与配基的结合特性根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：亲和层析可以分为：共价亲和层析共价亲和层析疏水层析疏水层析金属离子亲和层析金属离子亲和层析免
32、疫亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析凝集素亲和层析 第四十二页，本课件共有53页5 5、电泳分离、电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为过程称为电泳电泳。第四十三页，本课件共有53页5 5、电泳分离、电泳分离颗粒在电场中的移动速度主颗粒在电场中的移动速度主要决定于其要决定于其本身所带的净电荷本身所带的净电荷量量，同时受，同时受颗粒形状颗粒形状和和颗粒大颗粒大小小的影响。此外，还受到的影响。此外，还受到电电场强度、溶液场强度、溶液pH值、离子强值、离子强度及支持体的特性度及支持体的特性等外界
33、条件等外界条件的影响。的影响。第四十四页，本课件共有53页5 5、电泳分离、电泳分离聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦等电聚焦 第四十五页，本课件共有53页SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）加入加入1%2%的的SDS制备而成。制备而成。SDSPAGE主要用于测定主要用于测定蛋白质的分子质量蛋白质的分子质量。基本原理：基本原理：SDS蛋白质复合物中蛋白质复合物中SDS含有大量阴离子，从而含有大量阴离子，从而掩盖掩盖了了蛋白质之间原来的电荷的蛋白质之间原来的电荷的差异差异；而且蛋白质构象发生改变变；而且蛋白质构象发生改变变成成椭圆形椭圆形，短轴为，短轴为18埃
34、左右，埃左右，长轴与蛋白质分子质量成正比长轴与蛋白质分子质量成正比 SDS蛋白质复合物的蛋白质复合物的迁移率迁移率不再受其原在电荷和不再受其原在电荷和分子形状的影响，而只决定于分子形状的影响，而只决定于蛋白质的分子质量蛋白质的分子质量。第四十六页，本课件共有53页第四十七页，本课件共有53页第四十八页，本课件共有53页第四十九页，本课件共有53页六、酶的浓缩、干燥与结晶六、酶的浓缩、干燥与结晶浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层
35、析分离等都能起到离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。吸去水分，也可以达到浓缩效果。蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在即在一定的真空条件下，使酶液在6060以
36、下进行浓缩。以下进行浓缩。第五十页，本课件共有53页在固体酶制剂的生产过程中，在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：进行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥真空干燥冷冻干燥冷冻干燥喷雾干燥喷雾干燥气流干燥气流干燥吸附干燥吸附干燥六、酶的浓缩、干燥与结晶六、酶的浓缩、干燥与结晶第五十一页，本课件共有53页结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。六、酶的浓缩、干燥与结晶六、酶的浓缩、干燥与结晶第五十二页，本课件共有53页感谢大家观看第五十三页，本课件共有53页