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1、关于重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定第一页，本课件共有39页重组体分子的选择与鉴定方法重组体分子的选择与鉴定方法我们把外源基因导入受体细胞的目的是获得带有目的基因目的是获得带有目的基因 阳性重组体阳性重组体，因而重组体的筛选是体外重组技术的一个重要环节。涂布菌液，观察平板是无法判断重组子是否是我们所需的。因此，我们需要进一步进行筛选。常用的筛选方法常用的筛选方法概括起来有两大类：直接筛选法；间接筛选法。第二页，本课件共有39页直接筛选法直接筛选法直接筛选法是借助遗传学表型遗传学表型来进行筛选的方法。重组子转化宿主细胞后，载体上的一些筛选标志基因表标志基因表 达达，会导致宿主的某些表型的改变，通
2、过琼脂平板中添加相应筛选物质，可以直接筛选含重组子的菌落。如果质粒上有两种抗性，因为外源基因的插入，导致其中一个不能其中一个不能 表达表达，那么也可以通过抗药性将重组子筛选出来。第三页，本课件共有39页间接筛选法间接筛选法间接筛选法是检测重组体克隆中是否含有目的基因的核苷酸序列或是否产生目的基因所编码的产物。一般来说，先用直接筛选法进行初步筛选后，再用间接检测法进行鉴定，直至获得我们所需要的阳性重组体。第四页，本课件共有39页DNA水平RNA水平蛋白质水平遗传表型直接筛选法遗传表型直接筛选法核酸分子杂交法核酸分子杂交法PCR法法DNA序列分析法直接凝胶电泳法直接凝胶电泳法酶切片段分析法酶切片段
3、分析法重组子筛选检测特定外源基因是否转录及转录的强度（Northern杂交印迹法)免疫化学检测法（放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法）Westhern印迹杂交法重组子筛选的方法第五页，本课件共有39页重点介绍的筛选方法重点介绍的筛选方法间接选择法抗药性筛选互补快速裂解菌落鉴定分子大小限制性内切酶酶切法PCR方法筛选鉴定重组子遗传表型直接选择法菌落杂交筛选第六页，本课件共有39页遗传学表型筛选的方法之一遗传学表型筛选的方法之一抗药性筛选抗药性筛选基本原理抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。因为质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因抗药性选择标记基因，与目的基因重组后，转入受体菌，
4、能使受体菌带有相应抗药性，另一种情况是虽然质粒中原来有相应抗性，但插入外源片段后重组质粒失去抗药性，据此我们也可以进行抗药性筛选。第七页，本课件共有39页常用的抗药性选择标记第八页，本课件共有39页A 如果外源基因片段外源基因片段插入载体的位点在抗药性基之外在抗药性基之外，不导致抗药性基因的失活，仍能编码抗药性基因产物仍能编码抗药性基因产物。含有这种重组子的转化细胞可以在含有相应抗生素的琼 脂平板上生长成菌落，未能接受载体DNA的细胞因不能 生长而被排除。b：如果外源基因片段外源基因片段插入载体的位点在抗药性基因中中 间间，导致抗药性基因失活抗药性基因失活，这个抗药性标志就会失活。检测外源DN
5、A插入作用的一种通用的方法是插人失活插人失活 效应效应。第九页，本课件共有39页第十页，本课件共有39页a类筛选基本原理抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。因为重组质粒DNA携带有特定的抗药性选择标记基因抗药性选择标记基因，转化受体菌后能使后者在含有相应选择药物的选择培养基上生长，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活。第十一页，本课件共有39页a类筛选的实验方法LB固体培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板；将转化后的菌液均匀涂布在平板上；放在37培养箱培养1216小时；观察菌落生长情况。第十二页，本课件共有39页抗药性标记法示意图第十三页，本课件共有39页b类插入失活
6、筛选从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后,使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活(insertionalinactivation)。插入失活法是从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子（筛选）的主要方法。第十四页，本课件共有39页 例如：例如：非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的,表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长双抗性平板上生长。但是,如果在该质粒的氨苄青霉素抗性基因内插入外源片段外源片段,就会造成氨苄青霉素抗性基因失活氨苄青霉素抗性基因失活,
7、变成ApsTcr,携带这种质粒的宿主菌可以在四环素的平板上生长在四环素的平板上生长,而不能在氨苄不能在氨苄 青霉素抗性平板上生长青霉素抗性平板上生长。第十五页，本课件共有39页B类插入失活筛选步骤第十六页，本课件共有39页注意事项：（1）以Amp、Tc等抗生素作为选择药物，37培养时间约1216h，超过时间视为杂菌（假转化子菌落）。（2）挑选单菌落作为转化子以便进一步实验验证。挑的菌落在LB培养基中震荡培养。第十七页，本课件共有39页遗传学表型筛选的方法二互补基本原理：这种筛选方法适用于含含b-b-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因的载体。载体在 -半乳糖苷酶的-肽编码区具有多克隆区域。重组质粒中
8、的插入片段使a-a-肽失活肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴 别。不带有插入片段的载体表达有活力的-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉在染色体或附加体上缺失掉LacZM15LacZM15基因基因，导致内源-肽失活。载体或其他含LacZ基因的-肽互补 细菌，具有-半乳糖苷酶的w片段。第十八页，本课件共有39页 所得到的活力-半乳糖苷酶（-肽加w片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体多克隆 区域，克隆上插入片段导致插入片段导致a-a-肽编码区的破坏肽编码区的破坏，使-半乳 糖苷酶失活，得到白色菌落。-肽编码区读码框内小的 插入片段产生浅蓝色菌落，因-半乳糖苷
9、酶只是部分失活。通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。这样一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。第十九页，本课件共有39页蓝白斑筛选X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)，IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)X-gal被没分解后的产物为5-溴-4-氯-靛蓝第二十页，本课件共有39页无质粒的无质粒的 受体菌受体菌质粒转化质粒转化的受体菌的受体菌带外源带外源DNADNA插插入的质粒转入的质粒转化的受体菌化的受体菌-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；
10、无抗菌素抗性无菌斑无菌斑生长生长-半乳糖苷酶的缺失被载体产物互补，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有蓝有蓝色菌色菌斑生斑生长长载体产物失活，不能互补-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培养基上培养有白有白色菌色菌斑生斑生长长不能正常生长第二十一页，本课件共有39页实验中的蓝白斑筛选蓝白斑筛选第二十二页，本课件共有39页注意事项：（1）菌液涂布量为90mm平皿50100 l;（2）由于被转化的基因产物作用于X-gal需要较长时间，因此，观察和确定转化子菌落的培养时间可适当延长。与37温箱取出后放4冰箱几小时后观察效果更好；（3
11、）为了防止假阳性需挑菌进一步验证；（4）宿主菌的-半乳糖苷酶的-肽编码区应在染色体或附加体上缺失。第二十三页，本课件共有39页依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一快速裂解菌落鉴定分子大小快速裂解菌落鉴定分子大小基本原理：由于外源片段插入的重组质粒与载体大小不同，我们可以利用琼脂糖凝胶电泳将重组体分离出来。利用此种方法就需要将用裂解液将菌体悬浮，保温15min30min，再12000rmp离心10min,上清中既含我们所需获得质粒。第二十四页，本课件共有39页此方法直观快捷，适用于插入片段较大的重组子的筛选。电泳法能筛选出有插入片段的阳性重组体，但不能鉴别插入
12、 片段大小相近的非目的基因片段。第二十五页，本课件共有39页依赖于重组子结构特征分析的筛选方法二依赖于重组子结构特征分析的筛选方法二限制性内切酶酶切方法鉴定重组子限制性内切酶酶切方法鉴定重组子基本原理：根据已知的外源DNA序列的限制酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA的带数和长度）。或用合适的内切酶酶切插入片段，再用其它酶酶切这个片段，电泳后比较电泳结果是否符合预计的结果。第二十六页，本课件共有39页第二十七页，本课件共有39页电泳后的图谱挑三个菌落鉴定，图显示的是三个菌落中的质粒双酶切的结果第二十八页，本课件共有39页依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三依赖于重组子
13、结构特征分析的筛选方法三PCR方法筛选鉴定重组子方法筛选鉴定重组子基本原理：在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。第二十九页，本课件共有39页注意事项：如需检测插入片段及其方向，使用载体特异引物和方向插入特异引物或互换。如只需确认是否存在插入片段，可用2个插入片段特异引物。扩增反应前在94变性两分钟，有利于细菌的裂解，提高PCR产物扩增的成功。第三十页，本课件共有39页1 主要原理主要原理用体外标记目的基因DNA或相应的RNA为探针同转化后的菌落进行
14、原位杂交原位杂交，筛选含重组DNA的克隆。这个方法可以快速地从数百个菌落中挑选出含有重组DNA的克隆。该方法的优点是通用性比较强优点是通用性比较强，可以用来检测任何一种插入的DNA序列。这种方法依据的是核酸分子杂交的原理核酸分子杂交的原理，而不以插入的DNA序列能否实现基因表达为前提，因此，只要有可利用的标记探针就可检测出重组质粒DNA。重组质粒重组质粒DNA的菌落杂交筛选的菌落杂交筛选第三十一页，本课件共有39页方法：1硝酸纤维素膜的准备硝酸纤维素膜的准备：将硝酸纤维素膜剪成直径为8cm的圆形，放人一个干净的平皿内，高压灭菌，待用。2将无菌的作有标记的硝酸纤维素膜铺在含有相应抗生素铺在含有相
15、应抗生素 的琼脂糖培养基平皿上的琼脂糖培养基平皿上，用无菌的L型玻璃棒去除膜与培养基间的气泡，约12min，培养基即可将滤膜浸湿。3用无菌牙签将转化平皿中选择的菌落接种到滤膜上菌落接种到滤膜上，同时接种到另一含有相应抗生素的琼脂糖平皿的对应位置，并作为标记菌落参照。每个90mm的平皿上大约可接种100个菌落。第三十二页，本课件共有39页4将平皿置于37培养23h，菌落长到1mm时，把滤把滤 膜转移到另一块含有氯霉素（膜转移到另一块含有氯霉素（170ugml）的琼脂糖平皿）的琼脂糖平皿 上上，菌落面向上，37培养1520h，扩增质粒。另一个菌落对照平皿37培养过夜后，密封，4保存。5把滤膜从平皿
16、中取出，菌落面朝上，置于有一薄层变性置于有一薄层变性 液的塑料膜上液的塑料膜上，变性处理10min，然后用干滤纸吸干变性液；再将菌落面朝上置于有一薄层中和溶液的塑料膜上有一薄层中和溶液的塑料膜上，中和两次，每次15min。室温晾干后，再置于80真空干燥12h。第三十三页，本课件共有39页6杂交：把滤膜浸入预杂交液滤膜浸入预杂交液中，在60下放置6h；把同同 位素标记的位素标记的DNA探针探针于100变性后加入杂交溶液中，然后放入滤膜，60杂交1624h。探针的用量一般为105106cpm/ml。用2SSC洗脱3次，每次30min。7放射自显影放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保鲜膜
17、中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上作好标记，置于70冰箱暴光4872h。8洗片：在暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂交结果。第三十四页，本课件共有39页注意事项注意事项：(1)菌落杂交与DNA的吸印转膜杂交与斑点杂交不同，后者一般只有DNA，而菌落杂交时，许多菌体成分与DNA一起形成斑点，即使经过固定步骤之后，DNA与膜的结合很不牢固。因此，菌落杂交菌落杂交与纯核酸的杂交最适温度最适温度不同，一般温度略低略低一些可防止DNA从膜上脱落。(2)为防止防止滤膜上菌落脱落或移位落脱落或移位，可采用抽吸方法进行采用抽吸方法进行 DNA变性变性：即将滤膜菌落面向上，置于4层用变性液浸透
18、的Whatman3MM滤纸上，放置5min，然后把滤液放到一第三十五页，本课件共有39页合适的抽滤器上，用水泵或负压抽至菌落接近于干燥（l2min）。然后用120ml中和液分4次抽过滤膜，室温干燥后，80真空干燥2h。(3)硝酸纤维素膜经过碱溶液处理后容易变脆。因此，随后的杂交和压X线片时，操作必须小心，以免膜破碎操作必须小心，以免膜破碎。转录与扩增的敏感性可检出1ngRNA中的特异基因。第三十六页，本课件共有39页总结总结重组子的筛选往往需要几种方法综合起来，仅用一种方法可能不能很好的筛选出我们所需的重组体。一般先用直接筛选法初步筛选，再用间接法筛选进一步筛选。例如：实验中常先利用抗药性进行初步筛选，再进行电泳检测，最后甚至会去测序，确定重组子已插入。第三十七页，本课件共有39页第三十八页，本课件共有39页感谢大家观看第三十九页，本课件共有39页