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1、实验六实验六（设计性实验）（设计性实验）一、一、配制培养基配制培养基二、无菌操作二、无菌操作三、无菌培养三、无菌培养四、观察记录四、观察记录 上交实验报告时间：上交实验报告时间：第第15周周 实验安排实验安排实验安排实验安排本周六下午本周六下午2：30；3：30。本周（第九周）本周（第九周）（11.511.9）第第11、12、13、14周周每周进行观察每周进行观察（11.1912.14）（1）深刻理解植物组织培养的基本）深刻理解植物组织培养的基本概念概念和和理论依据理论依据。（2）训练利用实验室的条件来合理）训练利用实验室的条件来合理设计设计和和完成完成实验的基本技能。实验的基本技能。实验目的
2、实验目的实验目的实验目的 植物组织培养就是将植物组织培养就是将植物离体的生活部分植物离体的生活部分（如（如器官、组织、细胞甚至原生质体等）通过器官、组织、细胞甚至原生质体等）通过无菌操作无菌操作接种在适宜的培养基上接种在适宜的培养基上，在人工控制的条件（如温，在人工控制的条件（如温度、光照、湿度等）下进行培养的技术。度、光照、湿度等）下进行培养的技术。理论依据理论依据：植物细胞的全能性。：植物细胞的全能性。植物体的每一个细胞都携带着一套完整的基因植物体的每一个细胞都携带着一套完整的基因组，并具有发育成完整植株的潜在能力。组，并具有发育成完整植株的潜在能力。实验原理实验原理实验原理实验原理完整植
3、株完整植株脱分化脱分化再分化再分化外植体外植体愈伤组织愈伤组织芽、根芽、根实验设计的依据实验设计的依据实验设计的依据实验设计的依据依据一依据一分化分化植植植植 物物物物 组组组组 织织织织 培培培培 养养养养 的的的的 过过过过 程程程程接种接种脱分化脱分化再分化再分化愈伤组织愈伤组织外植体外植体再分化再分化冲洗冲洗表面消毒表面消毒 培养基中培养基中植物生长物质的种类和浓度植物生长物质的种类和浓度在脱分化在脱分化和再分化中起重要作用，尤其是和再分化中起重要作用，尤其是生长素和细胞分裂生长素和细胞分裂素类的比例素类的比例。实验设计的依据实验设计的依据实验设计的依据实验设计的依据依据二依据二生长素
4、类生长素类/细胞分裂素类细胞分裂素类高高 诱导根的分化诱导根的分化中中 愈伤组织生长不分化愈伤组织生长不分化低低 诱导芽的分化诱导芽的分化MS培养基的大量元素；培养基的大量元素；MS培养基的微量元素；培养基的微量元素；MS培养基的铁盐；培养基的铁盐；有机附加成分；有机附加成分；2,4-D、NAA、6-BA；蔗糖、蔗糖、冷凝脂冷凝脂；0.1mol/LNaOH和和0.1mol/LHCl。条件一：条件一：实验药品实验药品实验条件实验条件实验条件实验条件条件二：条件二：实验仪器及设备实验仪器及设备 烧杯、移液器、量筒烧杯、移液器、量筒、精密电子天平、精密电子天平、三角瓶三角瓶、pH试纸、封口膜等；试纸
5、、封口膜等；高压灭菌锅；高压灭菌锅；无菌操作间、超净工作台；无菌操作间、超净工作台；能够控制光照和温度条件的培养室。能够控制光照和温度条件的培养室。实验条件实验条件实验条件实验条件要求要求 1.1.以菊花无菌苗为材料进行以下以菊花无菌苗为材料进行以下以菊花无菌苗为材料进行以下以菊花无菌苗为材料进行以下培养基培养基培养基培养基的的的的设计。设计。设计。设计。（1 1）诱导菊花无菌苗叶片形成愈伤组织诱导菊花无菌苗叶片形成愈伤组织（2 2）诱导菊花无菌苗茎段形成苗诱导菊花无菌苗茎段形成苗实验设计实验设计实验设计实验设计菊花无菌苗菊花无菌苗菊花无菌苗菊花无菌苗实验材料实验材料具体做法具体做法全班分成小
6、组，根据全班分成小组，根据设计要求设计要求结合结合实验原理、实验原理、设计依据及设计依据及已提供的已提供的实验条件，在实验条件，在查阅资料的基础查阅资料的基础上上，合理设计实验（主要对培养基进行设计）。，合理设计实验（主要对培养基进行设计）。设计出初步方案后，每组推选一名代表向全班设计出初步方案后，每组推选一名代表向全班汇报设计的汇报设计的原理原理、方案方案和和预期的结果预期的结果；再经全班讨；再经全班讨论确定最后的设计方案。论确定最后的设计方案。全班分成全班分成6个小组，按照要求经个小组，按照要求经查阅资料、代表汇报和全班查阅资料、代表汇报和全班讨论讨论，最后确定，最后确定设计的培养基如下设
7、计的培养基如下（MS为基本培养基）：为基本培养基）：1.1.诱导菊花无菌苗叶片形成愈伤组织诱导菊花无菌苗叶片形成愈伤组织（1）MS+6-BA 1+NAA 0（1组，组，7人人）（2）MS+6-BA 1+NAA 2（2组，组，7人）人）（3）MS+6-BA 1+NAA 4（3组，组，7人）人）2.2.诱导菊花无菌苗茎段形成芽诱导菊花无菌苗茎段形成芽（4）MS+6-BA 0 +NAA 0.2 （4组，组，7人）人）（5）MS+6-BA 0.2+NAA 0.2 （5组，组，7人）人）（6）MS+6-BA 2 +NAA 0.2 （6组，组，7人）人）根据设计的培养基，利用提供的实验条件，我们将按照下根
8、据设计的培养基，利用提供的实验条件，我们将按照下列步骤完成实验。列步骤完成实验。一、一、配制培养基配制培养基二、无菌操作二、无菌操作三、无菌培养三、无菌培养四、观察记录四、观察记录 实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤一、配制培养基一、配制培养基 1.配制母液配制母液实验步骤实验步骤实验步骤实验步骤MS培养基的大量元素母液（培养基的大量元素母液（20）；）；MS培养基的微量元素母液（培养基的微量元素母液（100）；）；有机附加成分母液（有机附加成分母液（100）；）；肌醇母液（肌醇母液（100）；）；MS培养基的铁盐母液（培养基的铁盐母液（200）；）；6-BA、2,4-D、NAA母液母液(0.5
9、mg/mL)。2.配制培养基配制培养基 各个小组根据自己的设计方案进行。各个小组根据自己的设计方案进行。要求：要求：每一种培养基每一种培养基400mL，分装，分装10瓶，每瓶瓶，每瓶40mL，每瓶做好标记，如：，每瓶做好标记，如：1，2，。（1）加溶液。加溶液。顺序顺序为为：大量元素：大量元素微量元素微量元素附附加成分加成分肌醇肌醇铁盐铁盐植物生长调节剂植物生长调节剂蔗糖蔗糖冷凝脂冷凝脂 （2）搅拌混匀）搅拌混匀;（3）定容至）定容至400mL；（4）调）调pH值至值至5.86.2；（5）分装、封口。）分装、封口。3.培养基灭菌培养基灭菌高压灭菌高压灭菌(压力压力1.1 kg/cm2,121,
10、20min)。湿热灭菌湿热灭菌各物质加入量：各物质加入量：400mL大量元素母液（大量元素母液（10）100mL/L-40 mL;微量元素母液（微量元素母液（100）10mL/L-4 mL；有机附加成分母液（有机附加成分母液（100）10mL/L-4 mL；蔗糖蔗糖(30g/L)、冷凝脂、冷凝脂(6g/L)12g、2.4g;肌醇母液（肌醇母液（100）10mL/L-4 mL；铁盐母液（铁盐母液（200）5mL/L-2 mL；6-BA、2,4-D、NAA母液母液(0.5mg/mL)编编号号培养基组成（培养基组成（mg/L）各物质加入量各物质加入量（mL/400mL）6-BA NAA1 MS+6-
11、BA 1+NAA 00.802 MS+6-BA 1+NAA 20.81.63 MS+6-BA 1+NAA 40.83.24 MS+6-BA 0+NAA 0.200.165 MS+6-BA 0.2+NAA 0.20.160.166 MS+6-BA 2+NAA 0.21.60.16表表培养基中植物生长调节剂加入量培养基中植物生长调节剂加入量二、无菌操作二、无菌操作 1.接种前的准备接种前的准备 （1）空间灭菌空间灭菌(30min)。无菌操作间和超净工作台。无菌操作间和超净工作台。开紫外灯开紫外灯开鼓风机开鼓风机关紫外灯关紫外灯10min后后开日光灯。开日光灯。（2）操作人员的准备操作人员的准备 剪
12、指甲剪指甲用肥皂彻底洗手用肥皂彻底洗手35次次自然风干自然风干进操作间进操作间用用7075%酒精反复檫酒精反复檫手手(图图)。（3）器具灭菌器具灭菌 实验器械的消毒灭菌（图）。实验器械的消毒灭菌（图）。2.接种接种 （1）切取材料切取材料 左手持镊，右手持刀左手持镊，右手持刀切取材料切取材料叶片：叶片：0.5cm0.5cm，茎段带一个腋芽。，茎段带一个腋芽。（2）接种接种 取三角瓶取三角瓶打开封口膜打开封口膜接种接种叶块：正接，每瓶叶块：正接，每瓶3块块茎段：形态学下端插入培养基，每瓶茎段：形态学下端插入培养基，每瓶3个个 （3）重新封口重新封口 （4）做标记做标记 班级，日期班级，日期 三、
13、无菌培养三、无菌培养 将接种好的三角瓶置于培养室进行培养。将接种好的三角瓶置于培养室进行培养。培养条件：光培养条件：光/暗暗=14 h/10 h；T=25；RH(relative humitidy)=70 80%四、观察记录四、观察记录 在培养过程中，每周定时观察记录实验结果在培养过程中，每周定时观察记录实验结果1次。次。内容：内容：（1）污染率）污染率 污染率污染率(%)=(污染的瓶数污染的瓶数/接种瓶数接种瓶数)100%（2）愈伤组织形成的时间、部位、颜色、大小、形状，计算）愈伤组织形成的时间、部位、颜色、大小、形状，计算出愈率。出愈率。出愈率出愈率(%)=(产生愈伤组织的叶块数产生愈伤组
14、织的叶块数/接种的接种的叶块叶块数数)100%（3）芽形成的时间、芽数、叶数、丛生芽数，计算出芽率。）芽形成的时间、芽数、叶数、丛生芽数，计算出芽率。出芽率出芽率(%)=(出芽的茎段数出芽的茎段数/接种的接种的茎段茎段数数)100%（1）比较不同的培养基对愈伤组织形成的影响；）比较不同的培养基对愈伤组织形成的影响；（2）比较不同的培养基对芽形成的影响。）比较不同的培养基对芽形成的影响。结果分析与讨论结果分析与讨论结果分析与讨论结果分析与讨论你认为组织培养获得成功的关键因素你认为组织培养获得成功的关键因素 有哪些？有哪些？本次实验历时本次实验历时6周，在此过程中大家经周，在此过程中大家经历了大量
15、查阅资料，精心设计方案，认真动历了大量查阅资料，精心设计方案，认真动手操作，仔细观察记录，全面总结分析等各手操作，仔细观察记录，全面总结分析等各个环节。个环节。通过该过程，培养了科学态度和团队合通过该过程，培养了科学态度和团队合作精神，提高了设计实验、实际动手操作和作精神，提高了设计实验、实际动手操作和分析解决问题的能力。分析解决问题的能力。因此，本实验达到了预期的目的。因此，本实验达到了预期的目的。总结总结序序号号培养基培养基接种数接种数/个个污染率污染率/%愈伤组织愈伤组织诱导率诱导率/%苗诱导苗诱导率率/%愈伤组织或苗的愈伤组织或苗的生长情况生长情况123456 植物生长调节剂对菊花愈伤组织及苗诱导的影响（植物生长调节剂对菊花愈伤组织及苗诱导的影响（d）