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1、氨基酸发酵的工艺控制培养基pH温度氧培养基培养基1、碳源：、碳源：淀粉水解糖、糖蜜淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烃 碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的发酵操作决定碳源种类2、氮源：、氮源：铵盐、尿素、氨水、尿素、氨水同时调整pH值。营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加有机氮源水解液。需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。可分批流加。氨水用pH自动控制连续流加3、合适、合适C/N氮源用于氮源用于调整整pH。合成菌体。合成菌体。生成氨基酸，因此比一般微生物生成氨基酸，因此比一般微生物发酵酵的的C/N低。低。4、磷
2、酸、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时糖代谢受抑制。5、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。6、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。7、钠：调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入。8、锰：是许多酶的激活剂。9、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进谷氨酸产生菌的生长。10、铜离子：离子：对氨基酸发酵有明显毒害作用。11 生生长因子：生物素因子：生物素 作用：影响细胞膜透性膜透性和代代谢途径途径。浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。过少菌体生长缓慢，发酵周期长。与其它培养条件的关系：氧供给不足，生
3、物素过量时，转化俄为乳酸发酵。种类：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜为来源。pH对氨基酸发酵的影响及其控制作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。控制pH方法：流加尿素和氨水流加方式：根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。控制：控制：（1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免pH过高（2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。（3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。（4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。温度温度对氨基酸氨基酸发酵的影响及其控制酵的影响及其控制菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生菌体生长最
4、适温度和氨基酸合成的最最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同适温度是不同的。菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高，糖耗慢，周期长，酸产量低。采取措施：少量多次流加尿素，维持最适生长温度，减少风量等，促进菌体生长。氧氧对氨基酸氨基酸发酵的影响及其控制酵的影响及其控制要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生酵：生物合成与物合成与TCA循循环有关。有关。适宜在缺氧条件下适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨行的亮氨酸、苯丙氨酸和酸和缬氨酸氨酸发酵：菌体呼吸受阻酵：菌体呼吸受阻时产量最量最大。大。供氧不足供氧不足时产酸受酸受轻微影响的天冬氨酸族微影响的天冬氨酸族氨基酸氨基酸发酵酵
5、发酵工酵工艺实例介例介绍谷氨酸谷氨酸 一、概述一、概述l l工工业业化生化生产产开始于由水解小麦开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白面筋或大豆蛋白面筋或大豆蛋白面筋或大豆蛋白质质而制而制取。取。l l19571957年年年年，日本率先采用，日本率先采用微生物微生物微生物微生物发发酵法酵法酵法酵法生生产产，并投入大，并投入大规规模工模工业业化生化生产产，这这是被誉是被誉为现为现代代发发酵工酵工业业的重大的重大创创举举，使，使发发酵工酵工业进业进入入调节调节代代谢谢的的调调控控阶阶段。段。l l目前世界目前世界产产谷氨酸谷氨酸钠钠210210吨吨吨吨/年，占氨基酸年，占氨基酸年，占氨基酸年，占氨基酸总总
6、量的量的量的量的2/32/3。l l我国我国现现有有5050余家生余家生产产，年，年产产量达量达160160万吨万吨万吨，居世界万吨，居世界首位。首位。二、谷氨酸的生物合成机理二、谷氨酸的生物合成机理 1.1.谷氨酸谷氨酸（-氨基戊二酸）氨基戊二酸）O C-OH 第一代第一代鲜味味剂 H2N-C-H L-L-谷氨酸谷氨酸单钠盐味精味精 H-C-H H-C-H H-C O OH L-型谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸脱氢酶脱氢酶脱氢酶脱氢酶NH4抑抑 制制2.2.谷氨酸的生物合成谷氨酸的生物合成（1）EMP:丙丙酮酸，酸，ATP,NADH2（2）HMP:6磷酸果糖磷酸果糖 3磷酸甘油磷酸甘油醛 NADP
7、H2:酮戊二酸戊二酸还原氨基化必需的供原氨基化必需的供氢体。体。（3）TCA循循环:生成谷氨酸前体物生成谷氨酸前体物质 酮戊二酸。戊二酸。（4）CO2固定反固定反应:补充草充草酰乙酸。乙酸。（5）乙）乙醛酸循酸循环:使琥使琥铂酸、延胡索酸和苹果酸的量得酸、延胡索酸和苹果酸的量得 到到补充，充，维持持TCA循循环的正常运的正常运转。谷氨酸脱谷氨酸脱氢酶（6）还原氨基化反原氨基化反应:酮戊二酸戊二酸 谷氨酸谷氨酸丙丙酮酸酸回补反应3.3.谷氨酸生谷氨酸生产菌的生化特征菌的生化特征（1 1）有苹果酸）有苹果酸酶和丙和丙酮酸酸羧化化酶。（2 2）酮戊二酸脱戊二酸脱氢酶活性弱，异活性弱，异柠檬酸脱檬酸脱
8、氢酶活性活性强，异，异柠檬酸裂解檬酸裂解酶活性弱。活性弱。（3 3）谷氨酸脱）谷氨酸脱氢酶活性高，活性高，经呼吸呼吸链氧化氧化NADPHNADPH2 2的能力弱。的能力弱。（4 4）菌体本身利用谷氨酸的能力低。）菌体本身利用谷氨酸的能力低。4.4.谷氨酸谷氨酸产生菌（全是生菌（全是细菌）菌）棒杆菌属棒杆菌属北京棒杆菌北京棒杆菌 C.pekinenseC.pekinense CorynebacteriumCorynebacterium钝齿棒杆菌棒杆菌 C.crenatumC.crenatum谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌 C.glutamicumC.glutamicum短杆菌属短杆菌属黄色短杆菌黄色短
9、杆菌 B.flvumB.flvumBrevibacteriumBrevibacterium产氨短杆菌氨短杆菌 B.ammoniagenesB.ammoniagenes小杆菌属小杆菌属嗜氨小杆菌嗜氨小杆菌 M.ammoniaphilumM.ammoniaphilumMicrobacteriumMicrobacterium节杆菌属杆菌属球形球形节杆菌杆菌 A.A.globiformisglobiformisArthrobacterArthrobacter 共同点：共同点：11）革）革兰氏阳性。氏阳性。22）不形成芽）不形成芽孢。33）没有鞭毛，不能运）没有鞭毛，不能运动。44）需要生物素作）需要生
10、物素作为生生长因子。因子。55）在通气条件下）在通气条件下产谷氨酸（需氧微生物）。谷氨酸（需氧微生物）。三、谷氨酸三、谷氨酸发酵的工酵的工艺控制控制 培养基培养基1.1.碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃（1 1）淀粉水解糖的制）淀粉水解糖的制备（2 2）糖蜜原料）糖蜜原料（1）淀粉水解糖的制淀粉水解糖的制备：酸水解：酸水解1、调浆：干淀粉用水调成淀粉乳，加盐酸至pH1.5。2、糖化糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80下中和。3、中和：中和：烧碱中和，至4、脱色：脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为，在70及酸性条件下搅拌后过滤。酶法糖化：以大米或碎
11、米为原料时采用工艺流程：大米清洗 浸泡粉碎调浆液化添酶压滤（调浆）滤液加酸调pH 1.8糖化中和脱色压滤糖液（2）糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加青霉素。2.2.氮源：氮源：铵盐、尿素、氨水、尿素、氨水C/NC/N100100：1515 2121，实际高达高达100100：2828因因为：1 1）用于）用于调整整pHpH。22）分解）分解产生的生的NHNH3 3从从发酵液中逸出。酵液中逸出。产酸酸阶段：段：NHNH4 4+不足：使不足：使-酮戊二酸蓄戊二酸蓄积而很
12、少有谷氨酸生成。而很少有谷氨酸生成。NHNH4 4+过量：促使谷氨酸生成谷氨量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。胺。3.3.无机无机盐：磷酸：磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中，其中磷酸磷酸盐对发酵有酵有显著影响：著影响：不足：糖代不足：糖代谢受抑制，菌体生受抑制，菌体生长不足。不足。过多：多：a.a.细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。b.b.促使丙促使丙酮酸和乙酸和乙醛（由丙（由丙酮酸脱酸脱羧生成）生成）缩合生成合生成缬氨酸的前体物氨酸的前体物 乙乙醛乳酸，乳酸，使使缬氨酸在氨酸在发酵液中蓄酵液中蓄积。4.4.生生长因子：生物素因子：生物素作用：影响作用：影
13、响细胞膜通透性和代胞膜通透性和代谢途径。途径。（1 1）作）作为催化脂肪酸生物合成最初反催化脂肪酸生物合成最初反应的关的关键酶乙乙酰CoACoA的的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，参与脂肪酸的生物合成，进而影响而影响磷磷酯的合成。的合成。（2 2）浓度度过大：促大：促进菌体生菌体生长，谷氨酸，谷氨酸产量低。因量低。因为：a.a.乙乙醛酸循酸循环活活跃，-酮戊二酸生成量减少。戊二酸生成量减少。b.b.转氨氨酶活力增活力增强，谷氨酸，谷氨酸转变成其它氨基酸。成其它氨基酸。（二）（二）pHpH的影响及其控制的影响及其控制作用机理：主要影响作用机理：主要影响酶的活性和菌的代的活性和菌的代谢。在氮源供在氮源
14、供应充分和微酸性条件下，谷氨酸充分和微酸性条件下，谷氨酸发酵酵转向谷氨向谷氨酰胺胺发酵。酵。pHpH控制在中性或微碱性。控制在中性或微碱性。方法：流加尿素和氨水。方法：流加尿素和氨水。（三）温度的影响及其控制（三）温度的影响及其控制菌体生菌体生长达一定程度后开始达一定程度后开始产生氨基酸，菌体生氨基酸，菌体生生长最适温度和氨基酸合成的最适温度不同。最适温度和氨基酸合成的最适温度不同。菌体生菌体生长阶段：段：3030 3434产酸酸阶段：段：3434 3636控制控制因子因子产物产物氧氧(不足不足)乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸 谷氨酸谷氨酸(充足充足)-)-酮戊二酸酮戊二酸(过量过量)NHNH+4
15、4(不足不足)-)-酮戊二酸酮戊二酸 谷氨酸谷氨酸(适量适量)谷氨酰胺谷氨酰胺(过量过量)生物生物素素谷氨酸谷氨酸(限量限量)乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸(充足充足)pHpH(酸性酸性)N-)N-乙酰乙酰-谷氨酰胺谷氨酰胺 谷氨酸谷氨酸(中性或微碱性中性或微碱性)磷酸磷酸盐盐(适量适量)谷氨酸谷氨酸 缬氨酸缬氨酸 环境条件引起谷氨酸合成的代境条件引起谷氨酸合成的代谢转换 菌种菌种扩大培养大培养1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。斜面
16、培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的琼脂培养基，32培养18-24h。2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。1000ml装200-250ml振荡，32 培养12h。3、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1，用水解糖代替葡萄糖，于32 进行通气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为108-109/ml。谷氨酸发酵1、适、适应期：尿素分解出氨使期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。上升。糖不利用。2-4h。措施：接种量和措施：接种量和发酵条件控制使适酵条件控制使适应
17、期期缩短。短。2、对数生数生长期：糖耗快，尿素大量分解使期：糖耗快，尿素大量分解使pH上上升，氨被利用升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急又迅速下降。溶氧急剧下降后下降后维持在一定水平。菌体持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形度迅速增大，菌体形态为排列整排列整齐的八字形。不的八字形。不产酸。酸。12h。措施：及措施：及时供供给菌体生菌体生长必必须的氮源及的氮源及调节pH，在，在时流加尿素；流加尿素；维持温度持温度30-323、菌体生长停滞期：谷氨酸合成。措施：提供必须的氨及pH维持在。大量通气，控制温度34-37。4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐
18、。发酵周期一般为30h。下游下游过程程（一）谷氨酸的提取方法（一）谷氨酸的提取方法1.1.等等电点沉淀法点沉淀法 操作简单，收率60。周期长，占地面积大。2.2.不溶性不溶性盐沉淀法沉淀法（1 1）锌盐法法谷氨酸谷氨酸锌离子离子谷氨酸谷氨酸锌沉淀沉淀溶液溶液谷氨酸谷氨酸结晶晶pH6.3加酸加酸pH2.4（2 2）盐酸酸盐法：法：GluGlu在在浓盐酸中生成并析出谷氨酸酸中生成并析出谷氨酸盐酸酸盐。这是用是用盐酸水解面筋生酸水解面筋生产谷氨酸的原理。谷氨酸的原理。（3 3）钙盐法：法：高温谷氨酸高温谷氨酸钙溶解度大，与菌体等不溶性溶解度大，与菌体等不溶性杂质 分开，降温，析出谷氨酸分开，降温，析
19、出谷氨酸钙沉淀，加沉淀，加NaHCONaHCO33直接得直接得到味精。到味精。3.3.离子交离子交换法法用阳离子交用阳离子交换树脂吸附谷氨酸形成的阳脂吸附谷氨酸形成的阳离子，再用离子，再用热碱（碱（60604%NaOH4%NaOH）洗脱，）洗脱，收集相收集相应流分，加流分，加盐酸酸结晶。晶。GA+GA GA-GA=12 pI谷氨酸是酸性氨基酸，含谷氨酸是酸性氨基酸，含2 2个个羧基基1 1个个氨基，与阴离子交氨基，与阴离子交换树脂要比与阳离子交脂要比与阳离子交换树脂脂强，但阴离子机械，但阴离子机械强度差，价格度差，价格贵，因，因而用阳离子交而用阳离子交换树脂。脂。理理论上上讲发酵液上柱的酵液上
20、柱的pHpH值应低于低于3.223.22，但，但实际上控制在上控制在5.05.0 6.06.0之之间，因因NaNa+、NHNH4 4+交交换能力能力 谷氨酸，谷氨酸，优先交先交换，置置换出出H H+使使pHpH值低于低于3.23.2，使谷氨酸成，使谷氨酸成为阳离子，但不能阳离子，但不能6.06.0。（二）味精制造（二）味精制造 谷氨酸溶于水谷氨酸溶于水活性炭脱色活性炭脱色加加NaNa2 2COCO3 3中和中和谷氨酸谷氨酸单钠（味精粗品）（味精粗品）除除铁过滤活性活性炭脱色炭脱色减减压浓缩结晶晶离心分离离心分离干燥干燥成品成品我国味精技我国味精技术进展情况展情况制糖工制糖工艺进展：展：酸法水解酸法水解酶酸法水解酸法水解双双酶法水解。法水解。发酵工酵工艺进展展：亚适量生物素水平（适量生物素水平（产酸酸4 46g6gdldl）高生物素水平（高生物素水平（产酸酸121215g15gdldl）。）。提取工提取工艺进展展：等：等电点法（少数点法（少数锌盐法）法）等等电离交法离交法低温低温连续等等电点法（少数厂家采用）。点法（少数厂家采用）。精制工精制工艺进展：展：全粉炭脱色、硫化碱除全粉炭脱色、硫化碱除铁颗粒炭脱粒炭脱色、色、树脂除脂除铁。课 外外 作作 业从哪几个方面进行氨基酸发酵的代谢控制？控制细胞膜通透性有几种方法？