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1、临床微生物实验室质量控临床微生物实验室质量控制及质量保证胡继红制及质量保证胡继红质量控制质量控制概念的引入历史上，现代风险管理风险管理的概念引入实验室之后，就以质量控制的形式出现。狭义上指的是一项持续的持续的、系统性系统性的评估工作来确保终产品的一致性 根据可接受的程度：事先建立好的允许限度下的精确度和准确度事先建立好的允许限度下的精确度和准确度。临床微生物实验室质量控制环节 标本留取、运送标本合格判定标本合格判定培养基、试剂培养基、试剂培养基、试剂培养基、试剂仪器设备仪器设备仪器设备仪器设备 紧急报告分析前分析前分析前分析中分析中分析后分析后临床机构实验室管理办法基本要求实验室管理办法微生物
2、室内质量控制基本要求一、培养基实验室使用的所有培养基使用前应做实验室使用的所有培养基使用前应做无菌试验无菌试验，并按培养基的用途做，并按培养基的用途做生长试验生长试验，或选择性生长试验，或耐药筛选试验等。或选择性生长试验，或耐药筛选试验等。无菌试验：排除培养基生产、运输和贮存过程的污染可能。无菌试验：排除培养基生产、运输和贮存过程的污染可能。无菌试验：排除培养基生产、运输和贮存过程的污染可能。无菌试验：排除培养基生产、运输和贮存过程的污染可能。生长试验：检验培养基标本中可能存在的目标菌能否生长生长试验：检验培养基标本中可能存在的目标菌能否生长生长试验：检验培养基标本中可能存在的目标菌能否生长生
3、长试验：检验培养基标本中可能存在的目标菌能否生长 分离培养的关键！分离培养的关键！分离培养的关键！分离培养的关键！解释：培养基在使用前随机挑选，培养1天，观察是否污染。非选择培养基（血平板、巧克力平板）选择培养基（淋球菌培养基、麦康凯平板等）单管生化培养基、微量管生化培养基、苯唑西林耐药筛选平板等 无菌生长为合格。培养基生长试验自制自制培养基培养基：每批做质控用菌株根据期望结果选择每批做质控用菌株根据期望结果选择 确认要求生长特性（溶血、特征菌落等）确认要求生长特性（溶血、特征菌落等）选择性（生长选择性（生长/不生长，不生长，淋球菌选择培养基淋球菌选择培养基）加强营养（苛养菌、加强营养（苛养菌
4、、巧克力琼脂巧克力琼脂）鉴定用生化反应（阴性、阳性，鉴定用生化反应（阴性、阳性，如：氧化如：氧化/发酵，动力等发酵，动力等）质控菌株的贮存质控菌株的贮存 日常用：4-8,胰酶消化大豆肉汤（非苛养菌）；高营养 巧克力琼脂斜面（苛养菌），每周转种。中期贮存：50胎牛血清肉汤，脱纤维羊血或脱脂牛奶，10-15甘油胰酶消化大豆肉汤，-20。长期贮存：冻干或液氮。二、主要试剂（至少至少）每个工作日或每次试验应做质控（阳性对照及阴性对照）每个工作日或每次试验应做质控（阳性对照及阴性对照）过氧化氢酶：过氧化氢酶：区别链球菌属区别链球菌属/葡萄球菌属，少见葡萄球菌属，少见G-菌、菌、G+菌菌凝固酶凝固酶:区别
5、金黄色葡萄球菌区别金黄色葡萄球菌/凝固酶阴性葡萄球菌，药敏标准凝固酶阴性葡萄球菌，药敏标准 致病性和用药等都不同致病性和用药等都不同氧化酶：氧化酶：G-菌区别，肠杆菌科菌区别，肠杆菌科/非发酵菌非发酵菌/弧菌科弧菌科/少见少见G-菌等菌等-内酰胺酶：预测流感嗜血杆菌、卡他布兰汉菌和淋病奈瑟内酰胺酶：预测流感嗜血杆菌、卡他布兰汉菌和淋病奈瑟 菌对青霉素类抗生素敏感性；葡萄球菌属对青菌对青霉素类抗生素敏感性；葡萄球菌属对青 霉素敏感性。霉素敏感性。临床意义过氧化氢酶过氧化氢酶，凝固酶凝固酶，氧化酶氧化酶是临床常见菌鉴定非常重要的三个基本试验，是临床常见菌鉴定非常重要的三个基本试验，也是决定鉴定方向
6、的重要指标也是决定鉴定方向的重要指标;-内酰胺酶内酰胺酶在判断苛养菌流感嗜血杆菌、在判断苛养菌流感嗜血杆菌、卡他布兰汉菌和淋病奈瑟菌对青霉素、阿莫西林和氨苄西林的敏感性。卡他布兰汉菌和淋病奈瑟菌对青霉素、阿莫西林和氨苄西林的敏感性。应应每个工作日每个工作日做质控，或做质控，或在检测菌株时在检测菌株时用相应的标准菌株用相应的标准菌株作为阴性对照和阳性对照做质控。作为阴性对照和阳性对照做质控。具体要求具体要求过氧化氢酶（H2O2）区别链球菌属区别链球菌属/葡萄球菌属，少见葡萄球菌属，少见G-G-菌、菌、G+G+菌菌阳性对照：金黄色葡萄球菌阳性对照：金黄色葡萄球菌ATCC 25923阴性对照：粪肠球
7、菌阴性对照：粪肠球菌ATCC12228血浆凝固酶试验玻片法：凝集因子/试管法：凝固酶阳性对照：金黄色葡萄球菌阳性对照：金黄色葡萄球菌ATCC 25923阴性对照：表皮葡萄球菌阴性对照：表皮葡萄球菌ATCC12228区别金黄色葡萄球菌区别金黄色葡萄球菌/凝固酶阴性葡萄球菌凝固酶阴性葡萄球菌药敏标准、致病性和用药等都不同药敏标准、致病性和用药等都不同氧化酶/内酰胺酶氧化酶试验氧化酶试验阳性对照：绿脓假单胞菌阳性对照：绿脓假单胞菌ATCC27853ATCC27853阴性对照：大肠杆菌阴性对照：大肠杆菌ATCC25922ATCC25922内酰胺酶试验内酰胺酶试验阳性对照：金黄色葡萄球菌阳性对照：金黄色
8、葡萄球菌ATCC25923阴性对照：流感嗜血杆菌阴性对照：流感嗜血杆菌ATCC29247其他常用基本试验OP：肺炎链球菌肺炎链球菌S/S/其他草绿色链球菌其他草绿色链球菌R R杆菌肽杆菌肽：化脓链球菌化脓链球菌S/S/其他其他-溶血链球菌溶血链球菌R RCAMP：无乳链球菌（无乳链球菌（+）其他其他-溶血链球菌（溶血链球菌（-）流感嗜血杆菌：X X、V V分别都不生长，分别都不生长，X+VX+V因子：生长因子：生长其他嗜血杆菌属：X X生长或生长或V V生长生长三、自制生化鉴定试剂举例：实验室自制的常规生化鉴定大管或微量管培养基 （链球菌、葡萄球菌、肠杆菌科和弧菌科/非发酵菌等）每批试剂使用前
9、应使用相应阴性和阳性反应（标准）菌株做质控；合格后，注明批号，在一定时间内使用。具体要求具体要求尿素、氨基酸吲哚四、染色液革兰染色：使用大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌标准菌株进行质控；革兰染色：使用大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌标准菌株进行质控；抗酸染色：使用已知抗酸阳性菌株（或标本）进行质控；抗酸染色：使用已知抗酸阳性菌株（或标本）进行质控；每批试剂每批试剂至少至少1次次 最好最好定期定期做质控。当染色结果不确定时，可做质控作为对照。做质控。当染色结果不确定时，可做质控作为对照。革兰染色：革兰染色：G+:金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌ATCC25923G-:大肠埃希菌大肠埃希菌ATCC25922抗酸染
10、色：抗酸染色：阳性：阳性：Mube.trculosisATCC25177阴性：大肠埃希菌阴性：大肠埃希菌ATCC25922肺炎链球菌肺炎链球菌大肠埃希菌大肠埃希菌G+G-电电 镜镜G染色染色抗酸染色阳性五、细菌、酵母菌鉴定系统使用厂家规定的标准菌株对相应试剂进行质控使用厂家规定的标准菌株对相应试剂进行质控每批试剂至少每批试剂至少1次次手工、半自动系统、自动系统：手工、半自动系统、自动系统：使用厂家规定的标准菌株做质控，应符合预期结果；质控频率：质控频率：每批试剂使用前需要先做质控当使用新系统或新的操作人员以考察技术人员操作是否满足厂家操作说明书要求 可增加质控次数可增加质控次数不同系统鉴定试剂
11、分类不同G菌：葡萄球菌属链球菌属棒状杆菌属其他G菌：肠杆菌科非发酵菌苛养菌少见菌酵母样真菌：六、药物敏感试验（手工法）纸片扩散法纸片扩散法：每周至少：每周至少1次；更换药物或培养基时要做质控。次；更换药物或培养基时要做质控。常见菌：大肠埃希菌常见菌：大肠埃希菌ATCC25922,金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌25923,绿脓假单胞菌绿脓假单胞菌 27853 质控质控手工法（稀释法）：手工法（稀释法）：每周至少每周至少1次，最好每次试验做质控。次，最好每次试验做质控。解释：手工法（稀释法）：常规试验通常使用微量肉汤稀释法，解释：手工法（稀释法）：常规试验通常使用微量肉汤稀释法，标准做法是每批试验标
12、准菌株与临床分离株同时做。标准做法是每批试验标准菌株与临床分离株同时做。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌29213,大肠埃希菌大肠埃希菌ATCC25922ATCC25922绿脓假单胞菌绿脓假单胞菌 27853 27853 质控质控抗生素药敏试验纸片法纸片法 新批号药做；一般每周做；失控时天天做，连续30天，准确度和精确 度达到后才恢复每天做；一个药物失控时，重新测5天。稀释法稀释法 琼脂法、微量肉汤法每次同时做质控药敏试验失控措施对每种药物、每种菌株，30次试验总失控结果不能超过3个。如果30天监控结果完全符合上述要求，可转为一周一次质控的方法。只要抑菌环直径超出可接收范围都必须校正当失控原因不明
13、时，可用相应质控菌株连续监测5天；每种菌株对质控中每种抗菌药物同时测试5个抑菌环，如果结果全部达到可接收范围，可恢复一周一次质控。药物敏感试验（仪器法）使用厂家规定的标准菌株对相应试剂进行质控 每批试剂至少1次当试验结果异常、不稳定，或缺少经验的人员操作时，应增加质控的频率。以上内容只是对临床微生物实验室室内质控的基本要求，以上内容只是对临床微生物实验室室内质控的基本要求，只能满足分析中对主要培养基和试剂的质控需要，只能满足分析中对主要培养基和试剂的质控需要，是进行相应试验操作的实验室应做到或至少要做到。是进行相应试验操作的实验室应做到或至少要做到。质量控制是保证临床微生物实验室是否能提供准确
14、、质量控制是保证临床微生物实验室是否能提供准确、可靠、可重复和具有临床意义的检测信息，依靠评价临床可靠、可重复和具有临床意义的检测信息，依靠评价临床标本的质量，监控试验步骤、仪器、培养基、试剂和人员操作，标本的质量，监控试验步骤、仪器、培养基、试剂和人员操作，复核试验结果，记录试验方法的有效性来实现。复核试验结果，记录试验方法的有效性来实现。完整的临床微生物实验室质量控制应包含对检验过程的完整的临床微生物实验室质量控制应包含对检验过程的分析前、分析中和分析后所有环节的质量控制。分析前、分析中和分析后所有环节的质量控制。质量保证概念在广义上，微生物的质控工作与其说是科学，不如说是门艺术。它包含众
15、多无形的项目，如常识、良好的判断力、始终如一的细节关注。高水平的实验室表现需要机智、有兴趣的、积极主动的员工参与。强调的重点，在某种程度上，已经从严格的实验室内部的点对点质控工作转移到更为宽泛的针对病人关怀的品质保证工作。及时的报告可以给内科医生提供参考，也可以最大限度的指导病人关怀 质量保证持续监测评价和持续改进检测病人标本结果的可靠性和有效性 QA监测监测 目标目标 标本 质量、数量、体积，可接受的合格标本 检测 根据临床指症、诊断和其他临床资料，采用适当检测方法 报告 监测报告的正确，清楚、及时 服务对象理解 积极问询其需要，满意度，对抱怨的处理情况 临床微生物实验室质量控制范畴标本分析
16、前的质量控制：标本分析前的质量控制：标本分析前的质量控制：标本分析前的质量控制：微生物学特殊性微生物学特殊性得到正确分析结果的基础大量的分析前因素影响微生物实验的诊断价值质量控制内容质量控制内容：1、合理的标本采集 向临床提供标本采集说明(sop)正确时间部位方法等采集时间；标本来源对收集和运送标本的容器控制对收集和运送标本的容器控制:无菌无防腐剂 足够大安全严密不易碎运送培养基加强无生长因子或保持特定菌的培养基避免用木质的棉试子对细菌有毒害影响血培养的临床操作影响血培养的临床操作 皮肤及装置消毒有效性的指标：在静脉穿刺时或从留置装置获得血样时，血培养阳性感染而非污染 血培养的污染，特别是凝固
17、酶阴性的葡萄球菌，是最常见导管相关菌血症的致病因子也是最常见的血培养污染因子不但引起医生的困惑而且增大花费。减少污染对于微生物实验室和健康机构来说都是关键问题。皮肤消毒及预防污染皮肤消毒的传统推荐方法为70%酒精加上聚维酮碘溶液或碘酊。聚维酮碘在接触1.5-2分钟后达到最大消毒效果，而碘酊为0.5分钟。与内置导管相比，静脉穿刺血样较少污染。血样培养数量非自动血液培养系统（采血量为20ml）研究显示，在成人培养2-3份血样就能检测出几乎所有的（99%）血流感染。研究显示使用相同采血量，培养3份血样，接种于单份自动血培养系统，非心内膜炎检出率为96%。不应使用单一瓶血培养，单一培养提供的血量不足，
18、检不出某些感染。凝固酶阴性葡萄球菌、绿脓杆菌及类白喉菌的生长多数情况下代表污染，而也可能是重要的临床感染。在此情况下，解释阳性结果就显得非常困难了。血培养的时机针对血培养的时机缺乏系统的研究。尽管菌血症经常出现寒战，但是在发热前，而发热时才会把血培养提上日程。有权威建议血培养应被安排在任意间隔。但在一项回顾性调查中，Li等认为，在24小时内或固定间隔获得血样的结果没有差别。临床医生和实验者应根据患者的状态及怀疑的诊断决定。对于败血症或不稳定的患者，血培养须迅速，以便制定治疗方案。相反地，若在病情稳定的患者怀疑是亚急性心内膜炎，应在固定间隔采集血样。2 2、正确的运送方式、正确的运送方式(sop
19、)(sop)（运送工具和有效时间及储存方法等）标本因冷藏冷藏及pH改变或在氧气中暴露氧气中暴露，可能减少很多种细菌的存活时间 脑膜炎球菌，淋病奈瑟菌，流感嗜血杆菌，肺炎链球菌，沙门菌，志贺氏菌，霍乱弧菌，空肠弯曲菌及厌养菌 定量评价细菌数量的培养（尿标本）（运送时间）对环境敏感菌株在运送中数量快速减少时，如果运送时间太长，其它菌则成倍增长，目标细菌可同其它菌一起过度生长。需进行细菌学检测的所有标本，需进行细菌学检测的所有标本，应在收集后应在收集后2 2小时内送到实验室小时内送到实验室 细菌学试验的各种标本的运送及贮存条件细菌学试验的各种标本的运送及贮存条件标本标本 运送运送 贮存温度贮存温度
20、血血 血培养瓶 室温或37 脓脓、脑脊液脑脊液、胸水、心包液胸水、心包液、腹水、关节滑液腹水、关节滑液、鼻窦分泌物鼻窦分泌物 短时间内运送短时间内运送:标本在带帽的注射器内标本在带帽的注射器内保证厌氧条件保证厌氧条件长时间运送长时间运送：使用运送培基使用运送培基 室温不用培养避免冷藏 支气管肺泡灌液、支气管肺泡灌液、痰，其它分泌物痰，其它分泌物 、便便 立刻送检（2-3小时）冷藏 眼眼、耳耳、嘴嘴、咽咽、鼻鼻、尿尿道道、生生殖殖道道、直肠、直肠、伤口伤口 试子 用运送培养基用运送培养基(运送时间运送时间44小时小时)室温室温不培养不培养3、有可靠的标本质量评价方法(sop)痰标本中10上皮细胞
21、中，25个WBC24h尿标本或痰标本找抗酸杆菌或真菌培养痰试子找抗酸杆菌或真菌评价标本量是否足够标本不合格！4、拒收标本指标除非不能再采集的标本，否则不予检测；如果培养或检测，要对结果进行说明。书写错误容器问题干燥试子厌养菌容器无菌无防腐剂足够大安全严密不易碎运送培养基无生长因子或保持特定菌的培养基避免用木质的棉试子对细菌有毒害分析中质量控制：分析中质量控制：常规仪器和设备常规仪器和设备成品商业培养基（成品商业培养基（诊断抗血清）定期维护和校准、记录pH计厌氧指示剂水浴葙天平加样器自动高压灭菌器生物安全柜年检、验证培养时间、温度控制葡萄球菌药敏试验06年CLSI 352，16-18h,苯唑西林
22、，甲苯西林，奈夫西林和万古霉素24h。35 35 以上可能检测不出以上可能检测不出MRSMRS.淋球菌药敏试验 361361（不能超过（不能超过3737）培养葙、水浴和冰箱可接受温度范围温度温度可接受范围可接受范围目的目的251.0酵母菌、霉菌351.0常规301.0酵母菌和霉菌、李斯特420.5沙门/弯曲菌分离、鲍曼不动杆菌冷藏4-8 储存培养基、试剂冷冻-20低温储存标本、试剂、贮存菌种冷冻-70超低温储存参考菌株和血清成品商业培养基接收时记录批号，接收日期；厂家提供质控文件，如实沿用气体，培养时间长度，可接受的结果；使用的实验室必须检查外观，破损、污染、溶血或冻坏情况；有效期内质量是否有
23、变化必须做质控的商业培养基做药敏试验 MH培养基 巧克力琼脂 弯曲菌琼脂 淋球菌选择培养基用于主要的微生物鉴定 试剂盒中的培养基有两种或更多的底物有相对高的失败率厂家不做的羊血琼脂CAMP细胞培养用分析后质量控制：分析后质量控制：1、临床微生物学、临床微生物学“紧急报告值紧急报告值”2、监测报告结果是否正确、清楚、及时。、监测报告结果是否正确、清楚、及时。阳性血培养的解释阳性血培养的解释在多数医院中，血培养的阳性率在8-14%。在这些阳性标本中，有近一半至三分之二是引起菌血症及真菌血症的罪魁祸首，剩余的则为污染或未知临床意义的。阳性标本临床意义的解释经常伴随临床问题。对阳性结果的误解通常给患者
24、及医院带来巨大损失。有几条标准有助于对结果的解释，包括辨别微生物自身形态、多于一份血培养为相同微生物的阳性结果、在另一无菌培养瓶中发现相同微生物。当从血中分离出葡萄球菌、大肠杆菌、肠杆菌科家族、绿脓假单胞菌、肺炎链球菌及白色念珠菌时，通常表示感染的存在。当分离到棒状杆菌属、杆菌属、丙酸杆菌属时，表示菌血症。凝固酶阴性葡萄球菌在解释临床意义时通常最容易出问题，因为该菌无所不在，并且12-15%为病原菌而不是污染。阳性培养瓶的数量并不能作为判断凝固酶阴性葡萄球菌临床意义的可信赖标准。阳性培养基数量是解释时一项有用的数据。若多数或所有培养基均为同一微生物阳性，则其临床意义基本可以肯定。尽管做最终决定
25、的是医生，但微生物学家依旧可以对血培养的临床意义提供重要指导。注重培养微生物工作人员的质量控制意识注重培养微生物工作人员的质量控制意识 有形的、看得见的 微生物实验的质量可以通过正确的操作来体现，例如革兰染色试剂，可以通过对标准质控菌株的染色来反映操作和试剂的质量。质量控制更依赖于工作人员的认知能力 一个受过充分培训的、能够严谨地分析实验结果的工作人员，不是只能够忠实地记录实验数据，而是可以实施更加严格的标准。G+未报道过的表型、不常见结果或技术错误造成不常见表型/技术错误造成结果，要确认耐药结果肠球菌属Daptomicin NSVan R粪肠球菌氨苄或青霉素R,Daptomicin NS,喹
26、达喹达S，Linezolid R,高水平庆大 R(特别是来自无菌部位标本）屎肠球菌Daptomicin NS，Linezolid R高水平庆大R (无菌部位标本），喹达喹达R金葡菌Daptomicin NS,Van I,R Linezolid NS 喹达喹达I,R苯唑西林R凝阴性葡Daptomicin NS,Van I,R Linezolid NS肺炎链球菌氟喹诺酮R，Linezolid NS,Van NS青霉素R,三代头孢RB溶血链球氨苄或青霉素NS,三代头孢NS Daptomicin NS,Linezolid NS,Van NS草绿链Daptomicin NS,Linezolid NS,V
27、an NS青霉素 I,R任何菌对所有常规检测抗生素都耐药需证实药敏试验的结果和确认菌种的鉴定G-未报道过的表型、不常见结果或技术错误造成不常见表型/技术错误造成结果，要确认耐药结果任何肠杆菌科卡巴配能 I,R阿米卡星 R,氟喹诺酮R弗氏枸橼酸，肠杆菌属，粘质沙雷氨苄，头孢唑啉或头孢噻吩S克雷伯属氨苄S确认ESBL+(大肠）普通变形，普鲁威登属氨苄S沙门属三代头孢I,R,氟喹诺酮I,R奈啶酸R嗜麦芽窄食单胞菌卡巴配能S复方新诺明R流感嗜血杆菌氨曲南NS,卡巴配能NS三代头孢NS，氟喹诺酮NS氨苄R和-内酰胺酶阴性阿莫西林/棒酸 R淋病奈瑟菌三代头孢R氟喹诺酮R任何细菌对常规所有抗生素R需证实药敏试验的结果和确认菌种的鉴定注重培养微生物工作人员的质量控制意识注重培养微生物工作人员的质量控制意识 具有质量意识的微生物技术人员 应该对标准烂熟于心，能对不常见的结果提出疑问：象不可能的或迄今为止从未见过的药敏表型 出现少见菌或非常驻菌，以及增加的污染率等。各种质量控制方法都很难检查出来！这些和其他的技术错误或书写错误不是经常发生，或散在发生 实验室应该鼓励工作人员的质量意识 他们做出的结果可以得到临床医生的信赖信赖 谢谢谢谢结束结束