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1、核酸的分离与纯化华西医院实验医学科分子诊断室王军背景核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸提取也成为了分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作。核酸提取亦是临床分子诊断最关键的操作，直接关系到实验的成败与否，是临床分子诊断容易发生问题步骤。核酸的存在形式DNA：细胞核DNP 线粒体 环状DNARNA：细胞质中，mRNA，rRNA，tRNA 通常与蛋白质结合，形成RNP核酸的理化性质DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L
2、，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。核酸提取方法核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。核酸提取时应遵循以下原则:1、保证核酸分子一级结构的完整性;2、排除其他分子污染。核酸提取方法大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括：细胞裂解细胞裂解、酶处理酶处理、核酸与其
3、他核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化生物大分子物质分离、核酸纯化 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。核酸提取方法细胞裂解细胞裂解可通过以下几种方法实现：物理作用物理作用 化学作用化学作用 酶作用酶作用（生物作用）核酸提取方法细胞裂解物理作用：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎冻融裂解和颗粒破碎等方法。这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。超声裂解法提取的核酸片段长度从 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般 10kb。核酸提取方法细胞裂解化学作用：变性：加热、加入表面活性剂
4、加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100、Tween 20、NP-40、CTAB、sar-cosyl、Chelex-100 等)或强离子剂强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)碱性PH环境：强碱强碱(NaOH)(NaOH)或碱性缓冲液碱性缓冲液(TE、STE 等)在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离子螯合剂(EDTA 等)可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+、Ca2+,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。核酸提取方法细胞裂解酶作用（生物作用）：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白
5、酶或链酶蛋白酶)以使细胞破裂,核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的-(1,4)键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65 及有EDTA、尿素(14mol/L)和去污剂(0.5%SDS 或 1%Triton X-100)存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。核酸提取方法酶处理在核酸提取过程中,可通过加入适当的酶使不需要的物质降解,以利于核酸的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或链酶蛋白酶)可以降解蛋白质,灭活核酸酶(DNase 和RNase)；或者加入DNase
6、或RNase 去除不需要的DNA或RNA。核酸提取方法分离与纯化酚氯仿法酚氯仿法简介：1976，Stafford及其同事创立。现已经不断改进。关键技术：酚的使用 用酚来分离核酸首先是Kirty，1956年首次报道。当时发现酚可以从水相中抽提蛋白质，使用阴离子盐时，可以实现核酸分配在水相，而蛋白质在有机相。核酸提取方法分离与纯化酚氯仿法酚氯仿法核酸提取方法分离与纯化酚氯仿法酚氯仿法酚的准备重蒸酚(去除可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联的醌类氧化物）；加入8一羟基喹咛，以防止酚氧化，（酚氧化发黄，而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联）；水饱和酚、平衡PH（大于7.8）
7、（不饱和的酚能与15%其提及的水互溶，从而降低水相中核酸产量）发展和改进：SDS取代阴离子盐酚：氯仿混合液（增加了对糖、脂的溶解）异戊醇的使用（减少泡沫、使RNase失活）核酸提取方法分离与纯化酚氯仿法酚氯仿法1.1.裂解缓冲液（异硫氰酸胍）处理裂解缓冲液（异硫氰酸胍）处理2.蛋白酶K消化，（根据需要亦可加入Dnase或RNAase）3.50:48:2苯酚苯酚:氯仿氯仿:异戊醇混合液，与等量的裂解处理液混合，依据异戊醇混合液，与等量的裂解处理液混合，依据应用目的应用目的,两相经漩涡振荡混匀两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸适用于分离小分子量核酸)或简单或简单颠倒混匀颠倒混匀(适用于分离
8、高分子量核酸适用于分离高分子量核酸)后离心分离。疏水性的蛋白质后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。核酸则被留于上层水相。4.4.转移水相，转移水相，重复步骤3，直至满意为止。5.5.核酸沉淀核酸沉淀，在含核酸的水相中加入p H5.05.5,终浓度为0.3M 的NaAc 或KAc 后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入23倍体积的预冷的无水乙醇,经一定时间的孵育,可使核酸有效地沉淀。6.14000g离心30分钟室温，或者如果产量较大可直接用玻璃钩子取出。7.70%乙醇洗涤2-3次，即可将沉淀溶于TE保存。核酸提取
9、方法分离与纯化酚氯仿法酚氯仿法纯度高，RNA回收效率极高，尤其是1.8,RNA2.0)DNA1.8,RNA2.0)回收试验：通过real-timePCR检测已知核酸量的样本，观察检测值。A260A260：是核酸最高吸收峰的吸收波长；A280A280：是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长。A260/A280比值若小于上述范围，意味着有蛋白质和酚物质的污染。chelex和其它一些盐类会影响吸光度值的测定实验室核酸提取后的质量评价 及影响后续试验的因素 影响后续试验的常见因素：影响后续试验的常见因素：核酸的质量；其它常见因素：1、抗凝剂：肝素，肝素，EDTAEDTA等等；煮沸法，凝胶过滤，乙醇沉淀均
10、不能有效去除肝素 2、溶血样本：血红蛋白；a、释放Fe离子？b、亚铁血红素可抑制Taq酶？3、提取过程中掺入的物质：乙醇(1%,抑制PCR；并干扰测序)4、IgG；可与单链DNA作用阻止其与聚合酶结合；煮沸法提取的核酸不能完全避免。5、层析柱和磁珠法能有效避免以上影响因素；蛋白酶消化也能去除蛋白质类物质对后续试验的影响 小结核酸提取常见化学试剂名称作用chelex100chelex100 chelex chelex 螯合金属离子螯合金属离子；有效除去非核酸有机物除去非核酸有机物；防止防止DNA在煮沸时降解降解；并在高温低离子强度下起着催化催化DNADNA释放释放的作用。酚氯仿混合液酚氯仿混合液
11、 酚酚：有效变性蛋白质；抑制了DNase的降解作用。氯仿：氯仿：增加对糖脂的溶解。SDSSDS 溶解细胞膜上的脂质与蛋白，通过溶解膜蛋白而破坏细胞膜破坏细胞膜；解聚细胞中的核解聚细胞中的核蛋白蛋白；SDS能与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性而沉淀蛋白质变性而沉淀。异丙醇沉淀沉淀RNARNA。异戊醇降低分子表面张力降低分子表面张力，所以能减少减少抽提过程中的泡沫泡沫产生；并能促进分相促进分相。DEPCDEPC水水 DEPC(diethypyrocarbonate DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的处理过并经高温高压消毒的MiliQ
12、MiliQ纯水纯水；RNaseRNase强烈抑制剂强烈抑制剂；溶解保存溶解保存RNARNA。无水乙醇沉淀沉淀DNADNA NaACNa+中和DNA分子上的负电荷，促进促进DNADNA沉淀沉淀；促使SDS蛋白复合物溶解度降低。-巯基乙醇抑制RNase的活性；防止酚还原。异硫氰酸胍和-巯基乙醇一起抑制RNase的活性；和SDS一起促使蛋白质变性，分离核酸TETE缓冲液缓冲液 主要成分为Tris-Cl和EDTA，其中Tris-Cl不含金属离子，能较好保证核酸完整性；EDTA能抑制依赖金属离子的核酸酶。不同浓度的NaCl低浓度溶解RNA，高浓度溶解DNA TRIZOL 是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶；主要成分是苯酚；还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制RNase。