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1、关于酶蛋白的化学修饰1第一页，本课件共有77页2概述w酶分子修饰：通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些的特性和功能的技术过程。w作用：提高酶的活力；增强酶的稳定性；降低或消除酶的抗原性；研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响。w方法：酶分子的主链修饰、侧链基团修饰、组成单位置换修饰、金属离子置换修饰、物理修饰等。第二页，本课件共有77页3第一节 酶的化学修饰w从广义上来说，凡通过化学基团的引入或除去使酶的共价结构发生改变，都称为酶的化学修饰w影响酶蛋白化学修饰反应进程的因素主要有两个：1.酶蛋白功能基的反应性；2.修饰剂的反应性。
2、w影响酶蛋白功能基反应性的因素1.微区的极性2.氢键效应3.静电效应4.位阻效应w蛋白质功能基的超反应性：蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应第三页，本课件共有77页4影响超反应性的因素w改变蛋白质功能基的pK值w蛋白质功能基具有较大的亲核性w通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向w试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性w试剂的结合等第四页，本课件共有77页5二、修饰剂反应性的决定因素w选择吸附修饰剂根据各自的特点选择性地吸附在低或高极性区w静电相互作用带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位w位阻因素蛋白质表面的位阻因素或者底物、辅因子、抑制剂所
3、产生的位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应w催化因素修饰部位的其他功能基如果起一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应w局部环境的极性有些有机反应的速度与溶剂的极性有关第五页，本课件共有77页6酶化学修饰的局限性w某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链是绝对专一的化学修饰剂w化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，这种构象的变化将妨碍对修饰结果的解释w酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，但是X-射线衍射结构分析结果表明，其他氨基酸侧链在维持酶的空间构象方面也有重要作用，而且从种属差异的比较分析，它们在进化中是比较保守的。目前还不能用化学修饰的
4、方法研究这些氨基酸残基在酶结构与功能关系中的作用w酶化学修饰的结果对于研究酶结构与功能的关系能提供一些信息，如某一氨基酸被修饰后，酶活力完全丧失，说明该残基是酶活性“必需”的，为什么是必需的，还得用X-射线和其他方法来确定，因此化学修饰法研究酶结构与功能关系尚缺乏准确性和系统性第六页，本课件共有77页7第二节酶分子的主链修饰w利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。w作用：提高酶的催化活性降低或消除酶的抗原性确认酶活性中心在主链上的位置了解主链的不同位置对酶的催化功能的贡献第七页，本课件共有77页8一、主链的切断修饰w酶分子的主链包
5、括肽链和核苷酸链，主链被切断后，可能出现下列三种情况：酶活性中心被破坏，丧失催化功能，用于探测酶活性中心的位置仍维持酶活性中心的空间构象，保持催化功能，但抗原性等特性发生改变，可以提高某些酶（尤其是药用酶）的使用价值。例如：肽链有限水解修饰：采用适当的方法使酶分子的肽链在特定的位点断裂，其分子质量减少，可以在基本保持酶活力的同时使酶的抗原性降低或消失。有利于酶活性中心的形成，可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。例如：生物合成的不显示催化活性的酶原，经过适当的修饰，可以转化为具有催化活性的酶w主链的切断修饰通常使用某些专一性较高的酶作为修饰剂，也可采用其它方法使酶的主链部分水解。第八页，本课
6、件共有77页9二、主链的连接修饰w将两种或两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或者多种催化活性的修饰方法w在一个酶分子上具有两种或者多种催化活性的酶称为多酶融合体w多酶融合体往往是基因融合的产物，通过基因融合技术将两种或两种以上的酶的基因融合在一起形成融合基因，再经过克隆和表达，有可能获得各种多酶融合体第九页，本课件共有77页10第三节酶的侧链基团修饰w采用一定的方法（一般为化学方法）使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法w作用：酶学方面：研究酶分子的结构和功能，如：了解酶分子的构象，研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响，研究酶的
7、活性中心中的必需基团，测定某一种基团在酶分子中的数量酶工程方面：提高酶的活力、增加酶的稳定性、降低酶的抗原性，引起酶催化特性和催化功能的改变，提高酶的使用价值，还可能获得自然界原来不存在的新酶种第十页，本课件共有77页11侧链基团修饰方法w酶有蛋白类酶和核酸类酶两大类，它们的侧链基团不同，修饰方法也有所区别。w酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团，酶RNA的侧链基团是指组成RNA的核苷酸残基上的功能团。w酶的侧链基团修饰方法很多，主要有：氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、胍基修饰、酚基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰、分子内交联修饰、大分子结合修饰等。第十一页，本课件共有77页12一、
8、氨基修饰w采用某些化合物使酶分子侧链上的的氨基发生改变、从而改变酶蛋白的空间构象的方法w凡能够作用于酶分子侧链上的氨基，产生脱氨基作用或与氨基共价结合将氨基屏蔽起来的化合物，称为氨基修饰剂。w如：亚硝酸、2，4-二硝基氟苯（DNFB）、丹磺酰氯（DNS）、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）、苯异硫氰酸酯（PITC）、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。第十二页，本课件共有77页13第十三页，本课件共有77页14二、羧基修饰w采用各种羧基修饰剂与酶蛋白侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应，使蛋白质的空间构象发生改变的方法w可与蛋白质侧链上的羧基发生反应的化合称为羧
9、基修饰剂。w如：碳化二亚胺、重氮基乙酸盐、乙醇-盐酸试剂、异噁唑盐等第十四页，本课件共有77页15第十五页，本课件共有77页16三、巯基修饰w采用巯基修饰剂与酶蛋白中半胱氨酸残基侧链上的巯基结合，使巯基发生改变、从而改变酶的空间构象、特性和功能的修饰方法。w巯基在许多酶中是活性中心的催化基团，亲核性很强，是酶分子中最容易反应的基团之一，对稳定酶的结构和发挥催化功能有重要作用。通过巯基修饰，可显著提高酶的稳定性。w常用的巯基修饰剂有：酰化剂、烷基化剂（如碘乙酸等）、马来酰亚胺、二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠。第十六页，本课件共有77页17第十七页，本课件共有77页18第十八页，本课件
10、共有77页19四、胍基修饰w采用二羰基化合物与精氨酸残基侧链上的胍基反应生成稳定的杂环，从而改变酶分子的空间构象的修饰方法。w用作胍基修饰剂的二羰基化合物主要有：丁二酮1，2-环己二酮丙二酮苯乙二醛4羟基3硝基苯乙二醛对硝基苯乙二醛第十九页，本课件共有77页20第二十页，本课件共有77页21五、酚基修饰w通过修饰剂使酪氨酸残基上的酚基发生改变，从而改变酶分子的空间构象的修饰方法。w可以改变酶的某些动力学特性、提高酶的催化活性、增强酶的稳定性。w包括酚羟基的修饰和苯环上的取代修饰，主要有碘化法、硝化法、琥珀酰化法等，其中四硝基甲烷（TNM）可以高度专一地对酚羟基进行修饰。第二十一页，本课件共有7
11、7页22第二十二页，本课件共有77页23六、咪唑基修饰w通过修饰剂与组氨酸残基上的咪唑基反应，使酶分子中的组氨酸残基发生改变，从而改变酶分子的空间构象的修饰方法w常用的咪唑基修饰剂有：碘乙酸：在近中性pH下对组氨酸残基有较好的专一性，产物在240nm处有最大吸收，可跟踪反应和定量。焦碳酸二乙酯等 碘乙酸和焦碳酸二乙酯都能修饰咪唑环上的两个氮原子，碘乙酸修饰时，有可能将N1取代和N3取代的衍生物分开，观察修饰不同氮原子对酶活性的影响第二十三页，本课件共有77页24第二十四页，本课件共有77页25七、吲哚基修饰 w通过改变色氨酸残基上的吲哚基，从而改变酶分子的空间构象和特性的修饰方法。w色氨酸残基
12、疏水性较强，通常位于酶分子的内部，而且比较不活泼，反应性较差。wN-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以对吲哚基进行修饰，但也可以与酪氨酸反应产生干扰。w2-羟基-5-硝基苄溴（HNBB）和4-硝基苯硫氯可以比较专一地对吲哚基进行修饰，但也可以与巯基反应，因此用于吲哚基修饰时，要对巯基进行保护。第二十五页，本课件共有77页26第二十六页，本课件共有77页27八、分子内交联修饰w含有双功能基团的化合物（即双功能试剂），如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，可以在酶分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，使酶分子的空间构象更为稳定，从而提高酶的稳定性w根据双功能试剂的功能基团的特点，可以分为两端具有相同
13、的功能基团的同型双功能基团化合物两端所含的功能基团不相同的异型双功能基团化合物，可以与酶分子上不同的侧链基团反应，如一端与氨基作用，一端与巯基或羧基作用等w交联剂种类繁多，不同的交联剂具有不同的分子长度，其交联基团、交联速度和交联效果与各不相同，需通过实验选择适宜的交联剂进行分子内交联修饰 第二十七页，本课件共有77页28第二十八页，本课件共有77页29九、大分子结合修饰 w采用水溶性大分子与酶蛋白的侧链基才共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性和功能的方法，是目前应用最广泛的酶分子修饰方法。w采用的修饰剂是水溶性大分子，如聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll
14、）、葡聚糖、环糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等，在使用前一般需要经过活化。w作用：提高酶活力、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性。第二十九页，本课件共有77页30十、亲和修饰w又名专一位点修饰，是指修饰剂只专一地与酶分子某一个位点上的某一个基团发生反应，而与此位点以外的同一种或不同种基团都不发生作用的修饰方法。w为对某一个特定位点的基团进行选择性的修饰，根据酶的底物结构特点和酶的催化机制，研究开发了亲和试剂。w亲和试剂又称为亲和标记试剂，具有与酶作用底物相类似的结构，可以专一性地与酶的活性部位结合，而引起酶活性的不可逆抑制，故又称为专一性不可逆抑制剂。结合型（Ks型）不可逆抑制剂催化型（
15、Kcat型）不可逆抑制剂第三十页，本课件共有77页31第三十一页，本课件共有77页32第三十二页，本课件共有77页33第三十三页，本课件共有77页34第四节酶的组成单位置换修饰w酶分子的基本组成单位包括氨基酸和核苷酸，是酶的化学结构和空间结构的基础。酶分子组成单位的改变将引起酶的化学结构和空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能。w酶蛋白的基本组成单位是氨基酸，将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。w酶RNA的基本组成单位是核苷酸，将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法，称为核苷酸置换修饰。第三十四页，本课件共有77页35一、组成单位
16、置换修饰的作用 w提高酶活力w增强酶的稳定性w使酶的专一性发生改变 二、定点突变技术w定点突变（site directed mutagenesis）是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。w20世纪80年代发展起来，常用于蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰。第三十五页，本课件共有77页36定点突变技术用于酶分子修饰的过程w新的酶分子结构的设计w突变基因碱基序列的确定w突变基因的获得根据设计，用DNA合成仪合成有1-2个碱基被置换了的寡核苷酸，再以此为引物通过聚合酶链反应（PCR）或M13质粒等定位突变技术获得所需的大
17、量突变基因。聚合酶链反应技术简称PCR（polyme rase chain reaction）技术，是一种DNA扩增技术，其基本过程包括：双链DNA的热变性（解链），引物与单链DNA的退火结合，引物的延伸等3个步骤。w新酶的获得第三十六页，本课件共有77页37金属离子置换修饰 w把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的功能和特性发生改变的修饰方法w作用：了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，有利于阐述酶的催化作用机制，并可能提高酶活力，增强酶的稳定性，甚至改变酶的某些动力学性质。第三十七页，本课件共有77页38w1.提高酶活力w例如，-淀粉酶分子中大多数含有钙离子，有些则含有镁离子或锌离
18、子等其他离子，所以一般的-淀粉酶是杂离子型的。如果将其他杂离子都换成钙离子，则可以提高酶活力并显著增强酶的稳定性。结晶的钙型-淀粉酶的活力比一般结晶的杂离子型-淀粉酶的活力提高3倍以上，而且稳定性大大增加。w再如，将锌型蛋白酶的锌离子除去，添加一定量的钙离子，置换成钙型蛋白酶，其活力可以提高20-30%。w2.增强酶的稳定性w例如，铁型超氧化物歧化酶(Fe-SOD)分子中的铁离子被锰离子置换，成为锰型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)后，其对过氧化氢的稳定性显著增强，对叠氮钠(NaN3)的敏感性显著降低。w3.改变酶的动力学特性w例如，酰基化氨基酸水解酶的活性中心含有锌离子，用钴离子置换后，其催化
19、N-氯-乙酰丙氨酸水解的最适pH值从8.5降低为7.0，同时该酶对N-氯-乙酰蛋氨酸的米氏常数Km增大，亲和力降低。第三十八页，本课件共有77页39金属离子修饰的过程：w在经过分离纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。w通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。w用一定量的另一种金属离子加到酶液中酶蛋白与新加入的金属离子结合，得到经过金属离子置换后的酶。第三十九页，本课件共有77页40第五节酶分子的物理修饰w通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为酶分
20、子的物理修饰。第四十页，本课件共有77页41物理修饰的作用w了解在不同物理条件下，特别是在高温、高压、高盐、低温、真空、失重、极端pH值、有毒环境等极端条件下，由于酶分子空间构象的改变而引起的酶的特性和功能的变化情况。w极端条件下酶催化特性的研究对于探索太空、深海、地壳深处以及其他极端环境中，生物的生存可能性及其潜力有重要的意义。w有可能获得在通常条件下无法得到的各种酶的催化产物。w酶分子的物理修饰同样可能提高酶的催化活性、增强酶的稳定性，或者改变酶的催化动力学特性。第四十一页，本课件共有77页42酶分子物理修饰的特点w1.不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素
21、的作用下，副键发生某些变化和重排，使酶分子的空间构象发生改变。例如，羧肽酶经过高压处理，底物特异性发生改变，其水解能力降低，而有利于催化多肽合成反应；用高压方法处理纤维素酶，该酶的最适温度有所降低，在3040的条件下，高压修饰的纤维素酶比天然酶的活力提高10%。第四十二页，本课件共有77页43酶分子物理修饰的特点w2.在某些变性剂的作用下，首先使酶分子原有的空间构象破坏，然后在不同的物理条件下，使酶分子重新构建新的空间构象。例如，先用盐酸胍使胰蛋白酶的原有空间构象破坏，通过透析除去变性剂后，再在不同的温度条件下，使酶重新构建新的空间构象。结果表明，20的条件下重新构建的胰蛋白酶与天然胰蛋白酶的
22、稳定性基本相同，而在50的条件下，重新构建的胰蛋白酶的稳定性比天然酶提高5倍 第四十三页，本课件共有77页44 第六节酶分子修饰的应用在酶学研究方面的应用w1.酶的活性中心研究w2.酶的空间结构研究w（1）采用具有荧光特性的修饰剂对酶分子的侧链基团进行修饰，借助荧光光谱研究，可以分子各基团在酶分子中的空间分布情况，了解在溶液中酶分子的空间构象。w（2）采用巯基修饰剂进行修饰，可以了解酶分子中半胱氨酸的数目及其分布情况，确定肽链的数目和二硫键的数目。第四十四页，本课件共有77页453.酶的作用机制研究w通过酶分子修饰作用，可以了解各种残基及其侧链基团在催化过程中的作用。w研究酶的作用机制常用的修
23、饰方法：w（1）亲和标记法w（2）差别标记法w（3）氨基酸置换法w（4）核苷酸置换修饰第四十五页，本课件共有77页46（1）亲和标记法w通过亲和标记试剂对酶分子进行修饰的方法称为亲和标记法。w与酶分子的某一特定部位（通常是酶的活性部位）有特异的亲和力，可以与这个特殊部位结合而进行酶分子修饰的试剂称为亲和标记试剂。第四十六页，本课件共有77页47（2）差别标记法w在酶的作用底物或竞争性抑制剂存在的条件下，对酶分子进行修饰，由于底物或竞争性抑制剂对酶分子活性中心上的结合基团有保护作用，使之不被修饰；然后除去底物或竞争性抑制剂，再用带有放射性同位素标记或荧光标记的修饰剂进行修饰，则原来受到底物或竞争
24、性抑制剂保护的基团带上放射性标记或荧光标记，经过检测，可以知道活性中心上的结合基团。第四十七页，本课件共有77页48（3）氨基酸置换法w通过定点突变技术或化学方法，将酶蛋白分子中的某个氨基酸残基置换为另一种氨基酸残基，观察其对酶催化反应的影响和变化，从而分析、了解该氨基酸残基在酶催化过程中的作用。第四十八页，本课件共有77页49（4）核苷酸置换修饰w通过定点突变技术，将酶RNA分子中的某个核苷酸残基置换为另一个核苷酸残基，观察其对酶催化反应的影响和变化，从而分析、了解该核苷酸残基在酶催化过程中的作用。第四十九页，本课件共有77页50二、在医药方面的应用w1.降低或者消除酶抗原性例如：（1）具有
25、抗癌作用的精氨酸酶经聚乙二醇结合修饰，其抗原性被消除；（2）对白血病有显著疗效的L-天冬酰胺酶经聚乙二醇结合修饰后，使抗原性显著降低甚至消除。第五十页，本课件共有77页512.增强医药用酶的稳定性w（1）溶菌酶经过氨基酸置换修饰，分子中第3位的异亮氨酸置换成半胱氨酸后，可以与第97位的半胱氨酸形成二硫键，修饰后的T4-溶菌酶活力保持不变，但对热的稳定性却大大提高。w用O-甲基异脲修饰溶菌酶，使酶分子中的赖氨酸残基上的-氨基与它结合，将氨基屏蔽起来，修饰后酶的稳定性显著增强。w（2）有抗氧化、抗辐射、抗衰老功能的超氧化物歧化酶，经过大分子结合修饰，形成聚乙二醇-超氧化物歧化酶，其稳定性显著提高，
26、在血浆中的半衰期可以延长350倍。w（3）对青霉素酰化酶采用葡聚糖二乙醛进行分子内交联修饰后，在55条件下的半衰期延长9倍，而其最大反应速度不改变。w（4）用亚硝酸修饰L-天冬酰胺酶，使其氨基变成羟基，酶的稳定性大大提高，在体内的半衰期延长2倍。第五十一页，本课件共有77页52三、在工业方面的应用w1.提高工业用酶的活力(1)胰蛋白酶经大分子结合修饰后，活力提高5.1倍(2)淀粉酶通过金属离子置换修饰，置换为钙型后，活力提高3倍以上(3)锌型蛋白酶中的锌置换成钙型蛋白酶后，活力提高20%-30%第五十二页，本课件共有77页53三、在工业方面的应用w2.增强工业用酶的稳定性(1)木瓜蛋白酶、菠萝
27、蛋白酶、胰蛋白酶、-淀粉酶、-淀粉酶等经大分子结合修饰，稳定性均显著提高(2)胰蛋白酶在不同温度下重新构建后，稳定性提高5倍w3.改变酶的动力学特性如葡萄糖异构酶经琥珀酰化修饰后，最适pH值下降.5，并增强稳定性，有利于果葡糖浆和果糖的生产。第五十三页，本课件共有77页54四、在抗体酶研究开发方面的应用 w抗体酶(abzyme)又称为催化性抗体(catalytic antibody)，是一类具有催化功能的抗体。w抗体酶可以通过诱导法或修饰法产生。诱导法是在免疫系统中采用半抗原或酶抗原进行诱导而产生。修饰法是将抗体进行分子修饰，在抗体和抗原的结合部位引进催化基团，而成为具有催化活性的抗体酶。第五
28、十四页，本课件共有77页55四、在抗体酶研究开发方面的应用修饰法产生抗体酶的方法w氨基酸置换修饰：采用定点突变技术，将抗体与抗原结合部位的某个氨基酸残基置换成另一个氨基酸残基，从而使抗体分子具有催化活性。w侧链基团修饰：将抗体和抗原结合部位上的某个基团进行修饰，从而使抗体具有催化活性。第五十五页，本课件共有77页56五、在核酸类酶人工改造方面的应用 w核酸类酶(ribozyme)的结构由催化结构域和底物结合结构域两部分组成，除了保守核苷酸以外，其它的核苷酸都可以进行修饰。w采用核苷酸置换修饰，将保守核苷酸以外的某个或某些核苷酸置换，就可以获得各种不同的人造核酸类酶。w对某些核苷酸残基进行修饰，
29、连接上氨基酸等有机化合物，就可能扩展核酸类酶的结构多样性，从而扩展其催化功能，提高酶的催化活力。第五十六页，本课件共有77页57五、在核酸类酶人工改造方面的应用w具有催化能力的单链DNA分子称为脱氧核酸类酶(deoxyribozyme)w单链DNA分子与RNA分子的主要区别有两点：RNA分子中含有尿嘧啶，而DNA分子中含有胸腺嘧啶；RNA分子中含有2-OH，而DNA分子中没有。w如果采用核苷酸置换修饰，通过定位突变技术将RNA分子中的尿苷酸置换为胸苷酸，再采用侧链基团修饰，脱去RNA分子中的2-OH，则核酸类酶可能成为脱氧核酸类酶w如果通过侧链基团修饰，将一部分2-OH去除，就可以获得含有一部
30、分脱氧核苷酸的核酸类酶，有可能使其稳定性得到提高。第五十七页，本课件共有77页58六、在有机介质酶催化反应中的应用 w由于酶粉一般不溶于有机溶剂，难以均匀分布，致使酶在有机介质中的催化效率降低。w若对酶分子进行侧链基团修饰，使酶分子表面的基团增强疏水性，就可能使酶溶于有机溶剂，均匀在溶剂中，以提高酶的催化效率和稳定性。w例如：采用单甲氧基聚乙二醇对脂肪酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等酶分子表面的氨基进行共价结合修饰，可使酶均一地溶于苯和氯仿等有机溶剂，并具有较高的催化活性和稳定性。第五十八页，本课件共有77页59第五十九页，本课件共有77页60脂肪酶改性对其在有机相中催化特性的影响w 很多化合物都
31、有立体异构体，由于同种药物(包括农药、兽药)的左旋与右旋异构体的生理活性多有不同，其药效甚至相反，因此，人们对光学纯药物的研制越来越重视。其中，有机相体系酶催化技术对光学活性化台物的制备越显重要。至今约有20种酶（包括脂肪酶、蛋白酶、羧酯酶、乙醇脱氢酶)在此领域中得到应用。其中脂肪酶价格便宜，能催化多种反应，并具备固有的界面催化能力第六十页，本课件共有77页61w尽管在有机相体系中酶催化不对称合成有着众多的优点，但它也有一个致命的缺点即在有机溶剂中不易分散，因而催化效率较低本文将就通过酶的修饰、酶的印迹、酶的纯化方式与预处理过程、酶的固定化，以提高酶的催化效率与立体选择性方面，对脂肪酶改性及其
32、在有机相中的催化特性之影响作一综述第六十一页，本课件共有77页621.脂肪酶的修饰w为克服酶在有机溶剂中的聚集作用学者们想到了将酶作恰当修饰使之能很好地分散于疏水溶剂中目前已有的方法包括脂包被、表面活性剂包被与修饰、聚合物修饰、脱氧胆酸盐 等非共价修饰四种 w 第一种方法是用脂包被修饰酶Okahata 等合成了一种脂类分子，结构式如下：第六十二页，本课件共有77页63w该分子有一个亲水的头部和一个疏水的尾部，它既可与酶分子结合，又可与有机溶剂结台 根据酶的不同分子量，大约150250分子的脂与一分子的脂肪酶形成复合体该复合体催化各种醇与酸的酯化反应时的对映体选择性不同，如催化1一苯乙醇与十二烷
33、酸的酯化反应的E（enantioselectivity)值为250，而催化2-壬醇与丁酸的酯化反应的E值仅为2 4第六十三页，本课件共有77页64w脂包被的脂肪酶已受到人们的日益重视Okahata等系统地研究了不同来源的脂肪酶，不同类型的脂(非离子型、阳离子型，阴离子型、兼性离子型)，以及系统中含水量和底物对脂肪酶催化特性的影响，得出了如下结论 w非离子型头部的脂包被的酶催化反应速率高，酶脂复合物产量也高 w在一定范围内，脂酶复合物中脂酶比值越高该复合物产量越高酶活性越低Goto得到了量化结果，即该比值达40时，反应速率最高 第六十四页，本课件共有77页65w脂酶复合物在非卤化的非极性溶剂中(
34、如二异丙基醚苯)酶活较高；在卤化的非极性溶剂中(如氯仿，二氯甲烷)复合物能溶解，但无活性：在极性溶剂中(如乙醇)，复合物不能溶解也没有酶活Goto等比较了10种溶剂，若以异辛烷溶剂中酶的相对活性为l，则另外9种溶剂中酶的相对活性分别为：环已烷08：正十二烷07；正辛烷04；正已烷035；苯0.18；甲苯002：乙醇、乙腈与氯仿为0 w有机溶剂中加了分子筛后，10h之内，产物即达100%不加分子筛，产物的量只能达到70%，2O h之后再加进分子筛，再过1 0 h后产物又达100%第六十五页，本课件共有77页66w表面活性剂包被与修饰是脂肪酶修饰的第二种方法，Goto等得到了与Okahata很相似
35、的结果(表1)第六十六页，本课件共有77页67w由表1可知，非离子型表面活性剂与酶结合后，效果比另外三种类型均好得多而同为非离子型，疏水结构部分含两个油酸残基的比含一个残基的要优越一些。当碳原子数相同时，分子结构中含分支或双键的表面活性剂要比无支链、不含双键的优越阴离子型表面活性剂，由于与脂肪酶之间存在巨大斥力而无法形成脂酶复合物第六十七页，本课件共有77页68w Goto等确立了表面活性剂包被酶的制备方法，并发现不同来源的脂肪酶经表面活性剂包被后，其酶活不同同一种酶经表面活性剂包被与反向胶束处理与分散的酶粉相比其转化率也不同 wGoto等以脂肪酶催化苯甲醇与月桂酸的酯化反应为模型，研究了表面
36、活性剂包被的脂肪酶催化反应动力学，结果发现其反应机理符合乒乓双双机理动力学测定发现，表面活性剂包被的脂肪酶比未包被的酶粉，反应速率提高了100倍之多Goto等认为，在均相有机介质中对表面活性剂包被的脂肪酶进行动力学研究也可用以预测并解释酶的专一性。这弥补了脂肪酶因难以制成晶体而较难利用X射线结晶法研究其结构与功能关系的缺陷第六十八页，本课件共有77页69wTsuzuki等发现,用人工合成的去污剂修饰的脂肪酶可用于催化糖脂的合成修饰酶有效地解决了酶在有机溶剂中不稳定的问题该文第一次报道修饰过的脂肪酶能在有机溶剂中将糖高效率地转化为相应的糖脂他们所用的去污剂是双十二烷基葡糖基谷氨酸第六十九页，本课
37、件共有77页70w第四种方法是非共价修饰Wu等发现用脱氧胆酸钠与醚醇有机溶剂（1：1VV)处理后CCL构象打开，并重新折迭而形成更稳定的构象称之为A型CCL用SP-Scphadex G-50层析纯化的酶被称为B型CCLA型CCL与B型CCL在化学结构上完全相同物理性质(圆盘电泳、SDS电泳、CD谱、UV谱)也相同，唯一不同的是其对映体选择性他们还发现，当CCL水解芳基丙酸酯与苯氧基丙酸酯时粗酶及B型酶的E值仅为10，而A型酶的E值100进一步研究发现，A型酶之所以对映体选择性显著升高，是由于酶蛋白分子非共价修饰造成的第七十页，本课件共有77页712.酶分子的生物印迹w Russell等提出了生
38、物印迹的修饰方法w此法的基本过程为：将酶溶于含有其配体(通常为其底物或底物类似物或竞争性抑制剂)的缓冲溶液中，使其构象发生改变，而有利于与其底物结合。再将此酶液冷冻干燥形成酶粉。用有机溶剂(常为无水乙腈)冲洗冻干酶粉除去配体后。将其过滤并真空干燥。在无水或微水有机溶剂中，由于酶的记忆功能，这种新构象仍能保持，致使结合配体的能力大大提高。此法的基本原理是酶在有机溶剂中具有刚性构象。但在水中，印迹效应荡然无存。印迹酶在有机溶剂中对新构象的记忆时间相当长（可达几周）。第七十一页，本课件共有77页72wBraco等口“用配体L酒石酸或对羟基苯甲酸在异丙醚溶剂中将BSA印迹，发现印迹后的BSA在无水有机
39、溶剂中对配体的结合能力比未印迹过的BSA提高了30倍。wDahulis等用L-苹果酸作配体印迹BSA与溶菌酶，效果类似，并发现4真空中保存印迹酶4周后，其配体结台能力仍无大的变化。他们还考察了不同溶剂条件下，印迹的BSA对苹果酸的结合能力。结果表明，其结合能力差异甚大。而且，这种结合能力与溶剂的LogP值、介电常数、偶极矩都无系统相关性。但与溶剂的氢键参数有很好的相关性，即溶剂作为氢键受体的倾向越大，印迹酶在该溶剂中与配体的结合能力越小。不同的酶对同一配体的结台能力与同一酶对不同配体的结合能力都不同。第七十二页，本课件共有77页73w印迹可极大地提高脂肪酶的对映体选择性，包被的作用主要是维持印
40、迹效应，印迹方法与脂包被法结合使用可广泛应用于有机相的酶催化反应。以提高反应的对映体选择性。第七十三页，本课件共有77页743 酶晶体的交联w Richard及其合作者于1964年首次用戊二醛交联羧肽酶A的晶体，Sobdov等发现此法只能保留30%的酶活。由于高度纯化酶不稳定，比活低且代价高，研究者始终没有停止过该法的改进。Lalonde等将交联的脂肪酶晶体用于十几种手性酯的拆分，发现酶的对映体选择性大大提高，不仅如此，交联酶还具有以下特点：既不溶于水也不溶于有机溶剂回收方便稳定性比游离酶粉高23个数量级大孔结构，溶剂、底物和产物的扩散阻力小。w 众多研究表明，此法不仅能用于脂肪酶，其他酶如果
41、糖二磷酸醛缩酶，thermolysin交联后，其冻干酶颗粒可在室温下贮存相当长时间且能耐受相当苛刻的条件。第七十四页，本课件共有77页754脂肪酶的纯化及预处理w利用粗酶制剂进行有机相的酶催化反应时，由于其经常含有杂酶而造成光学产量低重复性差因此，粗酶的纯化很重要，纯化常采用以下步骤：加入某种化学试剂(如丝氨酸蛋白酶抑制剂)使杂酶失活，用物理方法（如蛋白质的部分纯化，冷冻于燥）除去或选择性失活杂酶w Tsai等以CRL催化消旋的2(4氯苯氧基)丙酸与正丁醇的酯化反应为模型反应，考察了酶纯化对提高反应速度与对映体选择性的影响结果发现，当以无水正庚烷为溶剂时，纯化酶活性比粗酶低当向体系中加入少量水时，纯化酶活性显著提高，但粗酶活性变化不大(表4)第七十五页，本课件共有77页76第七十六页，本课件共有77页感感谢谢大大家家观观看看第七十七页，本课件共有77页