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1、关于流式细胞仪结果分析第一页，本课件共有71页流式细胞术流式细胞术(flow cytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。的新技术。流式细胞术流式细胞术第二页，本课件共有71页 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定
2、量分析或纯化分选。对细胞进行定量分析或纯化分选。特点：检测速度快、检测通量高、单细胞多参数的检测特点：检测速度快、检测通量高、单细胞多参数的检测流式细胞术的特点流式细胞术的特点第三页，本课件共有71页 流式细胞仪流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、物理或化学性质（如大小、内部结构、DNADNA、RNARNA、蛋白质、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。流式流
3、式细胞仪流式细胞仪仪流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪第四页，本课件共有71页样本来源：各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等。检测大小：一般是0.5um40um流式细胞仪可以做什么？流式细胞仪可以做什么？第五页，本课件共有71页液流系统液流系统光学系统光学系统数据处理系统数据处理系统 分析型流式细胞仪分选系统分选系统分选型流式细胞仪流式细胞仪的组成流式细胞仪的组成第六页，本课件共有71页（1）液流 液流系统液流系统流动室流动室流动室（Flow cell）是液流系统的核心部件，流动室是由石英玻璃制成，单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕通过流动室内一定孔径的
4、孔，检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交。第七页，本课件共有71页层流水力聚焦技术第八页，本课件共有71页光学系统光学系统Light scattering at FSC represents the particle size and areaLight scattering at SSC depends on granularity and complexity of the particle第九页，本课件共有71页激光光源：气冷式氩离子激光器激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长分色反光镜：反射长/短波长，通过短短波长，通过短/长波长长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜光束
5、成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通滤片：长通、短通、带通光电倍增管：光电倍增管：FS,SSFS,SS（散射光），（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）（荧光）光学系统光学系统第十页，本课件共有71页FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光学系统示意图光学系统示意图第十一页，本课件共有71页主要由计算机及其软件组成主要由计算机及其软件组成（3）数据处理系统第十
6、二页，本课件共有71页基本工作原理基本工作原理第十三页，本课件共有71页单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本过程基本过程第十四页，本课件共有71页 细胞在液柱中与激光束相交时向细胞在液柱中与激光束相交时向周围周围360立体角方向散射的光线信号，立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为颗粒折射等有关，主要分为前向散射前向散射光光和侧向散射光侧向散射光。二、散射光的测定二、散射光的测定
7、第十五页，本课件共有71页第十六页，本课件共有71页前向散射光前向散射光（forward scatter,forward scatter,FSFS）：激光束照射细胞时，光以激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度相对轴较小角度(0.5(0.510)10)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。第十七页，本课件共有71页FALS SensorLaser前向散射光示意图前向散射光示意图第十八页，本课件共有71页侧向散射光（side scatter,SS）：激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号
8、，用于检测细胞内部结构属性。第十九页，本课件共有71页FALS Sensor90LS SensorLaser侧向散射光侧向散射光示意图示意图第二十页，本课件共有71页 测得的测得的FSFS与与SSSS信号信号通过计算机处理，可得通过计算机处理，可得到到FS-SSFS-SS图，由此可仅图，由此可仅用散射光信号对未染色用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分的活细胞进行分析或分选。选。此为血细胞分类此为血细胞分类的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
9、从非均一群体中鉴别出某些亚群 第二十一页，本课件共有71页荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。特征。线性放
10、大器和对数放大器线性放大器和对数放大器三、荧光测量三、荧光测量第二十二页，本课件共有71页荧光染料的特性荧光染料的特性激发波长激发波长(EXCITING)(EXCITING)发射波长发射波长(EMISSION)(EMISSION)第二十三页，本课件共有71页第二十四页，本课件共有71页荧光补偿荧光补偿第二十五页，本课件共有71页 通过流式细胞仪进行细胞分选主通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。步培养和研究时进行的。四、细胞分选原理四、细胞分选原理第二十六页，本课件共有71页细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振
11、动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电（一）分选基本原理（一）分选基本原理第二十七页，本课件共有71页分选速度：分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。的含量成正比。分选纯度：分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。率。分选收获率：分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。选细
12、胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。选速度成反比。（二）分选的技术要求（二）分选的技术要求第二十八页，本课件共有71页参数：参数：FS,SS,FLFS,SS,FL数据显示方式数据显示方式 （单参数直方图（单参数直方图 、双参数散点图、双参数散点图 、二维等高图、二维等高图 、假三维等高图假三维等高图 、三参数散点图、三参数散点图 ）设门分析技术设门分析技术 第二节第二节 数据的显示与分析数据的显示与分析第二十九页，
13、本课件共有71页FSFS：反映颗粒的大小：反映颗粒的大小SSSS：反映颗粒的内部结构复杂程度：反映颗粒的内部结构复杂程度FLFL：反映颗粒被染上的荧光数量多少：反映颗粒被染上的荧光数量多少一、一、参数参数第三十页，本课件共有71页单参数直方图单参数直方图双参数直方图双参数直方图:点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图三参数直方图三参数直方图多参数分析多参数分析直分析方图直分析方图设门分析设门分析:REGION和和GATE设置设置二、数据显示方式二、数据显示方式第三十一页，本课件共有71页 由一维参数由一维参数(散射光或荧光散射光或荧光)与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成，
14、反映同样散构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。射光或荧光强度的颗粒数量的多少。（一）单参数直方图（一）单参数直方图第三十二页，本课件共有71页单参数直方图单参数直方图细细胞胞相相对对数数量量信道信道(channel(channel )第三十三页，本课件共有71页双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，
15、每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。少。（二）双参数直方图（二）双参数直方图第三十四页，本课件共有71页1.双参数直方图点图双参数直方图点图绿色荧光强度绿色荧光强度红红色色荧荧光光强强度度第三十五页，本课件共有71页双参数直方图点图双参数直方图点图第三十六页，本课件共有71页2.二维等高图二维等高图由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相
16、对或绝对数，即“等高等高”。曲线层次越高曲线层次越高(越里面的线越里面的线)所代表的细胞数愈多。所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。第三十七页，本课件共有71页二维等高图二维等高图第三十八页，本课件共有71页3.假三维等高图假三维等高图第三十九页，本课件共有71页（三）三参数直方图（三）三参数直方图第四十页，本课件共有71页 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。和散射光信号可根据需要进行组合分析。（四）流式细胞仪
17、的多参数分析（四）流式细胞仪的多参数分析第四十一页，本课件共有71页 Gate Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。多边形门、任意形状门和十字门。三、设门分析技术三、设门分析技术第四十二页，本课件共有71页A A
18、淋巴细胞淋巴细胞B B 单核细胞单核细胞C C 中性粒细胞中性粒细胞A A、B B、C C均为均为任意门任意门第四十三页，本课件共有71页线性门线性门第四十四页，本课件共有71页Region设置设置:区阈（区阈（region,R）与门）与门(gate,G)是两个相关的概念，区阈可与门对是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。应，但是也可以包含于门。第四十五页，本课件共有71页D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4-/CD3-D4 CD4-/CD3+如十字门分析时，起就可如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。
19、第四十六页，本课件共有71页第四节第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求流式细胞仪免疫分析的技术要求 样本制备样本制备标记染色标记染色液相芯片技术液相芯片技术 质量控制质量控制 第四十七页，本课件共有71页外周血淋巴细胞样品的制备外周血淋巴细胞样品的制备分离单个核细胞分离单个核细胞培养细胞的样品制备培养细胞的样品制备 蛋白酶消化蛋白酶消化 机械吹打机械吹打 使贴壁细胞脱落使贴壁细胞脱落 洗涤洗涤 尼龙网过滤尼龙网过滤单细胞悬液单细胞悬液一、免疫检测样品制备一、免疫检测样品制备第四十八页，本课件共有71页新鲜实体组织单细胞悬液的制备新鲜实体组织单细胞悬液的制备机械法机械法酶处理法酶处理法化学试剂处
20、理法化学试剂处理法表面活性剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液的保存单细胞悬液的保存深低温保存法（一年）深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周）甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）第四十九页，本课件共有71页适用条件适用条件:有较高的量子产额和消光系数有较高的量子产额和消光系数对对488nm488nm的激发光波长有较强的吸收的激发光波长有较强的吸收发射光波长与激发光波长间有较大的波长差发射光波长与激发光波长间有较大的波长差易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性二、常用的荧光染料与标记染色二、常用的荧光染料与标记
21、染色第五十页，本课件共有71页FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光细细胞胞悬悬液液异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素得州红得州红能量传递复合染料能量传递复合染料藻胆蛋白类藻胆蛋白类（一）几种常见的荧光染料（一）几种常见的荧光染料第五十一页，本课件共有71页名称名称染料染料激发激发波长波长荧光颜荧光颜色色溶解性溶解性对对PHPH敏感敏感性性特点特点异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素FITCFITC488488绿绿 525525易易敏感敏感易溶于水，与抗体结易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响特异性得州
22、红得州红Texas Texas redred568568红红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶联后量子产稳定，偶联后量子产额低额低藻红蛋白藻红蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具较多发光基团，消具较多发光基团，消光系数和量子产额高光系数和量子产额高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488别藻青蛋白别藻青蛋白APCAPC633633红红670670能量传递复能量传递复合染料合染料PEcy5PEcy5488488红红670670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，成本高常用的几类荧光染料常用的几类荧光染料第五十二页，本课件共有71页 用化学法将两种不同激发波长的染料
23、结合在一起，在用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm488nm激发光照激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。能量传递复合染料能量传递复合染料第五十三页，本课件共有71页PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷花青苷5 5藻红蛋白藻红蛋白能量传递复合染料机制能量传递复合染料机制第五十四页，本课件共有71页荧光染料与细胞成分的四种结合方式荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式结构
24、亲和式嵌入结合嵌入结合共价键结合共价键结合荧光标记抗体特异性结合荧光标记抗体特异性结合免疫荧光标记方法免疫荧光标记方法直标直标:干扰少干扰少,但需购买多种单抗但需购买多种单抗间标间标:步骤多步骤多,干扰多干扰多,不需标记多种抗体不需标记多种抗体组合标记组合标记（二）免疫荧光标记（二）免疫荧光标记第五十五页，本课件共有71页免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性
25、地结合，经激光照射后不液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有检测速度极快，所以又有“液相芯片液相芯片”之称之称 。三、免疫胶乳颗粒技术的应用三、免疫胶乳颗粒技术的应用第五十六页，本课件共有71页微小的乳胶微球分别染成上百种微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）颜色来编码）第五十七页，本课件共有71页第五十八页，本课件共
26、有71页通过对标记不同荧光素分子的检测，实通过对标记不同荧光素分子的检测，实现现FCMFCM对可溶性物质的定量分析对可溶性物质的定量分析第五十九页，本课件共有71页四、流式细胞免疫学技术的质量控制四、流式细胞免疫学技术的质量控制适当的制备方式适当的制备方式处理红细胞处理红细胞实体组织来源标本用机械法实体组织来源标本用机械法温度温度25253737，pH7.0pH7.07.27.2（一）单细胞悬液制备的质控（一）单细胞悬液制备的质控第六十页，本课件共有71页温度温度pHpH染料浓度染料浓度固定剂固定剂（二）免疫荧光染色的质控（二）免疫荧光染色的质控第六十一页，本课件共有71页光路与流路校正光路与
27、流路校正:确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CVCV）。）。PMTPMT（光电倍增管）校准（光电倍增管）校准:保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。工作状态。绝对计数校准绝对计数校准:保证计数的准确性。保证计数的准确性。Flow-checkFlow-checkFlow-setFlow-setFlow-count（三）仪器操作的质控（三）仪器操作的质控第六十二页，本课件共有71页同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单未标记单抗抗作为对照
28、调整和设置电压，以保证特异性。作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。果可靠。（四）免疫检测的质控（四）免疫检测的质控第六十三页，本课件共有71页第四节第四节 在免疫学检验中的应用在免疫学检验中的应用 流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对细胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细胞的胞表面的抗原成分进行标记分析，可区别多种细
29、胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。第六十四页，本课件共有71页T T淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其亚群分析淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):产生产生IgM型自身抗体型自身抗体,参与免疫调节、与自身免疫参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关病的发生有关B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激受外来抗原刺激,产生高亲和性特异性抗体产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析细胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴细胞及其亚群的分
30、析一、淋巴细胞及其亚群的分析第六十五页，本课件共有71页二、淋巴细胞功能分析二、淋巴细胞功能分析细胞介导细胞毒性试验细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例死细胞与活细胞比例)细胞内细胞因子测定细胞内细胞因子测定三、淋巴造血系统及白血病免疫分型三、淋巴造血系统及白血病免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变留病变第六十六页，本课件共有71页CD4+Th细胞、细胞、CD4+/CD8+比例比例MDR(+)表示对化疗药物耐药表示对化疗药物耐药四、肿瘤耐药基因分析四、肿瘤耐药基因分析五、五
31、、AIDS病检测中的应用病检测中的应用第六十七页，本课件共有71页HLA-B27可出现在可出现在58%97%的强直性的强直性脊椎炎脊椎炎(As)患者患者六、自身免疫病相关六、自身免疫病相关HLAHLA抗原分析抗原分析第六十八页，本课件共有71页七、移植免疫中的应用七、移植免疫中的应用 FCM作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，作为一个强大的技术平台，已应用于多个领域，其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移其在移植免疫分析中的应用也越来越广泛。目前移植免疫中的植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配应用主要包括流式细胞术的交叉配型（型（Flow cytometry cross-
32、matching,FCXM）和）和群体反应性抗体（群体反应性抗体（Panel reactive antibody,PRA）检测。）检测。第六十九页，本课件共有71页思考题1.流式细胞仪的分析检测原理是什么？2.流式细胞仪分析中前向散射光、侧向散射光和荧光的检测意义。3.何谓荧光补偿？何谓“液相芯片”技术？4.细胞分选的基本原理。5.FCM分析中有哪些数据显示方式，如何解读结果及其设门分析的意义？6.如何进行FCM分析检测样品的制备？7.流式细胞分析前如何验证仪器工作状态，采用何种校正物？8.流式细胞免疫分析的质量控制包括哪些方面？9.流式细胞术有哪些临床应用价值？10.流式细胞仪分析中常见的荧光素有那些？他们的特性如何？第七十页，本课件共有71页感谢大家观看第七十一页，本课件共有71页