蛋白质的裂解精选课件.ppt

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1、关于蛋白质的裂解第一页，本课件共有47页 用用用用EdmanEdman降解法测多肽链的氨基酸顺序，一次只能连续降降解法测多肽链的氨基酸顺序，一次只能连续降降解法测多肽链的氨基酸顺序，一次只能连续降降解法测多肽链的氨基酸顺序，一次只能连续降解数十个残基，用手工方法最多测二十多个残基。然而，自解数十个残基，用手工方法最多测二十多个残基。然而，自解数十个残基，用手工方法最多测二十多个残基。然而，自解数十个残基，用手工方法最多测二十多个残基。然而，自然界蛋白质的分子量通常在一万以上，因此在测多肽链顺序然界蛋白质的分子量通常在一万以上，因此在测多肽链顺序然界蛋白质的分子量通常在一万以上，因此在测多肽链顺

2、序然界蛋白质的分子量通常在一万以上，因此在测多肽链顺序时，需将它们先裂解成一系列小肽，分别测出它们的顺序，时，需将它们先裂解成一系列小肽，分别测出它们的顺序，时，需将它们先裂解成一系列小肽，分别测出它们的顺序，时，需将它们先裂解成一系列小肽，分别测出它们的顺序，然后再找出它们的接头位置，才能定出该肽链的顺序。所以然后再找出它们的接头位置，才能定出该肽链的顺序。所以然后再找出它们的接头位置，才能定出该肽链的顺序。所以然后再找出它们的接头位置，才能定出该肽链的顺序。所以如何选择肽链裂解的切点，将对顺序测定起着重要作用如何选择肽链裂解的切点，将对顺序测定起着重要作用如何选择肽链裂解的切点，将对顺序测

3、定起着重要作用如何选择肽链裂解的切点，将对顺序测定起着重要作用裂解条件要求：裂解条件要求：裂解条件要求：裂解条件要求：裂解点少裂解点少裂解点少裂解点少 专一性强专一性强专一性强专一性强 反应产率高反应产率高反应产率高反应产率高 裂解方法：裂解方法：裂解方法：裂解方法：酶法酶法酶法酶法 化学法化学法化学法化学法 酶解和化学裂解是顺序分析中互为补充缺一不可的手段酶解和化学裂解是顺序分析中互为补充缺一不可的手段酶解和化学裂解是顺序分析中互为补充缺一不可的手段酶解和化学裂解是顺序分析中互为补充缺一不可的手段一、一、引引 言言早期：早期：部分酸水解法裂解，由于专一性 低，裂解后生成很多小肽，造成 分离纯

4、化困难，工作量也很大。中期中期：生化学家改用蛋白酶酶解，因专 一性强，故被广泛地使用。后来：后来：随着自动顺序仪的广泛使用和对 大肽段的需求，发现某些化学试 剂对蛋白质的裂解有特异的优点。化学法再流行。第二页，本课件共有47页（）简述（）简述（）简述（）简述 用特异性水解酶裂解肽链有许多优点：用特异性水解酶裂解肽链有许多优点：用特异性水解酶裂解肽链有许多优点：用特异性水解酶裂解肽链有许多优点：专一性强专一性强专一性强专一性强，降，降，降，降解后的解后的解后的解后的肽段容易纯化肽段容易纯化肽段容易纯化肽段容易纯化，产率较高产率较高产率较高产率较高，副反应少副反应少副反应少副反应少，在酸水解中容，

5、在酸水解中容，在酸水解中容，在酸水解中容易受破坏的谷氨酰氨、天冬酰氨和色氨酸等在酶解中都不易受破坏的谷氨酰氨、天冬酰氨和色氨酸等在酶解中都不易受破坏的谷氨酰氨、天冬酰氨和色氨酸等在酶解中都不易受破坏的谷氨酰氨、天冬酰氨和色氨酸等在酶解中都不受影响。受影响。受影响。受影响。整个酶解反应中，酶解条件的选择相当重要，需要整个酶解反应中，酶解条件的选择相当重要，需要整个酶解反应中，酶解条件的选择相当重要，需要整个酶解反应中，酶解条件的选择相当重要，需要考虑下列因素：考虑下列因素：考虑下列因素：考虑下列因素：（1 1）合适的合适的合适的合适的pHpH （2 2）适宜的反应温度适宜的反应温度适宜的反应温度

6、适宜的反应温度 （3 3）恰当的酶与底物的比率恰当的酶与底物的比率恰当的酶与底物的比率恰当的酶与底物的比率 （4 4）选择相应的反应时间选择相应的反应时间选择相应的反应时间选择相应的反应时间 二、蛋白质的酶裂解二、蛋白质的酶裂解第三页，本课件共有47页第四页，本课件共有47页 最常用的水解蛋白酶，专一性强最常用的水解蛋白酶，专一性强最常用的水解蛋白酶，专一性强最常用的水解蛋白酶，专一性强,只断裂赖氨酸和只断裂赖氨酸和只断裂赖氨酸和只断裂赖氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽键，用它裂解蛋白质常常可精氨酸的羧基所形成的肽键，用它裂解蛋白质常常可精氨酸的羧基所形成的肽键，用它裂解蛋白质常常可精氨酸的羧基所

7、形成的肽键，用它裂解蛋白质常常可得到合适的肽段得到合适的肽段得到合适的肽段得到合适的肽段 商品胰蛋白酶中，常含有商品胰蛋白酶中，常含有商品胰蛋白酶中，常含有商品胰蛋白酶中，常含有少量胰凝乳蛋白酶，这样，在少量胰凝乳蛋白酶，这样，在少量胰凝乳蛋白酶，这样，在少量胰凝乳蛋白酶，这样，在酶解时会产生不希望有的肽片酶解时会产生不希望有的肽片酶解时会产生不希望有的肽片酶解时会产生不希望有的肽片段。因此，使用前需用段。因此，使用前需用段。因此，使用前需用段。因此，使用前需用L-1L-1（对对对对-甲苯磺酰）苯丙氨酰氯甲酮（简称甲苯磺酰）苯丙氨酰氯甲酮（简称甲苯磺酰）苯丙氨酰氯甲酮（简称甲苯磺酰）苯丙氨酰氯

8、甲酮（简称TPCKTPCK）处理胰蛋白酶，以抑制胰处理胰蛋白酶，以抑制胰处理胰蛋白酶，以抑制胰处理胰蛋白酶，以抑制胰凝乳蛋白酶的活力。也可直接订购用凝乳蛋白酶的活力。也可直接订购用凝乳蛋白酶的活力。也可直接订购用凝乳蛋白酶的活力。也可直接订购用TPCKTPCK处理过的胰蛋白酶。处理过的胰蛋白酶。处理过的胰蛋白酶。处理过的胰蛋白酶。1、胰蛋白酶、胰蛋白酶第五页，本课件共有47页 讨论：讨论：讨论：讨论：如果蛋白质分子量较大，或遇到碱性蛋白含有较多的赖氨酸和精如果蛋白质分子量较大，或遇到碱性蛋白含有较多的赖氨酸和精如果蛋白质分子量较大，或遇到碱性蛋白含有较多的赖氨酸和精如果蛋白质分子量较大，或遇到

9、碱性蛋白含有较多的赖氨酸和精氨酸残基时，则酶解后的肽段数就会很多，将给顺序测定带来很大氨酸残基时，则酶解后的肽段数就会很多，将给顺序测定带来很大氨酸残基时，则酶解后的肽段数就会很多，将给顺序测定带来很大氨酸残基时，则酶解后的肽段数就会很多，将给顺序测定带来很大麻烦。麻烦。麻烦。麻烦。方法：用柠康酸酐可逆保护赖氨酸的方法：用柠康酸酐可逆保护赖氨酸的方法：用柠康酸酐可逆保护赖氨酸的方法：用柠康酸酐可逆保护赖氨酸的-氨基，使胰蛋白酶酶解氨基，使胰蛋白酶酶解氨基，使胰蛋白酶酶解氨基，使胰蛋白酶酶解时不会在赖氨酸羧端裂解，而只在精氨酸的羧端裂解，以后时不会在赖氨酸羧端裂解，而只在精氨酸的羧端裂解，以后时

10、不会在赖氨酸羧端裂解，而只在精氨酸的羧端裂解，以后时不会在赖氨酸羧端裂解，而只在精氨酸的羧端裂解，以后也很容易去掉保护基团。也很容易去掉保护基团。也很容易去掉保护基团。也很容易去掉保护基团。-氨基保护剂第六页，本课件共有47页第七页，本课件共有47页 凝凝乳蛋白酶的前体是胰凝乳蛋白酶原，由凝凝乳蛋白酶的前体是胰凝乳蛋白酶原，由凝凝乳蛋白酶的前体是胰凝乳蛋白酶原，由凝凝乳蛋白酶的前体是胰凝乳蛋白酶原，由245245个个个个氨基酸组成的单链，有氨基酸组成的单链，有氨基酸组成的单链，有氨基酸组成的单链，有5 5个二硫键。酶原本身没有水解个二硫键。酶原本身没有水解个二硫键。酶原本身没有水解个二硫键。酶

11、原本身没有水解活力，靠胰蛋白酶激活，在活力，靠胰蛋白酶激活，在活力，靠胰蛋白酶激活，在活力，靠胰蛋白酶激活，在ArgArg1515-Ile-Ile1616 肽键处水解，形肽键处水解，形肽键处水解，形肽键处水解，形成成成成 -胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶。而而而而-胰凝乳蛋白酶又反过来对本身起作用，酶解掉二个胰凝乳蛋白酶又反过来对本身起作用，酶解掉二个胰凝乳蛋白酶又反过来对本身起作用，酶解掉二个胰凝乳蛋白酶又反过来对本身起作用，酶解掉二个二肽二肽二肽二肽 Ser Ser 1414-Arg-Arg1515 和和和和 ThrThr147147-Asn-Asn148148，生成具完

12、全活力的生成具完全活力的生成具完全活力的生成具完全活力的 a a-胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶。因此因此因此因此a a一胰凝乳蛋白酶由一胰凝乳蛋白酶由一胰凝乳蛋白酶由一胰凝乳蛋白酶由A A、B B、C C三条多肽链组成，三条多肽链组成，三条多肽链组成，三条多肽链组成，它们分别含有它们分别含有它们分别含有它们分别含有1313，130130，9696个氨基酸残基。个氨基酸残基。个氨基酸残基。个氨基酸残基。2、胰凝乳蛋白酶、胰凝乳蛋白酶第八页，本课件共有47页 凝凝乳蛋白酶的专一性不如胰蛋白酶，凝凝乳蛋白酶的专一性不如胰蛋白酶，凝凝乳蛋白酶的专一性不如胰蛋白酶，凝凝乳蛋白酶的专一

13、性不如胰蛋白酶，酶解酶解酶解酶解TyrTyr，PhePhe、TrpTrp、LenLen等疏水氨基酸等疏水氨基酸等疏水氨基酸等疏水氨基酸羧基羧基羧基羧基所形所形所形所形成的肽链，成的肽链，成的肽链，成的肽链，也能在也能在也能在也能在valval、IleIle、SerSer、GlyGly的的的的羧端羧端羧端羧端裂解，但较慢。裂解，但较慢。裂解，但较慢。裂解，但较慢。如果被裂解的邻近基团是碱性的（如如果被裂解的邻近基团是碱性的（如如果被裂解的邻近基团是碱性的（如如果被裂解的邻近基团是碱性的（如LysLys、ArgArg或或或或HisHis），），），），裂解能力将增加。倘若邻近是裂解能力将增加。倘若

14、邻近是裂解能力将增加。倘若邻近是裂解能力将增加。倘若邻近是ProPro或或或或PhePheProPro，则不能酶解。则不能酶解。则不能酶解。则不能酶解。在酶解中，增加酶的比例（对底物）能提高酶解能在酶解中，增加酶的比例（对底物）能提高酶解能在酶解中，增加酶的比例（对底物）能提高酶解能在酶解中，增加酶的比例（对底物）能提高酶解能力，这时，甚至象力，这时，甚至象力，这时，甚至象力，这时，甚至象Ala-valAla-val键也能酶解。键也能酶解。键也能酶解。键也能酶解。凝凝乳蛋白酶凝凝乳蛋白酶第九页，本课件共有47页 专一性与胰凝乳蛋白酶类似专一性与胰凝乳蛋白酶类似专一性与胰凝乳蛋白酶类似专一性与胰

15、凝乳蛋白酶类似 适宜酶解适宜酶解适宜酶解适宜酶解pHpH值是值是值是值是2 2 在顺序测定中很有价值，因为在确定二硫键的位置时，在顺序测定中很有价值，因为在确定二硫键的位置时，在顺序测定中很有价值，因为在确定二硫键的位置时，在顺序测定中很有价值，因为在确定二硫键的位置时，在这样的酸性环境下二硫键比较稳定，很少有二硫键的互换在这样的酸性环境下二硫键比较稳定，很少有二硫键的互换在这样的酸性环境下二硫键比较稳定，很少有二硫键的互换在这样的酸性环境下二硫键比较稳定，很少有二硫键的互换反应。反应条件选择恰当，可以变低特异性为高特异性。反应。反应条件选择恰当，可以变低特异性为高特异性。反应。反应条件选择恰

16、当，可以变低特异性为高特异性。反应。反应条件选择恰当，可以变低特异性为高特异性。在在在在pH2.5pH2.5的水溶液中，用胃蛋白酶酶解胰岛的水溶液中，用胃蛋白酶酶解胰岛的水溶液中，用胃蛋白酶酶解胰岛的水溶液中，用胃蛋白酶酶解胰岛素于素于素于素于3 3冰水浴恒温反应冰水浴恒温反应冰水浴恒温反应冰水浴恒温反应1.51.5h h，此后用此后用此后用此后用lN NaOHlN NaOH调调调调pH=9pH=9以终止反应。结果用以终止反应。结果用以终止反应。结果用以终止反应。结果用Scphadex G-50Scphadex G-50柱柱柱柱（3.013.0110cm10cm）分离得到了很纯的去分离得到了很

17、纯的去分离得到了很纯的去分离得到了很纯的去B B链羧端五链羧端五链羧端五链羧端五肽胰岛素，说明胃蛋白酶在酶解中只降解胰岛肽胰岛素，说明胃蛋白酶在酶解中只降解胰岛肽胰岛素，说明胃蛋白酶在酶解中只降解胰岛肽胰岛素，说明胃蛋白酶在酶解中只降解胰岛素素素素B B链中第链中第链中第链中第2525位苯丙氨酸的羧基所形成的肽键（位苯丙氨酸的羧基所形成的肽键（位苯丙氨酸的羧基所形成的肽键（位苯丙氨酸的羧基所形成的肽键（Phc25-THR26-Thr27-Pro28Phc25-THR26-Thr27-Pro28LyS29-LyS29-aLA30aLA30）3胃蛋白酶胃蛋白酶第十页，本课件共有47页 含金属的酶，

18、锌原子和钙原子，锌是活力所必需的，含金属的酶，锌原子和钙原子，锌是活力所必需的，含金属的酶，锌原子和钙原子，锌是活力所必需的，含金属的酶，锌原子和钙原子，锌是活力所必需的，钙使酶在高温下稳定，该酶易被钙使酶在高温下稳定，该酶易被钙使酶在高温下稳定，该酶易被钙使酶在高温下稳定，该酶易被EDTAEDTA所抑制。所抑制。所抑制。所抑制。专一性比上面三种酶都差，用来直接酶解蛋白质专一性比上面三种酶都差，用来直接酶解蛋白质专一性比上面三种酶都差，用来直接酶解蛋白质专一性比上面三种酶都差，用来直接酶解蛋白质不太合适，因为产生的肽段相对较多，不仅纯化起来不太合适，因为产生的肽段相对较多，不仅纯化起来不太合适

19、，因为产生的肽段相对较多，不仅纯化起来不太合适，因为产生的肽段相对较多，不仅纯化起来麻烦，而且对以后的顺序重排也不利。如用它来裂解麻烦，而且对以后的顺序重排也不利。如用它来裂解麻烦，而且对以后的顺序重排也不利。如用它来裂解麻烦，而且对以后的顺序重排也不利。如用它来裂解次级肽，即先用专一性较强的酶或化学试剂把蛋白质次级肽，即先用专一性较强的酶或化学试剂把蛋白质次级肽，即先用专一性较强的酶或化学试剂把蛋白质次级肽，即先用专一性较强的酶或化学试剂把蛋白质多肽链降解成大肽段，再切成小肽段时，嗜热菌蛋白多肽链降解成大肽段，再切成小肽段时，嗜热菌蛋白多肽链降解成大肽段，再切成小肽段时，嗜热菌蛋白多肽链降解

20、成大肽段，再切成小肽段时，嗜热菌蛋白酶可发挥很好的作用。酶可发挥很好的作用。酶可发挥很好的作用。酶可发挥很好的作用。胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶有一个胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶有一个胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶有一个胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶有一个共同的特点，即它们的作用范为比较宽，并且主要裂共同的特点，即它们的作用范为比较宽，并且主要裂共同的特点，即它们的作用范为比较宽，并且主要裂共同的特点，即它们的作用范为比较宽，并且主要裂解中性氨基酸残基。解中性氨基酸残基。解中性氨基酸残基。解中性氨基酸残基。4.嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶第十一页，本课件共有47页（三）

21、几种高特异性的肽链内切酶（三）几种高特异性的肽链内切酶 在蛋白质顺序测定中，对较大分子量的蛋白质采用逐级特异在蛋白质顺序测定中，对较大分子量的蛋白质采用逐级特异在蛋白质顺序测定中，对较大分子量的蛋白质采用逐级特异在蛋白质顺序测定中，对较大分子量的蛋白质采用逐级特异性裂解是比较理想的。性裂解是比较理想的。性裂解是比较理想的。性裂解是比较理想的。第十二页，本课件共有47页 Glu蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶 GluGlu蛋白酶亦称金黄色葡萄球菌蛋白酶，是从金黄色葡蛋白酶亦称金黄色葡萄球菌蛋白酶，是从金黄色葡蛋白酶亦称金黄色葡萄球菌蛋白酶，是从金黄色葡蛋白酶亦称金黄色葡萄球菌蛋白酶，是从金黄色葡萄球菌菌

22、株萄球菌菌株萄球菌菌株萄球菌菌株V8V8中分离得到的，是最有效、应用最广泛的一中分离得到的，是最有效、应用最广泛的一中分离得到的，是最有效、应用最广泛的一中分离得到的，是最有效、应用最广泛的一个酶，分子量只有个酶，分子量只有个酶，分子量只有个酶，分子量只有12,00012,000。当酶解在磷酸缓冲液（当酶解在磷酸缓冲液（当酶解在磷酸缓冲液（当酶解在磷酸缓冲液（pH7.8pH7.8）中进行时，它能在中进行时，它能在中进行时，它能在中进行时，它能在谷氨酸和天冬氨酸残基的羧端谷氨酸和天冬氨酸残基的羧端谷氨酸和天冬氨酸残基的羧端谷氨酸和天冬氨酸残基的羧端处裂解肽键。处裂解肽键。处裂解肽键。处裂解肽键。

23、用碳酸氢铵（用碳酸氢铵（用碳酸氢铵（用碳酸氢铵（pH7.8pH7.8）或醋酸胺（或醋酸胺（或醋酸胺（或醋酸胺（pH4.0pH4.0）时，则仅时，则仅时，则仅时，则仅在在在在谷氨酸的羧端谷氨酸的羧端谷氨酸的羧端谷氨酸的羧端处裂解。处裂解。处裂解。处裂解。该酶对下列蛋白质该酶对下列蛋白质该酶对下列蛋白质该酶对下列蛋白质只在谷氨酸的羧端只在谷氨酸的羧端只在谷氨酸的羧端只在谷氨酸的羧端处裂解：核糖体处裂解：核糖体处裂解：核糖体处裂解：核糖体蛋白蛋白蛋白蛋白S7S7，L23L23，EL12EL12，维生素维生素维生素维生素A1A1结合蛋白结合蛋白结合蛋白结合蛋白,钙结合蛋白钙结合蛋白钙结合蛋白钙结合蛋白

24、，a1llla1lll胶原蛋白胶原蛋白胶原蛋白胶原蛋白,22小球蛋白。小球蛋白。小球蛋白。小球蛋白。第十三页，本课件共有47页 Arg Arg 蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶 （1 1）Chostripain Chostripain 酶酶酶酶 专一性裂解精氨酸羧端的蛋白酶专一性裂解精氨酸羧端的蛋白酶专一性裂解精氨酸羧端的蛋白酶专一性裂解精氨酸羧端的蛋白酶。专一性很高；肽链的羧端是精氨酸；该酶在专一性很高；肽链的羧端是精氨酸；该酶在专一性很高；肽链的羧端是精氨酸；该酶在专一性很高；肽链的羧端是精氨酸；该酶在6 6molmol l l尿素尿素尿素尿素2020小时内仍保持活力，这样对不溶性蛋白质小时内仍保

25、持活力，这样对不溶性蛋白质小时内仍保持活力，这样对不溶性蛋白质小时内仍保持活力，这样对不溶性蛋白质 的长时间裂解就很有效。的长时间裂解就很有效。的长时间裂解就很有效。的长时间裂解就很有效。（2 2）凝血酶（凝血酶（凝血酶（凝血酶（thrombinthrombin）是另一个作用精氨酸羧端的是另一个作用精氨酸羧端的是另一个作用精氨酸羧端的是另一个作用精氨酸羧端的 特异酶特异酶特异酶特异酶,对对对对Arg-Gly Arg-Gly 键裂解特别快。键裂解特别快。键裂解特别快。键裂解特别快。(3)(3)颌下腺蛋白酶颌下腺蛋白酶颌下腺蛋白酶颌下腺蛋白酶也有裂解精氨酸所形成的肽键的专一也有裂解精氨酸所形成的肽

26、键的专一也有裂解精氨酸所形成的肽键的专一也有裂解精氨酸所形成的肽键的专一 性性性性,对磷脂酰胆碱交换蛋白只裂解对磷脂酰胆碱交换蛋白只裂解对磷脂酰胆碱交换蛋白只裂解对磷脂酰胆碱交换蛋白只裂解Arg-GluArg-Glu键，对键，对键，对键，对 血纤维蛋白原只裂解血纤维蛋白原只裂解血纤维蛋白原只裂解血纤维蛋白原只裂解Arg-ArgArg-Arg键键键键。第十四页，本课件共有47页 Lys Lys 蛋白酶蛋白酶 选择性一般不如选择性一般不如选择性一般不如选择性一般不如ArgArg蛋白酶专一蛋白酶专一蛋白酶专一蛋白酶专一1 1）密环菌（）密环菌（）密环菌（）密环菌（Armillaria melleaA

27、rmillaria mellea）是裂解赖氨酸氨端肽键是裂解赖氨酸氨端肽键是裂解赖氨酸氨端肽键是裂解赖氨酸氨端肽键,条件是条件是条件是条件是在赖氨酸残基的羧端必须联有谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺残基。在赖氨酸残基的羧端必须联有谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺残基。在赖氨酸残基的羧端必须联有谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺残基。在赖氨酸残基的羧端必须联有谷氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺残基。这个酶对精氨酸也具有活力，如在酶解天冬氨酸氨转移酶时，发这个酶对精氨酸也具有活力，如在酶解天冬氨酸氨转移酶时，发这个酶对精氨酸也具有活力，如在酶解天冬氨酸氨转移酶时，发这个酶对精氨酸也具有活力，如在酶解天冬氨酸氨转移酶时，发现它

28、在部分赖氨酸残基氨端裂解外，还同时裂解三个现它在部分赖氨酸残基氨端裂解外，还同时裂解三个现它在部分赖氨酸残基氨端裂解外，还同时裂解三个现它在部分赖氨酸残基氨端裂解外，还同时裂解三个Arg-Arg-LeuLeu（IleIle）键键键键2 2）血纤维蛋白酶血纤维蛋白酶血纤维蛋白酶血纤维蛋白酶裂解血纤维蛋白原时也发现除裂解部分的裂解血纤维蛋白原时也发现除裂解部分的裂解血纤维蛋白原时也发现除裂解部分的裂解血纤维蛋白原时也发现除裂解部分的赖氨酸外，也裂解精氨酸氨端肽键赖氨酸外，也裂解精氨酸氨端肽键赖氨酸外，也裂解精氨酸氨端肽键赖氨酸外，也裂解精氨酸氨端肽键3)3)Myxobactcr AI-1Myxob

29、actcr AI-1是另一种是另一种是另一种是另一种LysLys蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶。它是从一种粘细菌它是从一种粘细菌它是从一种粘细菌它是从一种粘细菌中提取的，也能在赖氨酸残基的氨端裂解，条件是，赖氨酸残基的中提取的，也能在赖氨酸残基的氨端裂解，条件是，赖氨酸残基的中提取的，也能在赖氨酸残基的氨端裂解，条件是，赖氨酸残基的中提取的，也能在赖氨酸残基的氨端裂解，条件是，赖氨酸残基的羧端通常联有羧端通常联有羧端通常联有羧端通常联有TyrTyr，AlaAla和和和和GlnGln残基残基残基残基4)4)凝血酶样酶（凝血酶样酶（凝血酶样酶（凝血酶样酶（thrombin enzyme)thrombin

30、 enzyme)是是是是 Lys-LeuLys-Leu键的高特异性键的高特异性键的高特异性键的高特异性LysLys蛋白酶。蛋白酶。蛋白酶。蛋白酶。第十五页，本课件共有47页 Pro蛋白酶蛋白酶 特异性在特异性在Pro羧基所形成肽键处裂解的羧基所形成肽键处裂解的蛋白酶，从小羊肾中提取蛋白酶，从小羊肾中提取 第十六页，本课件共有47页（四）实验方法（四）实验方法 1.1.胰蛋白酶裂解胰蛋白酶裂解胰蛋白酶裂解胰蛋白酶裂解 （l l）TPCKTPCK一胰蛋白酶降解一胰蛋白酶降解一胰蛋白酶降解一胰蛋白酶降解 称称称称1.01.0mgmg蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 +0.5 +0.5mlml双蒸水双蒸水双蒸

31、水双蒸水 +0.5 +0.5m1 m1 0.2mol0.2moll N-l N-甲基吗啉缓冲液（甲基吗啉缓冲液（甲基吗啉缓冲液（甲基吗啉缓冲液（pH 8.1pH 8.1）+10-20 +10-20 ug TPCK-ug TPCK-胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶 37 37保温反应保温反应保温反应保温反应4-64-6h h 冷冻干燥冷冻干燥冷冻干燥冷冻干燥 加加加加5050ulul双蒸水溶解，离心双蒸水溶解，离心双蒸水溶解，离心双蒸水溶解，离心 上清液待分离纯化后供测顺序用上清液待分离纯化后供测顺序用上清液待分离纯化后供测顺序用上清液待分离纯化后供测顺序用第十七页，本课件共有47页胰蛋白酶（胰

32、蛋白酶（胰蛋白酶（胰蛋白酶（200200mgmg）溶于溶于溶于溶于62 62 m1 0.001mo1m1 0.001mo1l CaCl2 l CaCl2 用用用用3%3%NaOH NaOH 调调调调pHpH至至至至7.07.0 在在在在15-2015-20加人含加人含加人含加人含6 6mg TPCK mg TPCK 0.60.6mlml无水甲醇溶液无水甲醇溶液无水甲醇溶液无水甲醇溶液 继续搅拌继续搅拌继续搅拌继续搅拌 维持维持维持维持pH7.0 pH7.0 约约约约5.55.5h h 用用用用pH3.0pH3.0的盐酸水溶液透析的盐酸水溶液透析的盐酸水溶液透析的盐酸水溶液透析2.52.5天天天

33、天 然后冻干。然后冻干。然后冻干。然后冻干。（2）TPCKTPCK处理胰蛋白酶处理胰蛋白酶分离纯化第十八页，本课件共有47页（3）TPCK一胰蛋白酶活力的测定方法一胰蛋白酶活力的测定方法 称底物称底物称底物称底物苄酰苄酰苄酰苄酰L L-精氨酰乙酶盐酸盐精氨酰乙酶盐酸盐精氨酰乙酶盐酸盐精氨酰乙酶盐酸盐（Bcnzyl-L-Argininc Bcnzyl-L-Argininc cthv1 csterH C1 cthv1 csterH C1 简称简称简称简称 BAEEBAEE)3.9mg)3.9mg 溶于溶于溶于溶于1010ml 0.05molml 0.05moll l TrisTris缓冲液缓冲液缓

34、冲液缓冲液（pHpH9.249.24）中，将中，将中，将中，将TPCKTPCK处理过的处理过的处理过的处理过的胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶 l mg l mg 溶于溶于溶于溶于10 10 m1 0.001N HCIm1 0.001N HCI中，吸底物中，吸底物中，吸底物中，吸底物3 3mlml在紫外分光光度计上（波长在紫外分光光度计上（波长在紫外分光光度计上（波长在紫外分光光度计上（波长253253nmnm处），调节光密度为处），调节光密度为处），调节光密度为处），调节光密度为0 0，然后加人，然后加人，然后加人，然后加人0.20.2ml ml 酶液。每隔酶液。每隔酶液。每隔酶液。每隔30

35、30秒钟读一次光秒钟读一次光秒钟读一次光秒钟读一次光密度数，直至读数不变为止，一般在密度数，直至读数不变为止，一般在密度数，直至读数不变为止，一般在密度数，直至读数不变为止，一般在1010分钟内稳定。分钟内稳定。分钟内稳定。分钟内稳定。活力单位计算公式：活力单位计算公式：活力单位计算公式：活力单位计算公式：a.u.=-a.u.=-O.D.C酶第十九页，本课件共有47页（4）保护）保护Lys-NH2的方法的方法 柠康酰化法：柠康酰化法：柠康酰化法：柠康酰化法：蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 溶于溶于溶于溶于6 6molmoll l 盐酸胍或盐酸胍或盐酸胍或盐酸胍或 8 8 molmoll l 尿素（尿

36、素（尿素（尿素（20-3020-30mg mg 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质mlml）在室温（在室温（在室温（在室温（2020）下）下）下）下 用用用用12 12 N NaH N NaH 调调调调pH pH 至至至至8.08.0 柠康酸酐柠康酸酐柠康酸酐柠康酸酐2525mgmg（1010倍于蛋白质的量）倍于蛋白质的量）倍于蛋白质的量）倍于蛋白质的量）激烈搅拌激烈搅拌激烈搅拌激烈搅拌2 2小时，小时，小时，小时，pH 8.5 pH 8.5 左右左右左右左右 透析或用透析或用透析或用透析或用Sephadcx G-25Sephadcx G-25柱除试剂和盐柱除试剂和盐柱除试剂和盐柱除试剂和盐 分离纯化第

37、二十页，本课件共有47页 ETPAETPA法：法：法：法：以以以以ETPAETPA与溶菌酶反应为例与溶菌酶反应为例与溶菌酶反应为例与溶菌酶反应为例 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 硼酸缓冲液（硼酸缓冲液（硼酸缓冲液（硼酸缓冲液（0.2mol/l pH=8.80.2mol/l pH=8.8）1 12 mg 2 mg 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质/mlml，过量的过量的过量的过量的ETPAETPA（按参与反应的按参与反应的按参与反应的按参与反应的LysLys基团数计算）基团数计算）基团数计算）基团数计算）12 12倍，搅拌下分批滴加倍，搅拌下分批滴加倍，搅拌下分批滴加倍，搅拌下分批滴加 用用用用l N Na

38、OH pH=l N NaOH pH=8.58.59.09.0 加入加入加入加入ETPAETPA时，产生沉淀时，产生沉淀时，产生沉淀时，产生沉淀 2 2小时反应结束小时反应结束小时反应结束小时反应结束 4 4 透析透析透析透析(pH=8,pH=8,5 5(w/v)NHw/v)NH4 4HCOHCO3)3)分离纯化第二十一页，本课件共有47页马来酰化法：马来酰化法：马来酰化法：马来酰化法：称蛋白质称蛋白质称蛋白质称蛋白质(200 (200 mg)mg)溶于溶于溶于溶于10 10 mlml的的的的 0.0.lmollmoll l磷酸钠缓冲液磷酸钠缓冲液磷酸钠缓冲液磷酸钠缓冲液 冰浴冷却冰浴冷却冰浴冷

39、却冰浴冷却 滴加滴加滴加滴加300300mgmg马来酸酐马来酸酐马来酸酐马来酸酐 （溶于（溶于（溶于（溶于3 3mlml无水三氧六环）无水三氧六环）无水三氧六环）无水三氧六环）用用用用0.1 0.1 N N或或或或0.50.5N NaH pH=N NaH pH=9.09.0 0 0下放置下放置下放置下放置30 30 minmin 继续搅拌继续搅拌继续搅拌继续搅拌 1 1h h 室温透析室温透析室温透析室温透析4848h h（外透液为外透液为外透液为外透液为2 2N N氨水氨水氨水氨水,pH8)pH8)冷冻干燥冷冻干燥冷冻干燥冷冻干燥分离纯化第二十二页，本课件共有47页2.2.胰凝乳蛋白酶裂解胰

40、凝乳蛋白酶裂解胰凝乳蛋白酶裂解胰凝乳蛋白酶裂解:酶解条件及缓冲液与胰蛋白酶相同酶解条件及缓冲液与胰蛋白酶相同酶解条件及缓冲液与胰蛋白酶相同酶解条件及缓冲液与胰蛋白酶相同,pH8.1 pH8.1，3737，酶酶酶酶:底物底物底物底物=1:100=1:100，酶解，酶解，酶解，酶解1-41-4h h3.3.嗜热菌蛋白酶裂解嗜热菌蛋白酶裂解嗜热菌蛋白酶裂解嗜热菌蛋白酶裂解:缓冲液与胰蛋白酶相同缓冲液与胰蛋白酶相同缓冲液与胰蛋白酶相同缓冲液与胰蛋白酶相同 pH8.1 pH8.1，50-5550-55 酶酶酶酶:底物底物底物底物=1:100=1:100或或或或1:1501:150，酶解，酶解，酶解，酶解

41、2 2h h 以避免胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的副反应以避免胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的副反应以避免胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的副反应以避免胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的副反应 第二十三页，本课件共有47页4 4胃蛋白酶裂解胃蛋白酶裂解胃蛋白酶裂解胃蛋白酶裂解:1.1.0 mg0 mg蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 +0.5 +0.5ml 0.05N ml 0.05N 醋酸或稀甲酸中醋酸或稀甲酸中醋酸或稀甲酸中醋酸或稀甲酸中,pH 2pH 2.0.0 +10 +10ug ug 胃蛋白酶（溶于胃蛋白酶（溶于胃蛋白酶（溶于胃蛋白酶（溶于1010ulul双蒸水）双蒸水）双蒸水）双蒸水）37 37下搅拌反应下搅拌反应下搅拌反

42、应下搅拌反应 2 2h h 冰冻干燥冰冻干燥冰冻干燥冰冻干燥 随后溶于随后溶于随后溶于随后溶于5050mlml双蒸水中双蒸水中双蒸水中双蒸水中 离心离心离心离心 分离纯化第二十四页，本课件共有47页 5.5.GulGul蛋白酶裂解蛋白酶裂解蛋白酶裂解蛋白酶裂解:蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 1.0 1.0 mg mg 溶于溶于溶于溶于1.0 1.0 m1 m1 醋酸铵缓冲液醋酸铵缓冲液醋酸铵缓冲液醋酸铵缓冲液 0.1mol,pH4.0 0.1mol,pH4.0 加加加加20 20 ug Gluug Glu蛋白酶（溶于蛋白酶（溶于蛋白酶（溶于蛋白酶（溶于20 20 ul ul 双蒸水）双蒸水）双蒸水

43、）双蒸水）搅拌搅拌搅拌搅拌 酶酶酶酶:底物底物底物底物=1:50=1:50 37 37下保温下保温下保温下保温24-2824-28小时小时小时小时 冰冻干燥冰冻干燥冰冻干燥冰冻干燥 加加加加5050ul ul 双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解 分离纯化第二十五页，本课件共有47页6.6.Arg Arg 白酶裂解白酶裂解白酶裂解白酶裂解:蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 1.0 1.0mgmg 溶于溶于溶于溶于 1.0 1.0ml ml 双蒸水双蒸水双蒸水双蒸水 加加加加8.0 8.0 ug Arg ug Arg 蛋白酶（溶于蛋白酶（溶于蛋白酶（溶于蛋白酶（溶于2020ul ul 双蒸水）双蒸水

44、）双蒸水）双蒸水）37 37下搅拌反应下搅拌反应下搅拌反应下搅拌反应1-41-4小时小时小时小时 冰冻干燥冰冻干燥冰冻干燥冰冻干燥 再溶于再溶于再溶于再溶于5050ul ul 双蒸水双蒸水双蒸水双蒸水 待分离纯化待分离纯化待分离纯化待分离纯化 分离纯化第二十六页，本课件共有47页7.7.密环菌蛋白酶裂解密环菌蛋白酶裂解密环菌蛋白酶裂解密环菌蛋白酶裂解:蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 1.0 1.0mgmg 溶于溶于溶于溶于0.50.5m1 0.1mol/l 1N-m1 0.1mol/l 1N-甲基吗啉醋酸缓冲液甲基吗啉醋酸缓冲液甲基吗啉醋酸缓冲液甲基吗啉醋酸缓冲液 或或或或 0.07 0.07氨水氨

45、水氨水氨水 （pH8.1pH8.1）1 1 ug ug 酶酶酶酶 溶于溶于溶于溶于5 5 ul ul 双蒸水双蒸水双蒸水双蒸水 （酶（酶（酶（酶:底物底物底物底物=1:1000=1:1000）37 37下搅拌反应下搅拌反应下搅拌反应下搅拌反应 4-6 4-6h h 冷冻干燥冷冻干燥冷冻干燥冷冻干燥 50 50 ul ul 双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解 分离纯化供测顺序用分离纯化供测顺序用分离纯化供测顺序用分离纯化供测顺序用第二十七页，本课件共有47页 三、蛋白质的化学裂解三、蛋白质的化学裂解 是蛋白质顺序测定中的另一重要手段是蛋白质顺序测定中的另一重要手段是蛋白质顺序测定中的另一重

46、要手段是蛋白质顺序测定中的另一重要手段 产物的肽段一般都比较大产物的肽段一般都比较大产物的肽段一般都比较大产物的肽段一般都比较大 裂解产物适合于在自动顺序仪中测定顺序裂解产物适合于在自动顺序仪中测定顺序裂解产物适合于在自动顺序仪中测定顺序裂解产物适合于在自动顺序仪中测定顺序 产物有利于肽段的吻合产物有利于肽段的吻合产物有利于肽段的吻合产物有利于肽段的吻合 因此化学法对较大分子量的蛋白质顺序测定是重要的因此化学法对较大分子量的蛋白质顺序测定是重要的因此化学法对较大分子量的蛋白质顺序测定是重要的因此化学法对较大分子量的蛋白质顺序测定是重要的缺点：缺点：缺点：缺点：因为化学裂解后的肽段较大。往往会遇

47、到不溶解和集聚等因为化学裂解后的肽段较大。往往会遇到不溶解和集聚等因为化学裂解后的肽段较大。往往会遇到不溶解和集聚等因为化学裂解后的肽段较大。往往会遇到不溶解和集聚等问题，分离较困难，产率一般也比酶解为低。问题，分离较困难，产率一般也比酶解为低。问题，分离较困难，产率一般也比酶解为低。问题，分离较困难，产率一般也比酶解为低。第二十八页，本课件共有47页第二十九页，本课件共有47页 1 1原理原理原理原理 。溴化氰（溴化氰（溴化氰（溴化氰（CNBrCNBr）裂解法是多种化学法中最重要的裂解法是多种化学法中最重要的裂解法是多种化学法中最重要的裂解法是多种化学法中最重要的 也是最常见的方法。也是最常

48、见的方法。也是最常见的方法。也是最常见的方法。由由由由GrossGross和和和和WitkopWitkop于于于于19621962年建立的。后人进行了系统年建立的。后人进行了系统年建立的。后人进行了系统年建立的。后人进行了系统 研究研究研究研究,能专一裂解蛋氨酸残基的羧端，产率达到能专一裂解蛋氨酸残基的羧端，产率达到能专一裂解蛋氨酸残基的羧端，产率达到能专一裂解蛋氨酸残基的羧端，产率达到85%85%。由于蛋白质中的由于蛋白质中的由于蛋白质中的由于蛋白质中的MetMet一般都比较少，因此裂解后的肽一般都比较少，因此裂解后的肽一般都比较少，因此裂解后的肽一般都比较少，因此裂解后的肽 段较少，新生成

49、的肽段往往是大肽段，这样很适合于段较少，新生成的肽段往往是大肽段，这样很适合于段较少，新生成的肽段往往是大肽段，这样很适合于段较少，新生成的肽段往往是大肽段，这样很适合于 自动顺序仪测定，更适用于固相法测定。与胰蛋白酶自动顺序仪测定，更适用于固相法测定。与胰蛋白酶自动顺序仪测定，更适用于固相法测定。与胰蛋白酶自动顺序仪测定，更适用于固相法测定。与胰蛋白酶 裂解法配合起来，通常很容易获得肽段的排列顺序裂解法配合起来，通常很容易获得肽段的排列顺序裂解法配合起来，通常很容易获得肽段的排列顺序裂解法配合起来，通常很容易获得肽段的排列顺序（）溴化氰裂解（）溴化氰裂解第三十页，本课件共有47页CNBrCN

50、Br裂解蛋氨酸残基的反应机理：裂解蛋氨酸残基的反应机理：裂解蛋氨酸残基的反应机理：裂解蛋氨酸残基的反应机理：CNBr CNBr 裂解肽链的甲硫氨酸羧基所形成肽链的反应裂解肽链的甲硫氨酸羧基所形成肽链的反应裂解肽链的甲硫氨酸羧基所形成肽链的反应裂解肽链的甲硫氨酸羧基所形成肽链的反应第三十一页，本课件共有47页 在酸性条件下氨基质子化，可以避免一些副反应在酸性条件下氨基质子化，可以避免一些副反应在酸性条件下氨基质子化，可以避免一些副反应在酸性条件下氨基质子化，可以避免一些副反应 如：如：如：如：用用用用7070甲酸可以破坏肽链的卷曲，使甲硫氨酸侧甲酸可以破坏肽链的卷曲，使甲硫氨酸侧甲酸可以破坏肽链