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1、关于植物原生质体培养第一页，本课件共有89页第一节第一节原生质体的用途原生质体的用途 植物原生质体植物原生质体(protoplast)是是没有细胞壁的没有细胞壁的裸露细胞，裸露细胞，它它在一些研究方在一些研究方面具有独特的面具有独特的优势。优势。第二页，本课件共有89页1.原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成、原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成、细胞膜的结构、大分子物质进出细胞过程细胞膜的结构、大分子物质进出细胞过程与机理等问题的良好实验体系。与机理等问题的良好实验体系。2.转基因的良好受体：与外源转基因的良好受体：与外源DNA（如质（如质粒）共培养时，原生质体可以直接吸收外粒）共培养时，原
2、生质体可以直接吸收外源源DNA，并整合到染色体上，从而实现对，并整合到染色体上，从而实现对植物细胞的遗传转化，进一步通过植株再植物细胞的遗传转化，进一步通过植株再生就可得到生就可得到转基因植物转基因植物。第三页，本课件共有89页GFP质粒浓度对烟草原生质体转基因效率的影响质粒浓度对烟草原生质体转基因效率的影响GFP=绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白第四页，本课件共有89页PEG介导的甜橙原生质体转介导的甜橙原生质体转GFPPCR分析Sothern杂交分析第五页，本课件共有89页3.体细胞杂交（体细胞杂交（somatichybridization）：）：由于原生质体没有细胞壁，所以不同的原由于原生质体没
3、有细胞壁，所以不同的原生质体可以相互靠近，发生融合。生质体可以相互靠近，发生融合。2种不种不同植物体细胞发生融合的过程，称为体细同植物体细胞发生融合的过程，称为体细胞杂交。胞杂交。所得到的融合细胞为杂种细胞，所得到的融合细胞为杂种细胞，再通过植株再生就可能创造出新的植物个再通过植株再生就可能创造出新的植物个体。体。第六页，本课件共有89页Tomato-potatohybrid第七页，本课件共有89页第二节第二节原生质体的分离原生质体的分离要要进进行行原原生生质质体体培培养养和和操操作作，就就必必需需有有大大量量高高质质量量的的原原生生质质体体。分分离离原原生生质质体体主要采用酶解法。主要采用酶
4、解法。酶解法酶解法：利用酶降解植物细胞壁而获得原：利用酶降解植物细胞壁而获得原生质体。生质体。酶解法分离原生质体的效率高，酶解法分离原生质体的效率高，用少量的材料就可以得到大量完整的原生用少量的材料就可以得到大量完整的原生质体，已成为分离原生质体的最主要方法。质体，已成为分离原生质体的最主要方法。第八页，本课件共有89页第九页，本课件共有89页一、一、材料的选择材料的选择用用于于分分离离原原生生质质体体的的植植物物材材料料应应是是细细胞胞分分裂裂旺旺盛盛的的材材料料，如如幼幼嫩嫩小小苗苗的的根根、胚胚轴轴、子子叶叶、幼幼叶叶等等；处处于于快快速速生生长长期期的的愈愈伤伤组组织织或或悬悬浮浮细细
5、胞胞。对对于于容容易易培培养养、再再生生能能力力强强的的叶叶植植物物（如如烟烟草草、菊菊花花、胡胡萝萝卜卜、矮矮牵牵牛牛等等）也可用完全展开的叶片作材料。也可用完全展开的叶片作材料。第十页，本课件共有89页二、二、酶解处理酶解处理1.酶酶解解液液准准备备：由由于于植植物物细细胞胞壁壁的的主主要要成成分分是是纤纤维维素素、半半纤纤维维素素和和果果胶胶质质组组成成的的，所所以以酶酶解解液液中中一一般般应应含含有有纤纤维维素素酶酶、半半纤纤维维素素酶酶和和果果胶胶酶酶，浓浓度度为为0.5-2.0%。在在配配酶酶解解液液时时可可以以用用原原生生质质体体培培养养基基作作溶溶解解剂剂，也也可用专门的溶液（
6、可用专门的溶液（CPW溶液）作溶解剂。溶液）作溶解剂。第十一页，本课件共有89页CPW=Cell-ProtoplastWashMedium KH2PO427.2mg/LKNO3101.0mg/LCaCl22H2O148.0mg/LMgSO47H2O246.0mg/LKI0.16mg/LCuSO45H2O0.025mg/L第十二页，本课件共有89页 为了保持释放出来的原生质体的活力和膜为了保持释放出来的原生质体的活力和膜稳定性，必须使原生质体处于一个等渗环境稳定性，必须使原生质体处于一个等渗环境中。中。因此，酶解液中因此，酶解液中必须加入渗透压调节剂。必须加入渗透压调节剂。常用的渗透压调节剂有常
7、用的渗透压调节剂有葡萄糖、甘露醇和葡萄糖、甘露醇和山梨醇山梨醇等，浓度一般为等，浓度一般为0.35-0.8mol/L。具体。具体用什么浓度，可根据材料的水势来确定。用什么浓度，可根据材料的水势来确定。酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用。菌，并且随配随用。第十三页，本课件共有89页2.酶解：将植物材料放入酶解液中、释放酶解：将植物材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。出原生质体的过程。叶片、幼茎和根等材料要切成小片；叶片、幼茎和根等材料要切成小片；叶片最好撕去下表皮。悬浮细胞要离心叶片最好撕去下表皮。悬浮细胞要离心后再酶解。后再酶解
8、。材料与酶解液的比例：材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶酶解液。解液。一般在一般在252、黑暗中酶解，期间轻、黑暗中酶解，期间轻轻摇动几次，或放在轻摇动几次，或放在50rpm的摇床上。酶的摇床上。酶解时间因材料而异，解时间因材料而异，2小时小时十几小时。十几小时。第十四页，本课件共有89页苜蓿叶片的酶解法分离苜蓿叶片的酶解法分离原生质体原生质体第十五页，本课件共有89页三、原生质体的收集与纯化三、原生质体的收集与纯化1.过过滤滤：酶酶解解结结束束后后，将将酶酶解解物物通通过过孔孔径径为为20-80m的的不不锈锈钢钢筛筛网网过过滤滤，除除去去未未被被酶酶解解的的组组织织块和细胞团。块和
9、细胞团。2.离心：离心：滤液转到离心管中在滤液转到离心管中在50g下下离心离心5min。3.反反复复洗洗涤涤：离离心心结结束束后后，弃弃去去上上清清液液，用用培培养养基基和和原原生生质质体体洗洗液液重重新新悬悬浮浮沉沉淀淀的的原原生生质质体体，再再离离心心。如如此此反反复复2-4次次，就就可可以以将将残残留留的的酶酶液液去掉去掉。4.纯纯化化：用用含含高高浓浓度度（21%）蔗蔗糖糖的的培培养养基基进进行行离离心心、纯纯化化，完完整整的的原原生生质质体体漂漂浮浮在在上上清清液液的的上部。上部。第十六页，本课件共有89页苜蓿叶片原生苜蓿叶片原生质体的纯化质体的纯化完整的原生质体完整的原生质体第十七
10、页，本课件共有89页5.收集原生质体：收集原生质体：第十八页，本课件共有89页完整的原生质体完整的原生质体第十九页，本课件共有89页四、原生质体活力的测定四、原生质体活力的测定原原生生质质体体活活力力的的高高低低对对后后来来的的原原生生质质体体培培养养和和融融合合影影响响极极大大。原原生生质质体体分分离离过过程程中中的的任任何何一一个个步步骤骤都都会会影影响响到到原原生生质质体体的的活活力力，因因此此，必必须须十十分分小小心心。测测定定原原生生质质体体活活力力的的方方法法常常用用荧荧光光素素双双醋醋酸酯（酸酯（FDA）染色法。）染色法。原原生生质质体体活活力力（%）=发发荧荧光光的的原原生生质
11、质体数体数/原生质体总数原生质体总数100第二十页，本课件共有89页FDAFDA荧光素荧光素酶水解酶水解紫外光紫外光荧光素荧光素完完整整、有有活活力力的原生质体的原生质体细胞核细胞核荧光素双醋酸酯荧光素双醋酸酯第二十一页，本课件共有89页第三节第三节原生质体培养原生质体培养原生质体制原生质体制备好后，用备好后，用培养基将原培养基将原生质体调至生质体调至一定的密度一定的密度（最低起始（最低起始细胞密度以细胞密度以上），及时上），及时地进行培养。地进行培养。第二十二页，本课件共有89页在适宜的培养条件下，原生质体数小在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的时后开始形成新的细胞壁细胞壁，在显
12、微镜，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约形、多边形等。约24-36h后，原生质后，原生质体开始发生体开始发生第一次分裂第一次分裂；以后随着细胞；以后随着细胞分裂，原生质体就形成分裂，原生质体就形成细胞团细胞团，进一步进一步诱导出诱导出植株。植株。第二十三页，本课件共有89页苜蓿原生质苜蓿原生质体分裂体分裂第二十四页，本课件共有89页6weeks8weeks苜蓿原生质体形成细苜蓿原生质体形成细胞团胞团第二十五页，本课件共有89页苜蓿原生质体苜蓿原生质体再生植株再生植株第二十六页，本课件共有89页转转GFP基因的苜蓿原生质体再生植株基因的苜蓿原
13、生质体再生植株第二十七页，本课件共有89页夜来香原生质体植株再生夜来香原生质体植株再生1天天5天天7天天10天天第二十八页，本课件共有89页4周周5周周7周周第二十九页，本课件共有89页单倍体烟草原生质体培单倍体烟草原生质体培养与植株再生养与植株再生第三十页，本课件共有89页杨树原生质体培养植株再生7000,000cells/g fresh leaves25000cells/ml;NH4NO3-free MS+5 M 2,4-D+0.05 TDZ M.PE:34.7%at day 14第三十一页，本课件共有89页杨树原生质体培养植株再生LiquidMS+5 M2,4-D;MS+10 MKTor
14、1 MTDZ.第三十二页，本课件共有89页杨树原生质体培养植株再生1/2MS第三十三页，本课件共有89页将含原生质体的培养液倒入培养皿底部，使其将含原生质体的培养液倒入培养皿底部，使其成一薄层，封口后进行培养。成一薄层，封口后进行培养。1.液体浅层培养液体浅层培养原生质体的培养方法原生质体的培养方法含原生质体的液体培养基第三十四页，本课件共有89页特点：特点：操作简单，对原生质体的损伤小；操作简单，对原生质体的损伤小；容易添加新鲜培养基和转移培养物；容易添加新鲜培养基和转移培养物；原原生生质质体体分分布布不不均均匀匀，易易发发生生原原生生质质体体之之间间粘连；粘连；原原生生质质体体的的位位置置
15、不不能能固固定定，所所以以不不能能跟跟踪踪观观察单个原生质体的生长过程。察单个原生质体的生长过程。第三十五页，本课件共有89页2.固体培养固体培养（平板培养）（平板培养）35左右的琼脂或琼脂糖培养基与原生质体左右的琼脂或琼脂糖培养基与原生质体溶液混合，摇匀，倒入培养皿中，琼脂或琼脂溶液混合，摇匀，倒入培养皿中，琼脂或琼脂糖凝固后，就成一薄层。糖凝固后，就成一薄层。进行平板培养时，进行平板培养时，要注意混合时培养基的温度要注意混合时培养基的温度。温度高对原生质体的伤害大；温度低，培养基凝温度高对原生质体的伤害大；温度低，培养基凝固，原生质体与培养基不能混匀。固，原生质体与培养基不能混匀。特点：特
16、点：原生质体被固定，易观察、统计原生质体原生质体被固定，易观察、统计原生质体的分裂情况；添加新鲜培养基和转移培养物比较的分裂情况；添加新鲜培养基和转移培养物比较麻烦。麻烦。含原生质体的固体培养基第三十六页，本课件共有89页（1）液液体体浅浅层层固固体体平平板板培培养养双双层层培培养养法法：培培养养皿皿底底部部铺铺一一层层琼琼脂脂或或琼琼脂脂糖糖培培养养基基，再再将将原原生生质质体体悬悬浮浮液液倒倒入入或或滴滴入入固固体体培培养养基基表表面面。优优点点是是固固体体培培养养基基中中的的营营养养可可以以缓缓慢慢释释放放倒倒液液体体培培养养基基中中。如如果果在在固固体体培培养养基基中中加加入入活活性性
17、炭炭，还还可可以以吸吸附附培培养养物物分分泌泌的的有有毒毒物物质，促进原生质体的生长和分裂。质，促进原生质体的生长和分裂。3.液体液体固体结合培养固体结合培养固体培养基含原生质体的液体培养基第三十七页，本课件共有89页（2）琼琼脂脂糖糖珠珠培培养养：用用移移液液管管吸吸取取含含原原生生质质体体的的琼琼脂脂糖糖培培养养基基，滴滴在在培培养养皿皿或或三三角角瓶瓶中中，待待其其凝凝固固后后，再再加加入入适适量量的的液液体体培培养养基基，进进行行旋旋转转培培养养。也也可可以以等等含含原原生生质质体体的的琼琼脂脂糖糖培培养养基基凝凝固固后后，用用刀刀将将其其切切成成小小块块，再放入液体培养基中培养。再放
18、入液体培养基中培养。改改进进了了培培养养物物的的通通气气和和营营养养环环境境，从从而而促促进进可可以以促促进原生质体的分裂及细胞团的形成。进原生质体的分裂及细胞团的形成。含原生质体的琼脂糖珠含原生质体的琼脂糖珠液体培养基第三十八页，本课件共有89页在培养过程中，在培养过程中，原生质体分裂开始原生质体分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐度要逐渐降低降低，否则会影响细胞的继，否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团（愈伤组织）达到胞团（愈伤组织）达到1mm时，应将时，应将细胞团转移细胞团转移到新鲜的培养基
19、上继续培养。到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和伤组织进行培养和植株再生植株再生。第三十九页，本课件共有89页第四十页，本课件共有89页三、影响原生质体培养效果的因素三、影响原生质体培养效果的因素原原生生质质体体培培养养效效果果的的好好坏坏，也也可可以以用用植植板板率率来来衡衡量。量。1.植物材料：植物材料：用于分离原生质体的植物材料对原生用于分离原生质体的植物材料对原生质体后来培养的效果影响极大。质体后来培养的效果影响极大。不同的植物、同一不同的植物、同一植物不同的品种植物不同的品种，其遗传组成存在差异，原生质体的，其
20、遗传组成存在差异，原生质体的培养效果也就必然有差异。如培养效果也就必然有差异。如Yamada曾用曾用26个水稻个水稻品种的种子诱导出愈伤组织，再建立悬浮细胞培品种的种子诱导出愈伤组织，再建立悬浮细胞培养，以悬浮细胞分离原生质体，结果只有养，以悬浮细胞分离原生质体，结果只有1个品种个品种的原生质体再生了植株。一般来说，的原生质体再生了植株。一般来说，容易培养的植容易培养的植物、外植体，其原生质体也容易培养物、外植体，其原生质体也容易培养，反之，亦，反之，亦然。草本比木本容易，然。草本比木本容易，幼嫩的材料幼嫩的材料比成熟的材料比成熟的材料容易。容易。第四十一页，本课件共有89页2.培养基培养基（
21、1）基基本本培培养养基基：不不同同植植物物原原生生质质体体要要求求有有不不同同的的基基本本培培养养基基。使使用用什什么么基基本本培培养养基基，可可以以参参照照相相应应培培养养愈愈伤伤组组织织或或细细胞胞的的培培养养基基。一一般般认认为为，原原生生质质体体培培养养基基种种的的大大量量元元素素应应比比愈愈伤伤组组织织培培养养基基中中的的大大量量元元素素浓浓度度低低。由由于于Ca2+影影响响到到膜膜的的稳稳定定性性，因此较高因此较高Ca2+浓度的对原生质体分裂有利。浓度的对原生质体分裂有利。第四十二页，本课件共有89页（2）有有机机成成分分：同同培培养养细细胞胞、愈愈伤伤组组织织相相比比，培培养养原
22、原生生质质体体时时要要求求培培养养基基有有更更丰丰富富的的有有机机成成分分，如如氨氨基基酸酸、维维生生素素、CW，YE，LH，CH、小小牛牛血血清清等等。大大量量的的结结果果表表明明，培培养养基基中中添添加加谷谷氨氨酰酰胺胺有利于原生质体的分裂。有利于原生质体的分裂。（3）激激素素：培培养养基基中中要要加加入入一一定定浓浓度度的的细细胞胞分分裂裂素素和和生生长长素素。由由于于2,4-D促促进进细细胞胞分分裂裂能能力力很很强强，所以培养基中大都要加所以培养基中大都要加2,4-D。（4）条件化培养基：条件化培养基：使用条件化培养基可以大大使用条件化培养基可以大大促进原生质体的分裂和细胞团的形成。促
23、进原生质体的分裂和细胞团的形成。第四十三页，本课件共有89页（5）培养基中的渗透压：）培养基中的渗透压：原生质体无细胞原生质体无细胞壁，所以培养基中必须使用渗透压调节剂壁，所以培养基中必须使用渗透压调节剂（甘露醇、山梨醇等），以维持原生质体（甘露醇、山梨醇等），以维持原生质体的稳定。但渗透压调节剂浓度较高往往会的稳定。但渗透压调节剂浓度较高往往会抑制细胞分裂和后来的细胞生长。因此，抑制细胞分裂和后来的细胞生长。因此，培养基中渗透压调节剂的浓度不能太高，培养基中渗透压调节剂的浓度不能太高，并且在后来的培养过程中要逐渐降低甘露并且在后来的培养过程中要逐渐降低甘露醇或山梨醇的浓度，以利于细胞的持续分
24、醇或山梨醇的浓度，以利于细胞的持续分裂和生长。裂和生长。第四十四页，本课件共有89页第三节第三节体细胞杂交体细胞杂交(somatichybridization)由由于于没没有有细细胞胞壁壁的的限限制制，原原生生质质体体可可以以彼彼此此靠靠近近，通通过过膜膜的的融融合合而而融融为为一一体体。如如果果两两个个相相同同的的原原生生质质体发生融合，则可以实现染色体加倍。体发生融合，则可以实现染色体加倍。Protoplastfusion第四十五页，本课件共有89页期盼的马铃薯与番茄杂种植株期盼的马铃薯与番茄杂种植株如如果果两两个个不不同同植植物物的的原原生生质质体体融融合合，则则就就可可以以形形成成一一
25、个个新新的的杂杂种种细细胞胞，此此杂杂种种细细胞胞通通过过植植株株再再生生，则则可可以以得得到到杂杂种种植植株株。两两个个不不同同植植物体细胞发生融合的过程，称为体细胞杂交。物体细胞发生融合的过程，称为体细胞杂交。第四十六页，本课件共有89页体细胞杂交克服了有性杂交时生殖隔体细胞杂交克服了有性杂交时生殖隔离的限制，为创造种间杂种、属间杂种，离的限制，为创造种间杂种、属间杂种，甚至科间杂种创造了条件。甚至科间杂种创造了条件。体细胞杂交包括体细胞杂交包括4个过程：个过程：原生质体的分离；原生质体的分离；原生质体的融合；原生质体的融合；杂种细胞的选择和植株再生；杂种细胞的选择和植株再生；杂种植株的鉴
26、定。杂种植株的鉴定。第四十七页，本课件共有89页一、原生质体的分离一、原生质体的分离二、原生质体的融合二、原生质体的融合原原生生质质体体融融合合的的过过程程完完全全是是一一个个机机械械过过程程，所所有有植植物物的的原原生生质质体体都都可可以以发发生生融融合。合。有有些些植植物物的的原原生生质质体体可可以以自自发发融融合合，但但大大多多数数植植物物的的原原生生质质体体需需要要在在诱诱导导剂剂的的诱诱导导下下才才能能发发生生。诱诱导导原原生生质质体体的的方方法有化学法和物理法法有化学法和物理法2种。种。第四十八页，本课件共有89页（一）化学诱导法（一）化学诱导法化化学学诱诱导导法法是是利利用用一一
27、些些化化学学物物质质，如如NaNO3、聚聚乙乙二二醇醇（polyethyleneglycol,PEG）、高钙高、高钙高pH等。等。原理：原理：消除原生质体表面的电荷，促进原消除原生质体表面的电荷，促进原生质体彼此靠近、接触，并能促进接触生质体彼此靠近、接触，并能促进接触处的细胞膜发生融解，从而实现原生质处的细胞膜发生融解，从而实现原生质体融合的。体融合的。最常用的是聚乙二醇法和高钙高最常用的是聚乙二醇法和高钙高pH法。法。第四十九页，本课件共有89页(1)聚乙二醇法（聚乙二醇法（PEG）聚聚乙乙二二醇醇（PEG）是是高高分分子子的的有有机机化化合合物物。用用于于诱诱导导原原生生质质体体融融合合
28、PEG的的分分子子量为量为6000。PEG诱诱 导导 融融 合合 剂剂 一一 般般 用用 0.01molL-1CaCl22H2O溶溶液液配配制制，PEG浓浓度度为为30%-50%，蔗蔗糖糖浓浓度度为为4%，可可以以用用高高温温高高压压法灭菌，可以在法灭菌，可以在4下保存。下保存。第五十页，本课件共有89页()高钙高高钙高pH法法高钙高高钙高pH法的诱导剂为：法的诱导剂为：0.05M甘氨酸甘氨酸-NaOH缓冲液缓冲液1.1%CaCl26H2O9%甘露醇甘露醇pH10.4（过滤消毒，随用随配）（过滤消毒，随用随配）第五十一页，本课件共有89页主要步骤：主要步骤：（1）在在离离心心管管中中分分别别将
29、将2种种植植物物的的原原生生质质体体密密度度调调至至5-8105个个/ml，然后等体积混合。，然后等体积混合。（2）向向原原生生质质体体混混合合液液中中加加入入等等体体积积的的诱诱导导融融合合剂剂，轻轻轻轻摇摇匀匀后后，放放置置10min。高高钙钙高高pH法法诱诱导导融融合合时时要保温（要保温（30-37）。）。（3）离离心心（100g，10min），弃弃去去上上清清液液，用用培培养养基基悬浮原生质体。悬浮原生质体。（）重重复复（）次次，最最后后用用培培养养基基调调至至适适当当的的密密度。度。（）培养（液体浅层培养、平板培养等）（）培养（液体浅层培养、平板培养等）第五十二页，本课件共有89页对
30、称体细胞杂交对称体细胞杂交:2个原生质体的细胞质和细胞核完全融合形成一个杂种细胞。不对称杂交：不对称杂交：一个原生质体的细胞质完全丢失，另外一个原生质体的细胞核完全丢失，再融合形成一个杂种细胞。用X射线、射线、碘乙酸、碘乙酰胺处理一个原生质体，使其核失活；用罗丹明（R-6-G，一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程）使另外一个原生质体的细胞质失活。第五十三页，本课件共有89页原生质体原生质体A原生质体原生质体B混合混合诱导剂诱导剂混合，混合，10min反复洗涤反复洗涤调节密度，培养，植株再生调节密度，培养，植株再生杂种植株选择与鉴定杂种植株选择与鉴定射线、化射线、化学物质学物质处理射线、
31、化射线、化学物质学物质处理第五十四页，本课件共有89页化学诱导原生质体融合方法试化学诱导原生质体融合方法试剂便宜，成本低。但操作烦琐，剂便宜，成本低。但操作烦琐，而且化学物质的处理往往会影响而且化学物质的处理往往会影响原生质体的活力，特别是不纯净原生质体的活力，特别是不纯净的的PEG。对原生质体活力的影响与。对原生质体活力的影响与化学物质浓度、时间有关。化学物质浓度、时间有关。第五十五页，本课件共有89页（二）物理方法（电融合，（二）物理方法（电融合，electrofusion）电融合诱导原生质体融合是在电融合电融合诱导原生质体融合是在电融合仪上进行的。通过高频（仪上进行的。通过高频（500K
32、Hz-2MHz）电场脉冲处理原生质体，可以使）电场脉冲处理原生质体，可以使接触处的原生质体发生膜穿孔，最终导致接触处的原生质体发生膜穿孔，最终导致原生质体融合。这种方法操作比较简单，原生质体融合。这种方法操作比较简单，无复杂的原生质体洗涤过程，对原生质体无复杂的原生质体洗涤过程，对原生质体的副作用比较小。但电融合仪非常昂贵。的副作用比较小。但电融合仪非常昂贵。第五十六页，本课件共有89页电融合仪下的薄荷原生质体第五十七页，本课件共有89页Example of protoplast fusion-left:application of AC field,right:application of
33、DC pulse 第五十八页，本课件共有89页原生质体融合是随机过程。在大群原生质体融合是随机过程。在大群体诱导融合时，体诱导融合时，A、B两种原生质体可以两种原生质体可以发生多种融合，如发生多种融合，如A-A，B-B，A-B。其。其中只有中只有A-B是所希望的。挑选杂种细胞是是所希望的。挑选杂种细胞是比较困难的，主要方法有：比较困难的，主要方法有：三、杂种细胞的鉴定三、杂种细胞的鉴定第五十九页，本课件共有89页1.表表观观差差异异：根根据据2种种植植物物显显著著的的表表观观差差异异，找找出出中中间间类类型型的的细细胞胞团团。如如正正常常绿绿色色叶叶和和白白化化叶叶的的原原生生质质体体融融合合
34、后后，其其细细胞胞的的绿绿色色程程度度就会介于就会介于2者之间。者之间。2.选选择择标标记记：抗抗性性（抗抗生生素素、除除草草剂剂）标标记记、营养互补标记、颜色等。营养互补标记、颜色等。第六十页，本课件共有89页PEG法诱导红白菜与榨菜原生质体法诱导红白菜与榨菜原生质体融合与植株再生融合与植株再生第六十一页，本课件共有89页融合过程融合过程第六十二页，本课件共有89页杂种体细胞杂种体细胞,中间颜色中间颜色(黄绿色与红色黄绿色与红色)第六十三页，本课件共有89页杂种体细胞分裂、形成愈伤组织杂种体细胞分裂、形成愈伤组织分化芽分化芽第六十四页，本课件共有89页四、再生植株的鉴定四、再生植株的鉴定原生
35、质体融合后的杂种细胞以后生长情况：1、2个细胞的细胞质和细胞核，保持完整、不丢失,同步分裂。对称体细胞杂交对称体细胞杂交（完全融合）（完全融合）2、一个细胞的细胞质和核完全丢失，变为普通细胞3、一个细胞质完全丢失，另外一个细胞核完全丢失，质-核杂种细胞。不对称杂交不对称杂交4、一个或者两个细胞的细胞质和染色体不同程度丢失，质-核杂种细胞（常常其中1个细胞的绝大部分染色体丢失，部分基因整合到另外一个细胞的基因组中）。不对称杂交不对称杂交。第六十五页，本课件共有89页体细胞杂种再生植株的鉴定：体细胞杂种再生植株的鉴定：1.形态观测：形态观测：2.细胞学分析：细胞学分析：3.分子鉴定：分子鉴定：4.
36、同功酶鉴定同功酶鉴定第六十六页，本课件共有89页再生植株的形态比较再生植株的形态比较红白菜红白菜杂种植株杂种植株榨菜榨菜第六十七页，本课件共有89页拟南芥与油菜原生质体融合再生植株叶片形态拟南芥与油菜原生质体融合再生植株叶片形态拟南芥拟南芥油菜油菜杂种杂种第六十八页，本课件共有89页薄荷原生质体融合再生植株叶片比较第六十九页，本课件共有89页拟南芥拟南芥萝卜萝卜杂种杂种拟南芥和萝卜原生质体融合再生植株比较形态比较形态比较第七十页，本课件共有89页拟南芥拟南芥萝卜萝卜DNA差异差异第七十一页，本课件共有89页叶绿体基因叶绿体基因trnL/TrnF线粒体基因线粒体基因orf138线粒体基因线粒体基
37、因orfB萝卜萝卜萝卜萝卜萝卜萝卜拟南芥拟南芥DNA差异差异第七十二页，本课件共有89页玉米玉米-小麦原生质体融合再生植株小麦原生质体融合再生植株玉米玉米小麦小麦原生质体融合原生质体融合第七十三页，本课件共有89页玉米玉米-小麦原生质体融合再生植株小麦原生质体融合再生植株第七十四页，本课件共有89页玉米玉米-小麦原生质体融合再生植株的染色体小麦原生质体融合再生植株的染色体分析分析第七十五页，本课件共有89页分子方法分子方法(RAPD)鉴定小米鉴定小米-玉米杂种玉米杂种M=玉米玉米W=小麦小麦第七十六页，本课件共有89页植物体细胞杂交的前景与存在的问题植物体细胞杂交的前景与存在的问题 克服了物种
38、之间的生殖隔离，可以实现遗传物质跨种、属、科、目、纲、门、界传递，为培育新品种、甚至新物种提供了手段，前景诱人。存在的问题：存在的问题：1、再生困难：不同原生质体容易融合，但体细胞杂种难分 裂、分化和再生，更难得到同时表现2个植物性状的个体。1978年土豆-番茄（1978年）象番茄，但有土豆的一些特征。2、遗传物质丢失：不同原生质体之间存在严重排斥3、植株稳定性差第七十七页，本课件共有89页第七十八页，本课件共有89页第七十九页，本课件共有89页 从事小麦与近缘及远缘野生种高频率的体细胞杂交技术研究20年，创立了小麦体细胞杂交转移异源染色体小片段的新技术。在此基础上，系统研究了体细胞杂种后代的
39、核/质基因组、异源染色体小片段和DNA片段的遗传规律及与发育和新性状产生的关系。培育了多个耐盐、耐旱体细胞杂种新品种，其中“山融3号”在盐碱地和旱肥地的大面积种植的平均亩产465斤，为盐碱地和旱肥地的利用奠定了基础，该品种被定为2006年山东省良种主导品种。夏光敏，山东大学生命科夏光敏，山东大学生命科学学院教授，博士生导师学学院教授，博士生导师第八十页，本课件共有89页第八十一页，本课件共有89页第八十二页，本课件共有89页新铁炮百合 东方百合 第八十三页，本课件共有89页第八十四页，本课件共有89页亲本植株的花杂种植株的花Oriental Hybrid LilyAcapulcoLilium formolongi HakuchoShirotaeA+CB+C品种第八十五页，本课件共有89页杂种繁殖、栽培杂种繁殖、栽培后后,性状稳定性状稳定东方百合Acapulco 第八十六页，本课件共有89页第八十七页，本课件共有89页流式细胞仪测定细胞内流式细胞仪测定细胞内DNA含量含量第八十八页，本课件共有89页感谢大家观看第八十九页，本课件共有89页