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1、关于植物组织石蜡切片的制作第一页，本课件共有24页石蜡制片的基本步骤石蜡制片的基本步骤1.取材取材2.固定、保存固定、保存3.脱水脱水4.透明透明5.浸蜡与包埋浸蜡与包埋6.切片切片7.粘片与烤片粘片与烤片8.脱蜡与复水脱蜡与复水9.染色染色10.切片脱水、透明和封固切片脱水、透明和封固第二页，本课件共有24页1.取材取材 1.1 材料来源及部位：材料来源及部位：与观察目的有关与观察目的有关 种类种类 部位部位 发育阶段发育阶段 观察横切面还是纵切面？观察横切面还是纵切面？1.2 取材原则：取材原则：动作：快，轻，用力均匀动作：快，轻，用力均匀 体积合适（体积合适（5-10mm为宜）为宜）刀要
2、锋利刀要锋利2.固定、保存固定、保存 目的目的-杀死各种酶，保杀死各种酶，保持细胞的结构持细胞的结构 固定液固定液 固定时间固定时间 固定后的处理固定后的处理第三页，本课件共有24页 最常用的固定液为最常用的固定液为FAA。固定时间不受限制，短则。固定时间不受限制，短则 数小时，长可延至数月或数年。数小时，长可延至数月或数年。配方：配方：50或或70酒精酒精 90毫升毫升 冰醋酸冰醋酸 5毫升毫升 福尔马林福尔马林 5毫升毫升 柔软材料用柔软材料用50酒精，坚硬材料用酒精，坚硬材料用70酒精配制。酒精配制。第四页，本课件共有24页卡诺氏卡诺氏(Carnoys)固定液：有极强的渗透力固定液：有极
3、强的渗透力固定根尖和花药只需固定根尖和花药只需40-60分钟，时间太长不好分钟，时间太长不好(不能超一不能超一天天)。固定后用固定后用95酒精冲洗，在组织不能立即处理时，需转酒精冲洗，在组织不能立即处理时，需转入入70酒精中保存。配法有两种：酒精中保存。配法有两种：第五页，本课件共有24页固定组织时应注意：固定组织时应注意：保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。组织块不易过大过厚，厚度必须控制在组织块不易过大过厚，厚度必须控制在0.3cm以内。以内。固定液必须有足够的量，一般大于组织固定液必须有足够的量，一般大于组织20倍以上。倍以上。抽气：使固定液尽
4、快渗入材料内部，并排除材料内气抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的干扰。泡的干扰。第六页，本课件共有24页组织固定后的处理组织固定后的处理冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，除去留在组织冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。果。材料经过固定后，需要保存下来以备利用，通常使用材料经过固定后，需要保存下来以备利用，通常使用的保存剂是的保存剂是70%70%的酒精溶液，可以使一般的材料保存较的酒精溶液，可以使一般的材料保存较长的时间而不至于变坏。长的时间而不至于变坏。（FAAFAA或卡诺
5、固定液固定不需或卡诺固定液固定不需要冲洗）要冲洗）通常在冰箱中通常在冰箱中4 4存放。存放。第七页，本课件共有24页3.3.脱水脱水水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。剂进入。凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清洗。凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清洗。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混。为了避免组织材料的急剧收缩，应按从明剂相混。为了避免组织材料的急剧收缩，应按从低浓度到高浓度递增的顺序进行低浓度到高浓度递增的顺序进行.30%-50%-70%-85%-95%
6、-100%-100%每步每步30-60分钟左右。分钟左右。第八页，本课件共有24页要求及注意事项要求及注意事项保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净。保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净。不同大小的组织块脱水时间不同。不同大小的组织块脱水时间不同。不能过度脱水（过久使组织变脆、收缩）不能过度脱水（过久使组织变脆、收缩）材料可以放在材料可以放在7070酒精中保存。酒精中保存。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。第九页，本课件共有24页4.4.透明透明纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和
7、石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明透明剂浸渍过程称透明.常用的透明剂有二甲苯、苯、常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍12小时，再转入纯透明剂中浸渍。小时，再转入纯透明剂中浸渍。材料进入无水的透明剂中后，若透明剂变浑浊，说材料进入无水的透明剂中后，若透明剂变浑浊，说明材料中
8、的水分未脱干净，必须回到前面一级无水明材料中的水分未脱干净，必须回到前面一级无水的脱水剂中再次脱水（但是效果往往不好）。的脱水剂中再次脱水（但是效果往往不好）。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及组织特透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及组织特性而定。性而定。第十页，本课件共有24页5.5.浸蜡与包埋浸蜡与包埋用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍合液浸渍1 12 2小时或者过夜，再先后移入熔化的石小时或者过夜，再先后移入熔化的石
9、蜡液中浸渍几天。蜡液中浸渍几天。浸蜡应在高于石蜡熔点浸蜡应在高于石蜡熔点33左右的温箱中进行，以利石蜡左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸入组织内。第十一页，本课件共有24页石蜡熔点：石蜡熔点：45-50 45-50 软蜡软蜡 55-60 55-60 硬蜡硬蜡材料较硬的，用熔点较高的石蜡包埋；材料较硬的，用熔点较高的石蜡包埋；切片较薄时（在切片较薄时（在8 8微米以下），用熔点较高的石蜡微米以下），用熔点较高的石蜡包埋；包埋；夏季采用熔点较高的石蜡（夏季采用熔点较高的石蜡（56,5856,58）,冬季宜选用熔冬季宜选用熔点较低的石蜡（点较低的石蜡（52,5452,54）。）。第十二页，本课
10、件共有24页石蜡的处理：石蜡的处理：新蜡应溶一次，增加密度。新蜡应溶一次，增加密度。并用滤纸过滤去除杂质。并用滤纸过滤去除杂质。加加5%5%10%10%的蜂蜡的蜂蜡(工蜂腹部下面四对蜡腺分泌物质工蜂腹部下面四对蜡腺分泌物质),),增加石蜡的韧性。增加石蜡的韧性。反复溶的旧蜡包埋效果更好。反复溶的旧蜡包埋效果更好。程序：在溶蜡箱中进行，程序：在溶蜡箱中进行，55-60，恒温。，恒温。浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯石蜡（石蜡（1 1）中）中1次，在石蜡中次，在石蜡中2次，每次次，每次1-3天左右。天左右。包埋：在室温进行包埋：在室温进行第十三页，本课件共有24
11、页6.切片切片包埋好的蜡块用刀片修成包埋好的蜡块用刀片修成规整的梯形，粘于小木规整的梯形，粘于小木块上。块上。第十四页，本课件共有24页第十五页，本课件共有24页切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为通常切片厚度为812微米，切出一片接一片的蜡微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。带，用毛笔轻托轻放在纸上。第十六页，本课件共有24页7.粘片与烤片粘片与烤片用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上
12、，以免在以后操作中材料脱落。后操作中材料脱落。在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片，在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片，至于展片台上铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将至于展片台上铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入载玻片放入42温箱中干燥。温箱中干燥。第十七页，本课件共有24页常用的粘片剂为郝伯特常用的粘片剂为郝伯特(Haupt)粘贴剂：粘贴剂：甲液：明胶甲液：明胶 1克克 蒸馏水蒸馏水 100毫升毫升 甘油甘油 15毫升毫升 苯酚苯酚 2克克乙液：甲醛乙液：甲醛 4毫升毫升 蒸馏水蒸馏水 100毫升毫升第十八页，本课件共有24页8.脱蜡及复水脱蜡及复水干燥后的切片需脱蜡及复
13、水才能在水溶性染液行染色。用干燥后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染液行染色。用二甲苯脱蜡，再逐级经梯度酒精复水。二甲苯脱蜡，再逐级经梯度酒精复水。脱蜡（溶蜡）：将切片上的石蜡溶去。一般都用二甲苯脱蜡（溶蜡）：将切片上的石蜡溶去。一般都用二甲苯溶脱蜡。如果脱蜡不彻底，材料的染色就困难。溶脱蜡。如果脱蜡不彻底，材料的染色就困难。复水：脱蜡后的材料从高浓度的酒精溶液（复水：脱蜡后的材料从高浓度的酒精溶液（100%）开始，逐级进入低浓度的酒精溶液，最后一级通常是开始，逐级进入低浓度的酒精溶液，最后一级通常是30%酒精或水，使材料中的水分逐渐增加。如果不经过酒精或水，使材料中的水分逐渐增加。如果不经过复
14、水，材料脱蜡后直接进入染色剂中，材料将会严重变形，复水，材料脱蜡后直接进入染色剂中，材料将会严重变形，甚至难以染色。甚至难以染色。第十九页，本课件共有24页顺序：顺序：二甲苯二甲苯1/2 二甲苯二甲苯+1/2纯酒精纯酒精100%酒精酒精95酒精酒精85酒精酒精70酒精酒精50酒精酒精30酒精酒精水水染色染色以上各级约需以上各级约需510分钟。分钟。第二十页，本课件共有24页9.染色染色染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色和足够强的差异以便于观察。和足够强的差异以便于观察。经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不经染色可显示细胞内不
15、同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。同类型的细胞组织。根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染法。根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染法。番红与固绿染色法番红与固绿染色法 番红用番红用l的水溶液，固绿用的水溶液，固绿用0.5的酒精液的酒精液(用用95的的酒精配制酒精配制)染色步骤如下：染色步骤如下：第二十一页，本课件共有24页第二十二页，本课件共有24页10.切片脱水、透明和封固切片脱水、透明和封固染色后的切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明后，染色后的切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明后，滴加适量（滴加适量（12滴）中性树胶，再将洁净盖玻片滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，进行封片。倾斜放下，进行封片。封固剂：加拿大树胶（封固剂：加拿大树胶（Canada balsam）或中性树）或中性树胶胶第二十三页，本课件共有24页感谢大家观看第二十四页，本课件共有24页