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1、关于酶工程酶的分离纯化第一页，本课件共有132页 酶分离纯化的目的是使酶制剂产酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到应用所需的纯度。品达到应用所需的纯度。第二页，本课件共有132页分离纯化过程包括分离纯化过程包括3 3个基本步骤：个基本步骤：1 1 抽提抽提2 2 纯化纯化3 3 制剂制剂第三页，本课件共有132页Crudeproductconcentrationversussellingprice(Dwyer,1984)第四页，本课件共有132页某些生化物质在原料液中的某些生化物质在原料液中的浓度与价格的关系浓度与价格的关系(1984年年)物质名浓度(C)价格(P，)尿激酶51053108荧光素
2、酶81032106胰岛素41019104头孢菌素10102乙醇11023101第五页，本课件共有132页在分离纯化中必须注意：在分离纯化中必须注意：1 1 防止酶的变性失活；防止酶的变性失活；2 2 在分离纯化过程中的每一步都在分离纯化过程中的每一步都 应检测酶的活性，以确定酶的应检测酶的活性，以确定酶的 纯化程度和回收率。纯化程度和回收率。第六页，本课件共有132页第一节第一节 酶活力的测定酶活力的测定几个名词几个名词1酶活力或酶活性酶活力或酶活性2酶活力单位酶活力单位3mol催化活性（分子活性）和转换催化活性（分子活性）和转换数（催化中心活力数（催化中心活力)4酶的比活力酶的比活力第七页，
3、本课件共有132页酶活力（又称酶活性）酶活力（又称酶活性）(enzymeactivity)（IU/g或或IU/mL)指酶催化一定化学反应的能力；用在指酶催化一定化学反应的能力；用在一定条件下，所催化的反应初速度来表示；一定条件下，所催化的反应初速度来表示；是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分离纯化时的一项必不可少的指标。离纯化时的一项必不可少的指标。第八页，本课件共有132页酶活力单位酶活力单位(enzymeactivityunit)表示酶活力大小的尺度；表示酶活力大小的尺度；一个国际单位（一个国际单位（IU）是指在特定条件下是指在特定条件下（250C），）
4、，每分钟内转化每分钟内转化1 mol底物或催化形底物或催化形成成1 mol产物所需的酶量产物所需的酶量一个一个Kat是指每秒钟内转化是指每秒钟内转化1mol底物所底物所需的酶量，需的酶量，1Kat=6 107IU。第九页，本课件共有132页mol催化活性（分子活性）和催化活性（分子活性）和转换数（催化中心活力）转换数（催化中心活力）mol催化活性是指单位时间内，每个酶催化活性是指单位时间内，每个酶分子所转换的底物分子数目；转换数（分子所转换的底物分子数目；转换数（Kcat)是指酶分子中每个活性中心所转换的底物分子是指酶分子中每个活性中心所转换的底物分子数目。如果酶分子中只有一个活性中心，那么数
5、目。如果酶分子中只有一个活性中心，那么mol催化活性与转换数相等，如果酶分子中含有催化活性与转换数相等，如果酶分子中含有n个活性中心，那么转换数则为个活性中心，那么转换数则为mol催化活性除催化活性除以以n。第十页，本课件共有132页酶的比活力酶的比活力（specificactivity)酶的比活力酶的比活力是酶纯度的量度，是指是酶纯度的量度，是指单位重量酶蛋白所具有的酶活力，单位单位重量酶蛋白所具有的酶活力，单位为为IU/mg。比活力越大，酶纯度越高。比活力越大，酶纯度越高。第十一页，本课件共有132页=酶活力的测定方法：酶活力的测定方法：终止反应法终止反应法和连续反应法。和连续反应法。第十
6、二页，本课件共有132页终止反应法终止反应法在恒温反应系统中，每隔一定时间，在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDSSDS以及加热等使反应立即停止，然后用化以及加热等使反应立即停止，然后用化学法、放射性化学法或酶偶联法分析产物的学法、放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。原理设计出具体的测定方法。第十三页，本课件共有132页连续反应法连续反应法无须终止反应，而
7、是在酶反应过程无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。然后计算出酶活力。第十四页，本课件共有132页酶不可逆失活的原因和机理第十五页，本课件共有132页蛋白质（酶）的失活机理第十六页，本课件共有132页蛋白质不可逆失活的原因蛋白酶水解蛋白酶水解或自溶作用或自溶作用表面活性剂表面活性剂和去垢剂和去垢剂聚合作用聚合作用氧化作用氧化作用机械力机械力变性剂变性剂重金属离子重金属离子和巯基试剂和巯基试剂冷冻和脱水冷冻和脱水热热极端极端pH蛋白质蛋白质不可逆失
8、活不可逆失活脲和胍脲和胍高浓度盐高浓度盐螯合螯合有机溶剂有机溶剂辐射作用辐射作用第十七页，本课件共有132页 蛋白质的稳定化蛋白质的稳定化第十八页，本课件共有132页蛋白质稳定化蛋白质稳定化蛋白质稳定化途径蛋白质稳定化途径如何防止蛋白质的可逆伸展如何防止蛋白质不可逆失活反应发生第十九页，本课件共有132页稳定蛋白质（酶）的方法稳定蛋白质（酶）的方法第二十页，本课件共有132页酶分离的一般流程酶分离的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结
9、晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性第二十一页，本课件共有132页第二节第二节 酶溶液的制备酶溶液的制备第二十二页，本课件共有132页酶溶液的制备：酶溶液的制备：把酶从生物原料中抽提出来，作成酶把酶从生物原料中抽提出来，作成酶溶液溶液 酶溶液的制备包括：材料预处理及细酶溶液的制备包括：材料预处理及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽体液的浓缩胞破碎、抽提、净化脱色、抽体液的浓缩等几个步骤。等几个步骤。第二十三页，本课件共有132页一、材料预处理及细胞破碎一、材料预处理及细胞破碎材料预处理：材料预处理：酶蛋白在细胞内外的分酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶布有三种情况：胞外酶，胞内
10、酶（溶酶和晶酶）。酶和晶酶）。第二十四页，本课件共有132页微生物胞外酶微生物胞外酶 可以用盐析或有机溶剂沉淀可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥等从发酵液中沉淀成酶泥胞内酶胞内酶 要先收集菌体，经细胞破碎要先收集菌体，经细胞破碎后提取后提取第二十五页，本课件共有132页动物材料动物材料 应先剔除结缔组织和脂肪组织应先剔除结缔组织和脂肪组织等等植物材料植物材料 应去皮等以免单宁等物质应去皮等以免单宁等物质着色污染着色污染第二十六页，本课件共有132页细胞破碎：细胞破碎：物理和化学两大类方法物理和化学两大类方法第二十七页，本课件共有132页1 1、物理破碎：、物理破碎：研磨（手磨，球磨
11、和石磨），研磨（手磨，球磨和石磨），机械捣碎（匀浆器和高速组织捣机械捣碎（匀浆器和高速组织捣碎器等），碎器等），高压法，高压法，爆破性减压法，爆破性减压法，专用波振荡，专用波振荡，快速冷冻融化法等。快速冷冻融化法等。第二十八页，本课件共有132页2 2、化学破碎：、化学破碎：渗透作用渗透作用 自溶：自溶：酶处理酶处理 表面活性剂表面活性剂第二十九页，本课件共有132页（I I）渗透作用渗透作用 将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖和并悬浮于含蔗糖和EDTAEDTA的稀的稀TrisTris缓冲液缓冲液中，离心，加入中，离心，加入 MgClMgCl2 2剧
12、烈搅拌，可剧烈搅拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来。使一些水解酶从细胞内释放出来。第三十页，本课件共有132页（IIII）自溶自溶 向菌体中加入醋酸乙酯，甲向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗透苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗透性改变保持一定时间后可以使细性改变保持一定时间后可以使细胞自溶；胞自溶；第三十一页，本课件共有132页（IIIIII）酶处理酶处理 用溶菌酶专一性地分解原核微生用溶菌酶专一性地分解原核微生物细胞壁，使胞内酶释放物细胞壁，使胞内酶释放第三十二页，本课件共有132页（IVIV）表面活性剂表面活性剂 膜结合的晶酶在细胞破碎后膜结合的晶酶在细胞破碎后很难溶解，常借助于表
13、面活性剂很难溶解，常借助于表面活性剂与脂蛋白形成微泡，使之溶解。与脂蛋白形成微泡，使之溶解。第三十三页，本课件共有132页二、抽 提大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；抽提液的具体组成和抽提条件的选抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及有择取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。利于切断酶与其它物质的连结。第三十四页，本课件共有132页1 1、提取的主要方法：、提取的主要方法：（1 1）盐溶液提取）盐溶液提取（2 2）酸溶液提取）酸溶液提取（3 3）碱
14、溶液提取）碱溶液提取（4 4）有机溶剂提取）有机溶剂提取第三十五页，本课件共有132页2 2、酶提取过程的注意事项、酶提取过程的注意事项 pHpH的选择的选择 盐的选择盐的选择 温度的选择温度的选择 抽提液用量抽提液用量 其它其它第三十六页，本课件共有132页pH的选择的选择首先考虑酶的稳定性；其次应首先考虑酶的稳定性；其次应 远离等电点；一般选择远离等电点；一般选择pH4-6pH4-6 为宜。为宜。第三十七页，本课件共有132页盐的选择盐的选择大多数酶在低浓度的盐溶液大多数酶在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，一般选中有较大的溶解度，一般选择等渗盐溶液，如择等渗盐溶液，如0.02-0.05mo
15、l/L的磷酸缓冲液或的磷酸缓冲液或0.15mol/L的的NaCl等。等。第三十八页，本课件共有132页温度的选择温度的选择一般控制在一般控制在0-40C，如果酶如果酶比较稳定可以例外。比较稳定可以例外。第三十九页，本课件共有132页抽提液用量抽提液用量常采用材料量的常采用材料量的1-5倍倍第四十页，本课件共有132页其它加入蛋白酶抑制剂、半胱氨酸或细胞色素C等，来稳定抽提系统。第四十一页，本课件共有132页三、酶溶液的絮凝、净化与脱色三、酶溶液的絮凝、净化与脱色第四十二页，本课件共有132页絮凝絮凝由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排 斥以及多糖蛋白质等大分子物
16、质形成的斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的 水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困 难；因此要用絮凝剂进行处理。难；因此要用絮凝剂进行处理。絮凝剂：多种类型絮凝剂：多种类型 无机：如醋酸钙和磷酸钙等无机：如醋酸钙和磷酸钙等 有机：如聚丙烯酰胺等有机：如聚丙烯酰胺等 天然高分子：如壳多糖等天然高分子：如壳多糖等第四十三页，本课件共有132页过滤或离心净化过滤或离心净化通过絮凝剂处理后的酶溶液通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过滤将细胞碎片等固经过离心或过滤将细胞碎片等固性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以及脂类等大分子物质去除。及脂类等大分子物质
17、去除。第四十四页，本课件共有132页脱色脱色酶的工业生产中，常用的脱酶的工业生产中，常用的脱色剂为活性炭，活性炭通过吸附色剂为活性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性炭用量一般为色素而脱色；活性炭用量一般为0.1%-1.5%。第四十五页，本课件共有132页四、酶溶液的浓缩四、酶溶液的浓缩 冷冻干燥法冷冻干燥法 蒸发法：蒸发法：超过滤法：超过滤法：胶过滤法：胶过滤法：干燥第四十六页，本课件共有132页冷冻干燥法冷冻干燥法先将酶溶液冻成固体，然先将酶溶液冻成固体，然后在真空状态下使水分子从固后在真空状态下使水分子从固体表面直接升华。体表面直接升华。第四十七页，本课件共有132页蒸发法蒸发法目前工业上
18、采用较多的是薄目前工业上采用较多的是薄膜蒸发法，在高度真空状态下使膜蒸发法，在高度真空状态下使酶溶液转变为极薄的液膜，通过酶溶液转变为极薄的液膜，通过加热而迅速汽化，经旋风式汽液加热而迅速汽化，经旋风式汽液分离器达到浓缩的目的。分离器达到浓缩的目的。第四十八页，本课件共有132页超过滤法超过滤法将酶溶液通过只允许小将酶溶液通过只允许小分子物质通过的微孔滤膜，分子物质通过的微孔滤膜，大分子的酶蛋白被截留而达大分子的酶蛋白被截留而达到浓缩的目的。到浓缩的目的。第四十九页，本课件共有132页胶过滤法胶过滤法利用利用SephadexG-250或或G-50吸水膨胀，而酶蛋白被吸水膨胀，而酶蛋白被排阻在胶
19、的外面。排阻在胶的外面。第五十页，本课件共有132页其它方法其它方法吸水剂如用聚乙二醇吸水剂如用聚乙二醇(PEG)PEG)处理小量样品。处理小量样品。第五十一页，本课件共有132页干燥将固体、半固体或浓缩液中水分（或其他溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体过程。方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥第五十二页，本课件共有132页第三节第三节 酶分离纯化的基本过程酶分离纯化的基本过程第五十三页，本课件共有132页一、酶分离纯化方法的选择一、酶分离纯化方法的选择 目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋白的性质差异而建立的，在选择分离纯化方白的性
20、质差异而建立的，在选择分离纯化方法时，要考虑以下几个方面：法时，要考虑以下几个方面：首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面的了解；的了解；以酶活力和比活力为标准，判断所选择的以酶活力和比活力为标准，判断所选择的方法是否得当；方法是否得当；严格控制操作条件，防止酶的变性失活。严格控制操作条件，防止酶的变性失活。第五十四页，本课件共有132页选择生物分离方法的依据选择生物分离方法的依据1物理化学性质物理化学性质2生物体系的特性生物体系的特性3能用作分离和纯化依据的蛋白质性质能用作分离和纯化依据的蛋白质性质第五十五页，本课件共有132页1.物理化学性质物理化学性质分
21、分子子大大小小、分分子子量量、分分子子体体积积、极极性性、偶偶极极矩矩、熔熔点点、沸沸点点、汽汽化化热热、离离子子电电荷荷、溶溶解解度度参参数数、折折射射率率、表表面面张张力力、介介电电常常数数、密密度度、粘粘度度、酸酸碱碱强强度度、pK值值、等等电电点点(pI)等等等等。物物质质之之间间得得以以分分离离的的主主要要依依据据就就是是组组分间的物化性质的差异。分间的物化性质的差异。在在涉涉及及具具有有生生物物活活性性物物质质的的体体系系中中，有有关关这这方方面面的的数数据据与与化化工工产产品品相相比比要要少少得得多多，严严重重影影响响了了生生物物分分离离过过程程的的有有效效进进行行。因因此此，生
22、物体系的物化性质的研究应成为一个重点。生物体系的物化性质的研究应成为一个重点。第五十六页，本课件共有132页2.生物体系的特性生物体系的特性对对一一些些有有生生物物活活性性的的物物质质，不不是是能能够够用用一一般般的的物物化化性性质质来来表表达达的的，这这就就需需要要了了解解这这些些物物质质的的生生物物特特性性，特特别别要要知知道道影影响响生生物物特特性性变变化化的的条条件件和和这这些些物物质质失失活活的的因因素素，包包括括溶溶剂剂、pH值值、温温度度等等等等。这这种种保保持持生生物物质质特特性性不不至至于于改改变变的的措措施就是所谓的稳定性维持。施就是所谓的稳定性维持。第五十七页，本课件共有
23、132页3.能用作分离和纯化依据的蛋白质性质能用作分离和纯化依据的蛋白质性质能能从从混混合合物物中中分分离离和和纯纯化化出出一一种种蛋蛋白白质质是是因因为为不不同同蛋蛋白白质质有有着着不不同同的的物物理理和和化化学学性性质质。这这些些性性质质是是由由于于蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸数数目目和和序序列列不不同同造造成成的的。连连接接在在多多肽肽主主链链上上的的氨氨基基酸酸残残基基可可以以是是带带正正电电荷荷的的或或带带负负电电荷荷的、极性的或非极性的、亲水性的或疏水性的的、极性的或非极性的、亲水性的或疏水性的。此此外外，多多肽肽可可折折叠叠成成非非常常确确定定的的二二级级结结构构(螺螺旋旋、折折
24、叠叠和和各各种种转转角角)和和三三级级结结构构，形形成成独独特特的的大大小小、形形状状和和残残基基在在蛋蛋白白质质表表面面的的分分布布状状况况。利利用用待待分分离离蛋蛋白白质质与与混混合合物物中中其其它它蛋蛋白白质质之之间间在在性性质质上上的的差差异异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。即能设计出一组合理的分级分离步骤。第五十八页，本课件共有132页酶分离纯化方法酶分离纯化方法 根据分子大小建立的分离纯化方法根据分子大小建立的分离纯化方法 根据溶解度建立的分离纯化方法根据溶解度建立的分离纯化方法 根据电荷性质建立的分离纯化方法根据电荷性质建立的分离纯化方法 根据亲和作用建立的分离纯化方法根据亲
25、和作用建立的分离纯化方法 根据稳定性差异建立的分离纯化方法根据稳定性差异建立的分离纯化方法第五十九页，本课件共有132页一、根据分子大小建立的分离纯化方法一、根据分子大小建立的分离纯化方法 透析透析 超过滤超过滤 离心离心 凝胶过滤等。凝胶过滤等。第六十页，本课件共有132页1 1、透、透 析析(Dialysis)(Dialysis)法：法：过程过程：将酶溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲液中，：将酶溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲液中，小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而蛋白质被截留小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而蛋白质被截留在透析袋中；在透析袋中；透析袋类型透析袋类型：有
26、两种，再生纤维素膜透析袋和纤维素酯透：有两种，再生纤维素膜透析袋和纤维素酯透析袋。有多种型号和规格，主要参数是分子量截留值析袋。有多种型号和规格，主要参数是分子量截留值（1 1 10102 2D D）；商品名为）；商品名为spectraporspectrapor等。等。透析袋的预处理透析袋的预处理：干燥的透析袋在制备过程中曾用：干燥的透析袋在制备过程中曾用10%10%甘油处理过，只要浸泡湿润和蒸馏水洗涤即可使用；甘油处理过，只要浸泡湿润和蒸馏水洗涤即可使用；必要时可用必要时可用10mmol/L 10mmol/L 碳酸氢钠，碳酸氢钠，50%50%乙醇和乙醇和10mmol/L 10mmol/L E
27、DTAEDTA处理后，再用蒸馏水洗涤。处理后，再用蒸馏水洗涤。第六十一页，本课件共有132页透析袋透析袋酶溶液酶溶液蒸馏水蒸馏水第六十二页，本课件共有132页透析装置和过程透析装置和过程第六十三页，本课件共有132页2 2、超过滤、超过滤 利用压力或离心力强行使溶质按利用压力或离心力强行使溶质按大小形状的差异分开，将所需的酶分大小形状的差异分开，将所需的酶分子被滤膜截留，而其它较小的分子随子被滤膜截留，而其它较小的分子随溶剂被压到膜的另一侧。溶剂被压到膜的另一侧。第六十四页，本课件共有132页超滤膜超滤膜制备超滤膜的材料多是高分子聚制备超滤膜的材料多是高分子聚合物（如聚砜类，聚四氟乙烯等；目前
28、有圆合物（如聚砜类，聚四氟乙烯等；目前有圆形和卷式等多种超滤膜类型；主要参数是截形和卷式等多种超滤膜类型；主要参数是截留分子量，耐受压力和滤速和有效过滤面积留分子量，耐受压力和滤速和有效过滤面积等；主要商品型号有等；主要商品型号有Amicon DiafloAmicon Diaflo系列等。系列等。超滤器类型超滤器类型有管式，中空纤维式，螺有管式，中空纤维式，螺旋卷绕式和平板式四种类型。旋卷绕式和平板式四种类型。第六十五页，本课件共有132页加压加压酶溶液酶溶液超滤膜超滤膜支持栅板支持栅板超滤液超滤液超滤装置超滤装置第六十六页，本课件共有132页3、离心法、离心法离心是借助于离心机旋转所产生离心
29、是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的的离心力，使不同大小和不同密度的物质分开的技术。物质分开的技术。第六十七页，本课件共有132页（1）离心机的种类和用途）离心机的种类和用途（2）沉降系数）沉降系数S（3）离心方法的选择）离心方法的选择差速离心差速离心密度梯度离心密度梯度离心等密度离心等密度离心（4）离心条件的确定）离心条件的确定离心力离心力离心时间离心时间离心温度和离心温度和pH值值第六十八页，本课件共有132页梯度离心梯度离心密密度度梯梯度度在在离离心心管管内内的的分分布布是是管管底底的的密密度最大度最大,向上逐渐减小向上逐渐减小蔗蔗糖糖便便宜宜，纯纯度度高高，浓浓溶溶
30、液液（60，w/w）密度可达）密度可达1.28g/cm3。聚聚蔗蔗糖糖的的商商品品名名是是Ficoll，它它是是由由蔗蔗糖糖和和1-氯氯-2,3-环环氧氧丙丙烷烷合合成成的的高高聚聚物，物，Mr约约400000。需需要要高高密密度度和和低低渗渗透透压压的的梯梯度度时时，可可用用Ficoll代替蔗糖。代替蔗糖。第六十九页，本课件共有132页4、凝胶过滤法、凝胶过滤法原理原理：又称分子筛层析，在层析柱中填充凝：又称分子筛层析，在层析柱中填充凝胶介质，加入待分离的酶溶液，然后用适当胶介质，加入待分离的酶溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于凝的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于凝胶孔径
31、的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间空隙扩展，下移速度较快，而小于凝胶孔径空隙扩展，下移速度较快，而小于凝胶孔径的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，经过的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，经过一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序从层析柱中流出。从层析柱中流出。第七十页，本课件共有132页凝胶过滤凝胶过滤第七十一页，本课件共有132页凝胶过滤凝胶过滤第七十二页，本课件共有132页TubesmarchinfromleftA280Fraction#第七十三页，本课件共有132页部分使用的担体部分使用的担体目前使用最广泛的担体材料：
32、目前使用最广泛的担体材料：交联后的葡聚糖凝胶交联后的葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺琼脂琼脂其它物料其它物料第七十四页，本课件共有132页二、根据溶解度建立的分离方法二、根据溶解度建立的分离方法1、盐析盐析(SaltingOut)法法2、降低介电常数法（有机溶剂沉淀降低介电常数法（有机溶剂沉淀法）法）3、等电点沉淀法等电点沉淀法4、共沉淀法、共沉淀法5、选择性沉淀法：选择性沉淀法：第七十五页，本课件共有132页1、盐析法盐析法最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，饱和盐溶液的饱和度为饱和盐溶液的饱和度为100%。调整盐浓度有两。调整盐浓度有两种方法：加入饱和
33、硫酸铵溶液（蛋白质溶液体积种方法：加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质溶液体积不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体积较大时）。积较大时）。加入饱和硫酸铵：加入饱和硫酸铵：100ml溶液中，由饱和度溶液中，由饱和度S1变为变为S2，应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的，应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的ml数数V=V0（S1-S2）/（1-S2）。）。直接加入固体硫酸铵可以直接查直接加入固体硫酸铵可以直接查“调整硫酸铵调整硫酸铵溶液饱和度计算表溶液饱和度计算表”。第七十六页，本课件共有132页2、降低介电常数法、降低介电常数法（有机溶剂沉淀法）（有机溶剂沉淀法）降低介
34、电常数方法降低介电常数方法在酶溶液中加入在酶溶液中加入与水互溶的有机溶剂，可以降低介电常与水互溶的有机溶剂，可以降低介电常数，使酶分子间的静电引力增加而发生数，使酶分子间的静电引力增加而发生沉淀。沉淀。第七十七页，本课件共有132页影响介电常数的主要因素：影响介电常数的主要因素：温度温度 有机溶剂有机溶剂 离子强度离子强度 pH pH值：值：第七十八页，本课件共有132页温度：温度：在在0下进行操作；有机溶剂必须下进行操作；有机溶剂必须冷至冷至-15-20，边搅拌边缓慢加入，沉，边搅拌边缓慢加入，沉淀析出后迅速离心分离，并用预冷缓冲淀析出后迅速离心分离，并用预冷缓冲液溶解沉淀。液溶解沉淀。第七
35、十九页，本课件共有132页有机溶剂：有机溶剂：常用的有机溶剂有丙酮，乙醇，常用的有机溶剂有丙酮，乙醇，甲醇，异丙醇等甲醇，异丙醇等第八十页，本课件共有132页离子强度离子强度大多数中性盐在低浓度时能增加酶大多数中性盐在低浓度时能增加酶蛋白的溶解并减少变性，在有机溶剂沉蛋白的溶解并减少变性，在有机溶剂沉淀中加入淀中加入510%（0.05mol）的硫酸铵）的硫酸铵有助于提高分辨率。有助于提高分辨率。第八十一页，本课件共有132页pHpH值值尽可能接近酶的等电点尽可能接近酶的等电点pIpI第八十二页，本课件共有132页3、等电点沉淀法等电点沉淀法酶在等电点处容易发生沉淀酶在等电点处容易发生沉淀第八十
36、三页，本课件共有132页4、共沉淀法、共沉淀法一些大分子非离子型聚合物如聚乙一些大分子非离子型聚合物如聚乙二醇（二醇（PEG）,聚乙烯亚胺（聚乙烯亚胺（PEI）单宁）单宁酸，硫酸链霉素以及表面活性剂酸，硫酸链霉素以及表面活性剂（SDS）等在一定条件下可以直接或间）等在一定条件下可以直接或间接与蛋白质形成络合物而沉淀析出接与蛋白质形成络合物而沉淀析出,再再用适当的方法使酶溶解出来。用适当的方法使酶溶解出来。第八十四页，本课件共有132页5、选择性沉淀法：选择性沉淀法：有些多聚电解质可以在极有些多聚电解质可以在极低浓度下选择性地与某些酶结合而形成沉低浓度下选择性地与某些酶结合而形成沉淀。如聚丙烯酸
37、（淀。如聚丙烯酸（PAA）可以与某些蛋白）可以与某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离过程如下：过程如下：PAA+酶酶酶酶PAA-酶酶+Ca2+PAA-Ca2+酶酶PAA-Ca2+SO42-CaSO4+PAA第八十五页，本课件共有132页三、按蛋白质电荷性质设计的分离方法三、按蛋白质电荷性质设计的分离方法1、吸附法、吸附法（1）物理吸附法）物理吸附法（2）羟基磷灰石法）羟基磷灰石法（3）离子交换吸附法）离子交换吸附法-离子交换色谱法离子交换色谱法2 2、电泳法电泳法（1 1）区带电泳）区带电泳（2 2）等点聚焦电泳）等点聚焦电泳（3 3）高效毛细管电泳
38、）高效毛细管电泳（4 4）聚焦层析）聚焦层析第八十六页，本课件共有132页（1）物理吸附法）物理吸附法(不介绍不介绍)第八十七页，本课件共有132页（2 2）羟基磷灰石法）羟基磷灰石法羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；一般认为其表面的钙离子和磷酸根离子一般认为其表面的钙离子和磷酸根离子与蛋白质带相反电荷的基团发生相互作与蛋白质带相反电荷的基团发生相互作用；在低盐和弱酸或中性条件下进行吸用；在低盐和弱酸或中性条件下进行吸附；洗脱时提高离子强度；多采用柱层附；洗脱时提高离子强度；多采用柱层析方式进行。析方式进行。第八十八页，本课件共有132页 （3 3）离子交换吸附法）离
39、子交换吸附法离子交换色谱法离子交换色谱法利用带电荷的离子交换剂为载利用带电荷的离子交换剂为载体，将带相反电荷的蛋白质吸附，体，将带相反电荷的蛋白质吸附，然后在一定条件下洗脱下来。然后在一定条件下洗脱下来。第八十九页，本课件共有132页离子交换层析过程：离子交换层析过程：离子交换剂的预处理离子交换剂的预处理平衡平衡装柱装柱加样吸附加样吸附洗脱洗脱洗脱液收集与相应检测洗脱液收集与相应检测离子交换剂的再生离子交换剂的再生第九十页，本课件共有132页离子交换剂离子交换剂一般由高分子支持介质（母体）和一般由高分子支持介质（母体）和功能基团（离子交换基）两部分组成。功能基团（离子交换基）两部分组成。第九十
40、一页，本课件共有132页离子交换剂应满足下列要求：离子交换剂应满足下列要求：（1 1）有高度的不溶性有高度的不溶性，即在各种溶剂中进行交换时，交换，即在各种溶剂中进行交换时，交换剂不发生溶解剂不发生溶解（2 2）有疏松的多孔结构或巨大的表面积有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换在交换剂中进行自由扩散和交换（3 3）有较多的交换基团有较多的交换基团（4 4）有稳定的物理化学性质有稳定的物理化学性质，在使用过程中，交换剂不能因，在使用过程中，交换剂不能因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。第九十二
41、页，本课件共有132页离子交换剂的离子交换剂的3 3种类型种类型根据高分子支持介质的性质根据高分子支持介质的性质离子交换树脂离子交换树脂离子交换纤维素离子交换纤维素离子交换球型多糖离子交换球型多糖(如葡聚糖凝胶如葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等和琼脂糖凝胶等)。第九十三页，本课件共有132页2、电泳法、电泳法在直流电场中，由于各种蛋白质分在直流电场中，由于各种蛋白质分子所带电荷不同，移动速度不同，形成子所带电荷不同，移动速度不同，形成各自的区带，用显色剂如各自的区带，用显色剂如CoomassieBlue染色后，可以在支持物上看到蛋白质染色后，可以在支持物上看到蛋白质的颜色谱带，每条带代表一种蛋白质。的
42、颜色谱带，每条带代表一种蛋白质。第九十四页，本课件共有132页基本原理蛋白质是两性电解质，在一定蛋白质是两性电解质，在一定pH下，可解离下，可解离成带电荷的离子，在电场作用下可以向与其电成带电荷的离子，在电场作用下可以向与其电荷相反的方向的电极泳动，泳动速度主要取决荷相反的方向的电极泳动，泳动速度主要取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量及颗粒的于蛋白质分子所带电荷的性质、数量及颗粒的大小和形状。大小和形状。第九十五页，本课件共有132页 由于各种蛋白质的等电点（由于各种蛋白质的等电点（pIpI）不同，分子量）不同，分子量不同，在同一个不同，在同一个pHpH缓冲溶液中所带电荷不同，故缓冲溶液中所
43、带电荷不同，故在电场中的泳动速度也不同，利用此性质，可在电场中的泳动速度也不同，利用此性质，可将混合物中不同蛋白质分离开，也可用其对样将混合物中不同蛋白质分离开，也可用其对样品的纯度进行鉴定。品的纯度进行鉴定。第九十六页，本课件共有132页双向电泳-1第九十七页，本课件共有132页双向电泳-2第九十八页，本课件共有132页双向电泳-3第九十九页，本课件共有132页电泳法电泳法（1 1）区带电泳）区带电泳（2 2）等点聚焦电泳）等点聚焦电泳（3 3）高效毛细管电泳）高效毛细管电泳第一百页，本课件共有132页（1）区带电泳）区带电泳在惰性支持物上进行电泳时样品中各在惰性支持物上进行电泳时样品中各组
44、分迁移速度不同而分布成区带的一类电泳组分迁移速度不同而分布成区带的一类电泳分离方法分离方法按支持物的物理性状可分为按支持物的物理性状可分为3种类型：种类型：膜电泳膜电泳粉末电泳粉末电泳凝胶电泳凝胶电泳第一百零一页，本课件共有132页膜电泳膜电泳以滤纸、聚酰胺薄膜，醋酸以滤纸、聚酰胺薄膜，醋酸纤维薄膜等为支持物的一类电泳纤维薄膜等为支持物的一类电泳分离方法。分离方法。第一百零二页，本课件共有132页粉末电泳粉末电泳以淀粉、纤维素粉或硅胶粉以淀粉、纤维素粉或硅胶粉等为支持物的分离方法。等为支持物的分离方法。第一百零三页，本课件共有132页凝胶电泳凝胶电泳以聚丙烯酰胺为支持物，兼以聚丙烯酰胺为支持物
45、，兼有分子筛效应。有分子筛效应。第一百零四页，本课件共有132页区带电泳的优点区带电泳的优点分辨率较好分辨率较好设备简单设备简单操作方便操作方便第一百零五页，本课件共有132页（2）等点聚焦电泳）等点聚焦电泳利用两性电解质在直流电场中形成利用两性电解质在直流电场中形成一个连续的一个连续的pH梯度，样品中各种蛋白梯度，样品中各种蛋白质在各自的等电点在相应的质在各自的等电点在相应的pH区段聚区段聚集而达到分离的目的。集而达到分离的目的。第一百零六页，本课件共有132页等电聚焦电泳第一百零七页，本课件共有132页高效毛细管电泳高效毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳是在内径为是在内径为25100 m的石英
46、毛细的石英毛细管中进行管中进行电泳，毛细管中填充了缓冲液或凝胶。电泳，毛细管中填充了缓冲液或凝胶。使用毛细管的一个使用毛细管的一个优点优点是是:它减少了由于热效应产生它减少了由于热效应产生的许多问题，因为管的孔径小，面积与体积之比大，的许多问题，因为管的孔径小，面积与体积之比大，这样可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散这样可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入稳定介质即可进行自由流动电泳。稳定介质即可进行自由流动电泳。第一百零八页，本课件共有132页第一百零九页，本课件共有132页聚丙烯酰胺凝
47、胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺作为支持）是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳方法。物的一种电泳方法。PAGE方法成了研究蛋白质和核酸等大分子物质的方法成了研究蛋白质和核酸等大分子物质的重要工具之一重要工具之一.第一百一十页，本课件共有132页实践中可根据不同目的选择所需的类型。实践中可根据不同目的选择所需的类型。一般单向一般单向PAGE多用于分离具有活性的生物物质，多用于分离具有活性的生物物质，而双向或梯度而双向或梯度PAGE则宜用于较难分离鉴别的生物大分子物质。则宜用于较
48、难分离鉴别的生物大分子物质。如如果果在在PAGE时时加加入入适适量量十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠（SDS）可可用用于于测测定定蛋蛋白质的分子质量；白质的分子质量；如果如果PAGE与等电聚焦相结合时，可用于分析蛋白质的等电点。与等电聚焦相结合时，可用于分析蛋白质的等电点。除除这这些些用用途途外外，PAGE还还可可用用于于制制备备少少量量的的纯纯度度高高、有有活活性的生物大分子物质性的生物大分子物质第一百一十一页，本课件共有132页 聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，电泳颗粒通过网状结构的空隙时受到摩聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，电泳颗粒通过网状结构的空隙时受到摩擦力的作用，摩擦力的大小与样品颗粒
49、的大小呈正相关。擦力的作用，摩擦力的大小与样品颗粒的大小呈正相关。基本原理基本原理聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺（丙烯酰胺（acrylamideAcr）单体（）单体（monomer）N，N-甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene-bisacrylamide，Bis）交联剂（）交联剂（crosslinker）聚合聚合交联交联第一百一十二页，本课件共有132页原理：原理：当向蛋白质溶液中加入足够量当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基和巯基乙醇乙醇，SDS能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用，能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用，使蛋白质变性而改变原有的构象，特别是强还原剂使
50、蛋白质变性而改变原有的构象，特别是强还原剂硫基乙醇的存在，使蛋白质分子内的二硫键还原，硫基乙醇的存在，使蛋白质分子内的二硫键还原，从而保证蛋白质与从而保证蛋白质与SDS结合形成带负电荷的结合形成带负电荷的蛋白蛋白质质-SDS复合物复合物。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第一百一十三页，本课件共有132页蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于 如果加入一种试剂消除电荷、形状等因素的影响，使电泳迁如果加入一种试剂消除电荷、形状等因素的影响，使电泳迁移率只取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。移率只取决于分子的大小，