目的基因的获取精选课件.ppt

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1、关于目的基因的获取关于目的基因的获取第一页，本课件共有78页生物种类生物种类 人人拟南芥拟南芥果蝇果蝇水稻水稻蠕虫蠕虫流感病毒流感病毒基因数目（万个）基因数目（万个）34 2.55 1.36 5 1.78 0.175单个单个genegene在整个基因组中所占的比例极其在整个基因组中所占的比例极其微小，加上复杂的基因间序列；对单个目微小，加上复杂的基因间序列；对单个目的的genegene的分离如同大海捞针。的分离如同大海捞针。第二页，本课件共有78页已知基因的获取方法：PCR技术扩增目的基因化学方法人工合成目的基因第三页，本课件共有78页未知基因的获得途径：构建基因组文库利用鸟枪法克隆目的基因

2、2.构建cDNA文库，筛选目的基因 3.mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 4.酵母双杂交体内鉴定基因第四页，本课件共有78页本本 章章 内内 容容 第一节第一节 基因组基因组DNA的的片断化片断化第二节第二节 基因的化学合成基因的化学合成 第三节第三节 目的基因的保存目的基因的保存和扩增和扩增 第四节第四节 目的基因的分离目的基因的分离和扩增和扩增 第五页，本课件共有78页第一节第一节 基因组基因组DNA的片断化的片断化 二、限制性内切酶消化法二、限制性内切酶消化法 一、一、机械切割法机械切割法第六页，本课件共有78页一一.机械切割法机械切割法（1）超声波）超声波断裂成约300bp的随机片

3、断（2）高速搅拌）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断（3）移液器抽吸法）移液器抽吸法第七页，本课件共有78页二、限制性内切酶消化法二、限制性内切酶消化法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切酶切 基因组基因组DNA第八页，本课件共有78页1.优点优点 如果带有粘性末端，产物可以如果带有粘性末端，产物可以如果带有粘性末端，产物可以如果带有粘性末端，产物可以 直接与载体连接，连接效率高直接与载体连接，连接效率高直接与载体连接，连接效率高直接与载体连接，连接效率高第九页，本课件共有78页2.缺点缺点目的基因目的基因内部内部可能有内切酶的切点可能有内切酶的切

4、点BamH IBamH IBamH IGene目的基因也被切成碎片！目的基因也被切成碎片！第十页，本课件共有78页消化的片断分子量太大或太小消化的片断分子量太大或太小不符合载体容量，不能克隆不符合载体容量，不能克隆解解 决决 的的 办办 法法采用随机片断化制备采用随机片断化制备DNADNA的克隆片断的克隆片断第十一页，本课件共有78页3.限制性内切酶局部消化法限制性内切酶局部消化法控制内切酶的控制内切酶的用量用量和和消化时间消化时间，使基因组中的酶切，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。位点只有一部分被随机切开。内切酶识别位点的碱基数内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度

5、影响所切出的产物的长度和随机程度限制性内切酶的选用原则限制性内切酶的选用原则第十二页，本课件共有78页1）4bp的内切酶的内切酶平均每平均每4096（46）bp一个切点。一个切点。2）6bp的内切酶的内切酶平均每平均每256（44）bp一个切点一个切点随机程度高随机程度高。如。如Hae、AluI、MobI、Sau3AI 内切酶粘性末端内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连能与常用克隆位点相连Sau3AIBamH I5-GATC-35-G GATC-3第十三页，本课件共有78页 文库：是指一种全体的集合。文库：是指一种全体的集合。通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组通过克隆方法保存在适当宿主中

6、的某种生物、组通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有织、器官或细胞类型的所有织、器官或细胞类型的所有织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的片段而构成的片段而构成的片段而构成的克隆集克隆集克隆集克隆集合体合体合体合体。克隆并不是为了保存，而是为了分离。克隆并不是为了保存，而是为了分离。克隆并不是为了保存，而是为了分离。克隆并不是为了保存，而是为了分离。第三节第三节 目的基因的保存和扩增目的基因的保存和扩增一、基因文库一、基因文库（gene library）1.基因文库基因文库第十四页，本课件共有78页为什么要建基因文库？为

7、什么要建基因文库？n n高等生物的基因组DNA十分复杂，单个基因在基因组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很小。因此，要想从庞大的基因组中分离某个特定的未知基因非常难的，必须构建基因文库，利用文库筛选技术获得该基因的阳性克隆，然后对其进行分析。第十五页，本课件共有78页基因文库的分类基因文库的分类n n基因组文库：基因组文库：提取染色体基因组提取染色体基因组DNADNA。如果要。如果要研究的是控制基因表达的调控序列，或是在研究的是控制基因表达的调控序列，或是在mRNAmRNA中不存在的某种特定序列。中不存在的某种特定序列。n ncDNAcDNA文库：文库：mRNAmRNA反转录成的反转录成

8、的cDNAcDNA。如果研究的。如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸序列，可以根目标是弄清一种蛋白质的氨基酸序列，可以根据克隆的据克隆的cDNAcDNA分子的核苷酸序列推导出来。分子的核苷酸序列推导出来。第十六页，本课件共有78页mRNA结构图结构图DNA结构图结构图第十七页，本课件共有78页2.基因文库的构建基因文库的构建载体的制备载体的制备 DNA的提取及片段化、的提取及片段化、cDNA的合成的合成 载体与插入片段的连接 重组重组DNA分子导入宿主菌分子导入宿主菌 转化细胞的筛选转化细胞的筛选第十八页，本课件共有78页 将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基因组整个基因组DNA切割成大小

9、合适的切割成大小合适的片断，并将片断，并将所有这些片断所有这些片断都与适当的载体连接，引入都与适当的载体连接，引入相应的相应的宿主细胞中宿主细胞中繁殖保存和扩增。繁殖保存和扩增。二、基因组文库的构建二、基因组文库的构建1.基因组文库基因组文库理论理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因第十九页，本课件共有78页筛选目的基因筛选目的基因第二十页，本课件共有78页目前常用的载体目前常用的载体 2.载体选用载体选用载体能够容载的载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建片断大小直接影响到构建完整完整的的基因文库所需要的重组子的数目。基因文库所需要的

10、重组子的数目。载体容量越大，所要求的载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少片断数目越少对载体的要求对载体的要求 载体系列：容量为载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为载体：容量为50kbYAC：容量为：容量为1MbBAC:容量为容量为 300kb第二十一页，本课件共有78页（1）噬菌体载体噬菌体载体最常用最常用 插入型载体插入型载体构建文库时，通常用限制性核酸内切酶构建文库时，通常用限制性核酸内切酶切割位于切割位于噬菌体噬菌体DNA非必需区的单一酶切位点，以供非必需区的单一酶切位点，以供外源基因片段的插入，插入片段适宜长度约为外源基因片段的插入，插入片段适宜长度约为9kb。替代型载

11、体替代型载体构建文库时，需要将非必需区两边的臂进构建文库时，需要将非必需区两边的臂进行分析纯化，才能用于连接，插入片段适宜长度约为行分析纯化，才能用于连接，插入片段适宜长度约为922kb。第二十二页，本课件共有78页第二十三页，本课件共有78页（2）黏粒载体）黏粒载体 不仅能克隆和增殖不仅能克隆和增殖完整完整的真核基因，还可克隆和分析的真核基因，还可克隆和分析组成某一组成某一基因家族基因家族或或基因座基因座的真核的真核DNA片段。片段。构建过程与噬菌体文库的构建过程相似。构建过程与噬菌体文库的构建过程相似。（3）YACYAC、BACBAC载体载体载体载体 克隆大片断克隆大片断DNA的载体。的载

12、体。可用来克隆完整的动物基因。在人类基因组计划中，可用来克隆完整的动物基因。在人类基因组计划中，YAC被广泛地用于大规模基因组结构分析。被广泛地用于大规模基因组结构分析。第二十四页，本课件共有78页最早用于基因克隆的载体。最早用于基因克隆的载体。只能容纳比质粒分子量更小的片段。不能用于核基因组文库。不能用于核基因组文库。适合于短序列的克隆文库。叶绿体适合于短序列的克隆文库。叶绿体DNADNA文库、线粒体DNADNA文库、文库、cDNAcDNA文库。文库。（4 4）质粒载体）质粒载体）质粒载体）质粒载体第二十五页，本课件共有78页3.基因组文库构建的一般步骤基因组文库构建的一般步骤（1）基因组）

13、基因组DNA的提取的提取关键关键:制备制备高分子质量高分子质量的基因组的基因组DNA经典的方法：经典的方法：在在EDTA和和SDS存在下，用蛋白酶存在下，用蛋白酶K消化细胞，然后用酚消化细胞，然后用酚氯仿混合液抽提蛋白质，并用透析法去除分子质量杂氯仿混合液抽提蛋白质，并用透析法去除分子质量杂质。质。在提取时必须尽可能地避免机械切割在提取时必须尽可能地避免机械切割第二十六页，本课件共有78页关键：关键：断点完全断点完全随机随机，片断长度合适于载体连接，片断长度合适于载体连接（2）DNA克隆片段的制备克隆片段的制备超声波（超声波（300bp）或机械搅拌（）或机械搅拌（8kb）物理切割法：物理切割法

14、：内切酶内切酶Sau3A进行局部消化。进行局部消化。可得到可得到10-30kb的随机片断的随机片断 酶切法：酶切法：第二十七页，本课件共有78页第二十八页，本课件共有78页（3）载体与基因组）载体与基因组DNA大片段的连接大片段的连接 粘性末端直接连接粘性末端直接连接载体与外源载体与外源DNA大片段的两个末端都有大片段的两个末端都有相同的粘性末端。相同的粘性末端。如：如：Sau3A与与BamHI的酶切末端。的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾直接连接、人工接头或同聚物加尾人工接头法人工接头法人工合成的限制性内切酶粘性末端片断人工合成的限制性内切酶粘性末端片断第二十九页，本课件共有78页各

15、种酶的接头可以向公司定做或购买各种酶的接头可以向公司定做或购买接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶粘性末端粘性末端 同聚物加尾同聚物加尾第三十页，本课件共有78页第三十一页，本课件共有78页4.基因组文库的大小基因组文库的大小一个文库要包含一个文库要包含99%的基因组的基因组DNA时所需要的克隆数目时所需要的克隆数目N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组文库包含了整个基因组DNA的概率（的概率（99%）f:插入载体的插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因片断的平均长度占整个基因 组组DNA的百分数的百分数N:所需的重组载体数（克隆数）所需

16、的重组载体数（克隆数）基因文库的大小以及从中获得特定序列的概率的计算公式：基因文库的大小以及从中获得特定序列的概率的计算公式：第三十二页，本课件共有78页例如：例如：人的基因组是人的基因组是 3109 bp，插入，插入DNA片断片断 的平均长度如果是的平均长度如果是1.7104 bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61GfN=4.61GfG:Genome大小；大小；f:fragment大小大小N=4.61Gf=4.6131091.7104=8.1105第三十三页，本课件共有78页第三十四页，本课件共有78页5.基因组文库的扩增及保存基因组文库的扩增及保存

17、（1）基因组文库的扩增基因组文库的扩增 液体培养增殖法液体培养增殖法最简便最简便 混合培养方法：混合培养方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆子转入含适当的抗生素培养基中，抗生素培养基中，混合混合的细菌生长数代后，其培养物于的细菌生长数代后，其培养物于-80 储存储存（加终浓度为（加终浓度为25%的甘油）的甘油）缺点：由于细菌在液体中以混合群体的形式生长和不同克隆生长缺点：由于细菌在液体中以混合群体的形式生长和不同克隆生长速率的差异，导致文库中某些特定的序列过多或过少。速率的差异，导致文库中某些特定的序列过多或过少。第三十五页，本课件共有78页 保存单

18、个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-80 保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大。第三十六页，本课件共有78页384孔板第三十七页，本课件共有78页 影印滤膜培养法影印滤膜培养法失真最小，最麻烦失真最小，最麻烦 用包装后的噬菌体颗粒感染细菌，并让细菌在硝用包装后的噬菌体颗粒感染细菌，并让细菌在硝 酸纤酸纤维素膜上生长，然后将滤膜上的文库影印到其他滤膜上，维素膜上生长，然后将滤膜上的文库影印到其他滤膜上，以供筛选和低温（以供筛选和低温（-80）保存。）保存。制备已包装的转导性裂解物制备已包

19、装的转导性裂解物 适用于粘粒文库，转导性裂解物可以在低温下长期适用于粘粒文库，转导性裂解物可以在低温下长期保存。保存。第三十八页，本课件共有78页（2）基因组文库的保存基因组文库的保存小包装，方便，避免反复冻融小包装，方便，避免反复冻融 噬菌体一类的基因文库：噬菌体一类的基因文库：密封，加入少许密封，加入少许 氯仿，在氯仿，在4 冰箱内可较长时间地保存冰箱内可较长时间地保存 （6个月），低温冰箱可保存数年。个月），低温冰箱可保存数年。第三十九页，本课件共有78页500kb50-300kb第四十页，本课件共有78页100-300kb，浓缩产物浓度达到100ng/ul第四十一页，本课件共有78页第

20、四十二页，本课件共有78页第四十三页，本课件共有78页第四十四页，本课件共有78页第四十五页，本课件共有78页第四十六页，本课件共有78页三、三、cDNA文库的构建文库的构建cDNA文库：是指某种生物体某一发育时期所转录的 全部的mRNA经反转录形成的cDNA片段 与某种载体连接而形成的克隆的集合。cDNA文库具有组织细胞特异性文库具有组织细胞特异性，具有时效性。为什么要构建cDNA文库？真核生物的基因组DNA庞大且含有大量的重复序列，难以分离到目的基因片段。第四十七页，本课件共有78页1.cDNA以以mRNA为模板逆转录出的为模板逆转录出的DNA称称cDNA。mRNAcDNA3355反转录酶

21、反转录酶引物引物2.cDNA文库的特点文库的特点（1）不含内含子序列）不含内含子序列（2）可以在细菌中直接表达）可以在细菌中直接表达（3）包含了所有编码蛋白质的基因（时效性）包含了所有编码蛋白质的基因（时效性）（4 4）比基因组DNADNA文库小得多，容易构建文库小得多，容易构建第四十八页，本课件共有78页3.构建构建cDNA文库的一般步骤文库的一般步骤第四十九页，本课件共有78页第五十页，本课件共有78页（1）mRNA的来源的来源特点特点：多数基因的表达具有不同程度的组织特异多数基因的表达具有不同程度的组织特异 性和发育阶段性。性和发育阶段性。选用选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等含

22、量高的组织材料，或通过药物等 方法提高方法提高mRNA的含量。的含量。高丰度高丰度：当特定的当特定的mRNA在细胞总在细胞总mRNA群体中所占群体中所占 比例达到比例达到5090时。时。低丰度低丰度：当上述比例小于当上述比例小于0.5时。时。第五十一页，本课件共有78页分离分离mRNA用商业化的用商业化的Oligo dT纤维柱。纤维柱。利用真核生物mRNA都含有一段30300个A组成的polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-5%。（2）mRNA的分离纯化的分离纯化 原理原理 mRNA的分离纯化的分离纯化纤维素柱层析法纤维素柱层析法第五

23、十二页，本课件共有78页第五十三页，本课件共有78页 mRNA的长度的长度 哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb。第五十四页，本课件共有78页反转录酶反转录酶（3 3）cDNAcDNA的合成的合成的合成的合成 cDNA第一链合成第一链合成逆转录酶能以逆转录酶能以RNA为模板合成为模板合成DNA。a.Oligo dT引导合成法引导合成法 从从3-开始，无法到达开始，无法到达5-末端末端 mRNAcDNA355AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物RNADNA杂交分子杂交分子第五十五页，本课件共有78页mRNA第五十六页，本课件共有78页b

24、.随机引物引导的随机引物引导的cDNA合成法合成法 合成合成610个核苷酸长的寡核苷酸短片段，作个核苷酸长的寡核苷酸短片段，作 为合成第一链为合成第一链cDNA的引物。的引物。随机引物随机引物可用于合成特长的可用于合成特长的mRNA分子分子5mRNA3第五十七页，本课件共有78页用用碱碱处理处理或用或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分杂交分子中的子中的mRNA。mRNAcDNA3355反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一第一链链3355引物引物cDNA第一链第一链35引物引物 降解降解mRNA模板模板RNaseH第五十八页，本课件共有78页剩下的剩下的cDNA单链的单链的3末

25、端一般形成一个末端一般形成一个弯回来的双链弯回来的双链发卡结构发卡结构（机理不明），可成为合成第二条（机理不明），可成为合成第二条cDNA链链的引物。用的引物。用DNA聚合酶合成第二链聚合酶合成第二链DNA。cDNA第一第一链链5cDNA第二链合成第二链合成DNA聚合聚合酶酶cDNA第一第一链链cDNA第二第二链链53 cDNA第二链合成第二链合成自我引导合成法自我引导合成法第五十九页，本课件共有78页去掉发卡结构去掉发卡结构核酸酶核酸酶S1用用核酸酶核酸酶S1可以切掉发卡结构（这会导致可以切掉发卡结构（这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。中有用的序列被切掉！）。cDNA第一第一链链cDN

26、A第二第二链链53cDNA第一第一链链cDNA第二第二链链5353第六十页，本课件共有78页第六十一页，本课件共有78页这种酶能识别这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA，并，并将其降解成许多将其降解成许多小片断小片断。妙用妙用RNaseH（置换合成法）（置换合成法）小片断正好成为小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成聚合酶的引物，用来合成冈崎冈崎片断片断。优点：优点：a）合成）合成cDNA的效率高的效率高 b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化）直接利用第一链的反应产物，不需纯化 c）避免使用）避免使用S1核酸酶来切割双链核酸酶来切割双链cDNA第六十二页，本课件

27、共有78页mRNAcDNA35反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一链第一链35引物引物mRNAcDNA第一链第一链35mRNAmRNADNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶cDNA第二链第二链cDNA第一链第一链35RNaseHDNA ligase去引物去引物第六十三页，本课件共有78页第六十四页，本课件共有78页在双链在双链cDNA末端接上末端接上人工接头人工接头，即可与载体连接，即可与载体连接，转入受体菌。转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的的3端分别加端分别加上几个上几个C或或G，成为粘性末端。，成为粘性末端。（4）cDNA与载体连接：与载

28、体连接：接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶第六十五页，本课件共有78页第六十六页，本课件共有78页4.cDNA文库的大小文库的大小一个一个cDNA文库要包含文库要包含99%的的mRNA时所需要的时所需要的克隆数目。克隆数目。:某一种低丰度（不足某一种低丰度（不足14份拷贝）份拷贝）mRNA占细胞整占细胞整个个mRNA的比例的比例N=ln(1-p)ln(1-)1nP:文库包含了完整文库包含了完整mRNA的概率（的概率（99%）N:所需的重组载体数（克隆数）所需的重组载体数（克隆数）1n第六十七页，本课件共有78页cDNAcDNAcDNAcDNA文库构建的实例

29、文库构建的实例文库构建的实例文库构建的实例第六十八页，本课件共有78页第六十九页，本课件共有78页三、三、cDNA和基因组文库的区别和基因组文库的区别第七十页，本课件共有78页第七十一页，本课件共有78页Genome DNA library基因组基因组DNA生物体的每个生物体的每个gene有有一个一个clonecDNA librarymRNA只包含生物体特定只包含生物体特定组织、特定发育阶组织、特定发育阶段表达的段表达的gene出发材料：出发材料：所包含所包含gene:第七十二页，本课件共有78页（一）（一）cDNA文库文库1.cDNA文库的优点文库的优点 可用于可用于RNA病毒的文库构建，为

30、什么？病毒的文库构建，为什么？文库的筛选比较简单易行文库的筛选比较简单易行第七十三页，本课件共有78页2.cDNA文库的特殊用途文库的特殊用途克隆在细菌中表达的基因克隆在细菌中表达的基因基因序列结构的测定基因序列结构的测定 真核生物基因的间隔子真核生物基因的间隔子DNA序列在与其基因对应的细胞质序列在与其基因对应的细胞质mRNA中是不存在的，具有不间断的中是不存在的，具有不间断的mRNA拷贝的拷贝的cDNA可用于可用于细菌中表达细菌中表达 可有效地用于分析间断基因的结构。在已知基因组可有效地用于分析间断基因的结构。在已知基因组DNA序列序列的情况下，通过的情况下，通过cDNA比较，可以研究出间

31、隔子和表达子间的界比较，可以研究出间隔子和表达子间的界线。线。用于分离组织或发育阶段特异性基因用于分离组织或发育阶段特异性基因第七十四页，本课件共有78页3.cDNA文库的局限性文库的局限性只反映只反映mRNA的分子结构，只克隆具有蛋白质产物的分子结构，只克隆具有蛋白质产物的结构基因和调节基因；不能克隆基因组的结构基因和调节基因；不能克隆基因组DNA中的中的非转录区段的序列，没有包括基因组非转录区段的序列，没有包括基因组DNA的间隔序的间隔序列列 不利于低丰度不利于低丰度mRNA的的cDNA的克隆的克隆受细胞来源或发育时期的影响，受细胞来源或发育时期的影响，cDNA文库所包含的遗文库所包含的遗

32、传信息远远少于基因组传信息远远少于基因组DNA文库文库第七十五页，本课件共有78页（二）基因组（二）基因组DNA文库文库1.基因组基因组DNA文库的优点文库的优点更有效地用于真核细胞中表达外源的真核基因更有效地用于真核细胞中表达外源的真核基因克隆的是全部遗传信息，不受时空的影响克隆的是全部遗传信息，不受时空的影响克隆的是任何基因，包括未知功能的克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列序列第七十六页，本课件共有78页2.基因组基因组DNA文库的局限性文库的局限性不能用于不经过不能用于不经过DNA中间体的中间体的RNA病毒的克隆病毒的克隆筛选的克隆数多，工作量大筛选的克隆数多，工作量大,直接分离目的直接分离目的gene的的DNA序列非常困难序列非常困难第七十七页，本课件共有78页感谢大家观看第七十八页，本课件共有78页