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1、关于体内药物分析方法的建立与验证1第一页，本课件共有100页2第一节第一节 分析方法的设计依据分析方法的设计依据 在建立分析方法之前，应充分利用现代科技成就和前人的研在建立分析方法之前，应充分利用现代科技成就和前人的研究成果，究成果，系统检索国内外的科技文献系统检索国内外的科技文献，对药物在生物体内的存，对药物在生物体内的存在状况、药代动力学参数、分析检测方法等相关资料加以在状况、药代动力学参数、分析检测方法等相关资料加以分析和研究，以供借鉴。对于尚无文献报道的药物，亦可分析和研究，以供借鉴。对于尚无文献报道的药物，亦可参考同类药物的相关文献。参考同类药物的相关文献。检索文献，可在最短时间、最
2、小的花费（磨刀不误砍检索文献，可在最短时间、最小的花费（磨刀不误砍柴工）建立一个好的分析方法！这是柴工）建立一个好的分析方法！这是试验前要做的第一件试验前要做的第一件事事！大四的同学们，你们查过文献吗？大四的同学们，你们查过文献吗？第二页，本课件共有100页3血药浓度血药浓度 94-2008 5122篇篇第三页，本课件共有100页4第四页，本课件共有100页5第五页，本课件共有100页61992年创刊的年创刊的中国临床药学杂志中国临床药学杂志 2001年第二军医大学长海医院主办的年第二军医大学长海医院主办的药学服务与研究药学服务与研究两刊于两刊于20042004年同时成为中国科技核心期刊年同时
3、成为中国科技核心期刊 临床药学专业性的学术期刊有：临床药学专业性的学术期刊有：第六页，本课件共有100页7不想当将军的士兵不是好士兵不想当将军的士兵不是好士兵 容量大的容量大的U盘：盘：中国临床药学杂志中国临床药学杂志、药学服务与研药学服务与研究究中大量的相关文献拷贝下来中大量的相关文献拷贝下来 另外以另外以“临床药学临床药学”、“临床药师临床药师”、“合理用药合理用药”、“药学监护药学监护”、“血药浓度血药浓度”等为关键词，查找相关的文献，等为关键词，查找相关的文献，copy!看文献看文献 写论文写论文 提职称提职称第七页，本课件共有100页8这门课有两个实验，要求大家以这门课有两个实验，要
4、求大家以论文论文的形式写实验报告！的形式写实验报告！实验一实验一 改进的柱前衍生改进的柱前衍生-HPLC法测定丙戊酸钠的血药浓度法测定丙戊酸钠的血药浓度 由老师提供文献。看完文献后，考虑一个问题：该如何设计、优由老师提供文献。看完文献后，考虑一个问题：该如何设计、优化实验条件？化实验条件？实验二实验二 姜黄素姜黄素-PVP固体分散体在兔体内的药代动力学参数的测定固体分散体在兔体内的药代动力学参数的测定 大家到图书馆电子阅览室查阅文献！大家到图书馆电子阅览室查阅文献！关键词：姜黄素，血药浓度关键词：姜黄素，血药浓度 或：姜黄素或：姜黄素，（药代）动力学，（药代）动力学 要看要看PDF 文档，电脑
5、要安装文档，电脑要安装 ADOBE READER软件软件 第八页，本课件共有100页9一、一、待测药物的理化性质及体内存在状况待测药物的理化性质及体内存在状况 准确测定准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物通过生物样品中的药物或其特定代谢物通过生物样品中的药物或其特定代谢物通过生物样品中的药物或其特定代谢物通过一定的生物样品预处理使待测物从结合物或缀合物中一定的生物样品预处理使待测物从结合物或缀合物中一定的生物样品预处理使待测物从结合物或缀合物中一定的生物样品预处理使待测物从结合物或缀合物中释放出来。故此，应首先考虑样品释放出来。故此，应首先考虑样品释放出来。故此，应首先考虑样品释放出来。故此
6、，应首先考虑样品预处理方法预处理方法预处理方法预处理方法待测药物的待测药物的待测药物的待测药物的理化性质理化性质药物在生物体内的药物在生物体内的药物在生物体内的药物在生物体内的存在状况存在状况药物在生物体内的药物在生物体内的生物转化生物转化(代谢代谢代谢代谢)途径途径建立分析检测方法的主要依据有：建立分析检测方法的主要依据有：第九页，本课件共有100页10(一一)待测药物的理化性质待测药物的理化性质 药药物物的的pKa值值、亲亲脂脂性性、溶溶解解度度、分分配配系系数数等等决决定定预处理方法及萃取方法预处理方法及萃取方法具有具有亲脂性亲脂性在适当的在适当的pH值下用值下用溶剂萃取溶剂萃取具具有有
7、强强极极性性或或亲亲水水性性沉沉淀淀蛋蛋白白、固固相相萃萃取取、离离子子对萃取或衍生化后萃取对萃取或衍生化后萃取等等具有具有挥发性挥发性GC测定法测定法具有具有光谱或电化学特性光谱或电化学特性分析检测方法分析检测方法药物的药物的稳定性稳定性萃取浓缩技术萃取浓缩技术对酸碱不稳定对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定对热不稳定避免高温蒸发溶剂避免高温蒸发溶剂-一个例子一个例子第十页，本课件共有100页11另一个“两弹一星”：拯救5亿人的“中国神药”-青蒿素 疟疾是危害人类最大的疾病之一。全球每年疟疾病疟疾是危害人类最大的疾病之一。全球每年疟疾病人超过人超过5亿，死
8、亡亿，死亡100万人以上。万人以上。屠呦呦：古医书中有青蒿治疗疟疾的记录。起初青蒿屠呦呦：古医书中有青蒿治疗疟疾的记录。起初青蒿的有机溶剂提取物对疟疾的抑制率很低，不甘愿，又的有机溶剂提取物对疟疾的抑制率很低，不甘愿，又翻出古医书：翻出古医书：“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之。尽服之。”和中药常用的煎熬法不同？原来里面用和中药常用的煎熬法不同？原来里面用的是青蒿鲜汁！的是青蒿鲜汁！改用沸点较低的乙醚提取，抑制率达改用沸点较低的乙醚提取，抑制率达100%温度！温度！第十一页，本课件共有100页12(二二)待测药物的体内存在状态待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结
9、合的强弱及结合率的高低与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低决定分离萃取方法决定分离萃取方法 指标：提取回收率指标：提取回收率蛋蛋白白结结合合较较强强（非非极极性性强强）不不宜宜直直接接采采用用溶溶剂剂萃萃取取？有机溶剂没选对？吲哒帕胺、伪麻黄碱！？有机溶剂没选对？吲哒帕胺、伪麻黄碱！体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物决定分析检测技术决定分析检测技术浓度较低浓度较低（尤其有（尤其有代谢产物代谢产物共存）共存）代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定采用采用HPLC或或LC-MS等分析检测技术等分析检测技术 第十二页，本课件共有1
10、00页13二、分析测定的目的与要求二、分析测定的目的与要求 体内药物分析的目的体内药物分析的目的影响分析方法的应用影响分析方法的应用药药代代动动力力学学研研究究药药物物在在体体内内吸吸收收、分分布布、代代谢谢和和排排泄泄过过程程血血浆浆浓浓度度随随时时间间的的变变化化过过程程；代代谢谢途途径径及及代代谢谢产物产物要求要求同时测定原形药物和代谢产物同时测定原形药物和代谢产物 检检测测宽宽线线性性范范围围(CmaxCmax的的1/20，4-5半半衰衰期期)、高高灵灵敏敏度度(10-9g/ml)和和高高专专属属性性(分分离离能能力力)(原原形形药药物物及及其其代代谢产物的分离谢产物的分离)方方法法不
11、不必必强强调调方方法法的的简简便便、快快速速，按按SOP，大大多多采采用用色色谱及其脱线或在线联用技术，如谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS建立分析检测方法的主要依据有：建立分析检测方法的主要依据有：第十三页，本课件共有100页14二、分析测定的目的与要求二、分析测定的目的与要求 临床治疗药物监测临床治疗药物监测 药物浓度通常在有效治疗浓度范围附近药物浓度通常在有效治疗浓度范围附近方方法法尽尽量量简简便便、易易行行；适适用用于于长长期期、批批量量样样品品的的测测定，大多采用定，大多采用UV、RIA或或EIA等。？等。？中毒患者的临床抢救中毒患者的临床抢救 药物浓度极高药物浓度极高
12、方方法法不不必必强强调调方方法法的的灵灵敏敏度度，强强调调方方法法的的特特特特异异异异性性性性和和分分分分析析析析速度速度速度速度大大多多采采用用色色谱谱及及其其联联用用技技术术GC、GC-MS、RIA或或EIA？第十四页，本课件共有100页15三、生物样品的类型与预处理方法三、生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法决定分析方法的应用决定分析方法的应用以血浆或血清为分析样品以血浆或血清为分析样品采用采用蛋白沉淀、溶剂萃取蛋白沉淀、溶剂萃取预处理技术预处理技术分析样品较为分析样品较为“干净干净”，可用，可用HPLC检测检测用用RIA分析分析？FPIA法法样
13、品的预处理方法可较为样品的预处理方法可较为粗放粗放经经过过简简单单的的蛋蛋白白沉沉淀淀或或不不经经任任何何预预处处理理直直接接测测定定第十五页，本课件共有100页16四、实验室条件四、实验室条件 在在设设计计体体内内药药物物分分析析方方法法时时，还还应应充充分分考考虑虑到到实实验验室室现现有有的的或或有有可可能能在在其其它它实实验验室室使使用用的的仪仪器器装装备，合理选择可行的分析方法。备，合理选择可行的分析方法。此此外外，还还应应从从方方法法的的可可行行性性、每每个个样样品品测测定定耗耗时时多多少少（10 10 minmin）、操操作作的的难难易易及及技技术术要要求求及及仪仪器器、设设备备要
14、求、费用多少等等方面加以考虑。要求、费用多少等等方面加以考虑。第十六页，本课件共有100页17 在阿齐霉素制剂生物等效性研究过程中，血样中阿在阿齐霉素制剂生物等效性研究过程中，血样中阿齐霉素的浓度范围为齐霉素的浓度范围为5 ng/ml5 ng/ml1g/ml1g/ml ，其检测方，其检测方法可采用法可采用HPLC HPLC 法、法、LC-MS LC-MS 法和微生物法法和微生物法等数种方法。等数种方法。若用若用HPLC HPLC 法来检测该样品，由于阿齐霉素的法来检测该样品，由于阿齐霉素的紫外吸紫外吸收较弱收较弱，必须对样品进行富集浓缩，则样品的前处，必须对样品进行富集浓缩，则样品的前处理方法
15、采用液理方法采用液-液萃取法为佳；若用液萃取法为佳；若用LC-MS LC-MS 法来检测法来检测该样品，则由于该样品，则由于LC-MS LC-MS 仪器的灵敏度足以检测浓度为仪器的灵敏度足以检测浓度为1ng/ml 1ng/ml 以上的样品以上的样品，故样品的前处理只需采用蛋白，故样品的前处理只需采用蛋白沉淀法即可；若用微生物法来检测该样品，则样品沉淀法即可；若用微生物法来检测该样品，则样品连蛋白也不需沉淀，直接上样即可。连蛋白也不需沉淀，直接上样即可。例子例子 1 1第十七页，本课件共有100页18 当然，用当然，用LC-MS LC-MS 法来检测阿齐霉素时，法来检测阿齐霉素时，有些分析上作者
16、采用了液有些分析上作者采用了液-液萃取法，也有另液萃取法，也有另一些分析工作者采用了固相萃取法来处理血一些分析工作者采用了固相萃取法来处理血样，这些做法虽然行得通，但显然它们不但样，这些做法虽然行得通，但显然它们不但增加了样品处理的所需时间和工作量，而且增加了样品处理的所需时间和工作量，而且增加了样品处理的成本，因此阿齐霉素的血增加了样品处理的成本，因此阿齐霉素的血样处理最好采用蛋白沉淀法。样处理最好采用蛋白沉淀法。第十八页，本课件共有100页19 蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉蛋白沉淀法中，高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但从样淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但从样品
17、的稳定性角度考虑，阿齐霉素遇酸不稳定，品的稳定性角度考虑，阿齐霉素遇酸不稳定，故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法，考虑故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法，考虑到乙腈沉淀蛋白效果优于甲醇，且该方法阿到乙腈沉淀蛋白效果优于甲醇，且该方法阿齐霉素的回收率较高，故阿齐霉素血浆样品齐霉素的回收率较高，故阿齐霉素血浆样品的前处理方法以乙腈沉淀蛋白法为最佳。的前处理方法以乙腈沉淀蛋白法为最佳。第十九页，本课件共有100页20 如果测定的是血清中头孢拉定的浓度，如果测定的是血清中头孢拉定的浓度，头孢拉定为头孢拉定为-内酰胺类抗生素，对酸稳内酰胺类抗生素，对酸稳定，且酸有利于头孢拉定的提取。蛋白定，且酸有利于头孢拉
18、定的提取。蛋白沉淀法的选择就要采用高氯酸沉淀法了。沉淀法的选择就要采用高氯酸沉淀法了。-具体问题具体分析具体问题具体分析 -信息，查文献信息，查文献例子例子 2 2第二十页，本课件共有100页21第二节第二节 分析方法分析方法建立的一般步骤建立的一般步骤 一、分析方法的选择一、分析方法的选择二、分析方法的建立二、分析方法的建立(一一)检测条件的筛选检测条件的筛选(二二)分离条件的筛选分离条件的筛选第二十一页，本课件共有100页22一、分析方法的选择一、分析方法的选择体内药物分析方法的设计受多种因素影响体内药物分析方法的设计受多种因素影响生生物物样样品品中中的的药药物物浓浓度度决决定定分分析析方
19、方法法的的首首要要要要因素因素生生物物样样品品中中药药物物或或其其特特定定代代谢谢产产物物的的浓浓度度低低、样品量少样品量少难以通过难以通过增加取样量增加取样量提高方法灵敏度提高方法灵敏度通过通过选择适当的分析方法选择适当的分析方法适应样品分析需求。适应样品分析需求。常用分析方法的检测限度及分离能力见常用分析方法的检测限度及分离能力见表表4-14-1第二十二页，本课件共有100页23摘自:化学药物临床药代动力学研究技术指导原则 二五年三月 SFDA颁布（一）常用分析方法（1）色谱法：气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱质谱联用法（LCMS、LC-MS-MS，GC-MS，GC-M
20、S-MS）等，可用于大多数药物的检测；（2）免疫学方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质检测；（3）微生物学方法，可用于抗生素药物的测定。从目前发展看，生物样品的分析一般首选色谱法，如HPLC、GC法或LCMS、GCMS法，这类方法灵敏度、特异性、准确性一般都能适应临床药代动力学研究的需要，多数实验室也具备条件，因此应用最广，大约90%的药物浓度测定可以用色谱法来完成。具体选用何种分析方法应根据药物的化学结构、理化性质、仪器条件以及借鉴文献方法多方面因素来考虑确定。第二十三页，本课件共有100页24二、分析方法的建立二、分析方法的建立初步拟定分析方法后初步
21、拟定分析方法后初步拟定分析方法后初步拟定分析方法后进行一系列试验工作，以进行一系列试验工作，以进行一系列试验工作，以进行一系列试验工作，以选择最佳分析条件选择最佳分析条件选择最佳分析条件选择最佳分析条件同同同同时时时时验验验验证证证证分分分分析析析析方方方方法法法法的的的的可可可可行行行行性性性性，以以以以确确确确认认认认是是是是否否否否适适适适用用用用于于于于实实实实际生物样品际生物样品际生物样品际生物样品FF分析方法的建立步骤分析方法的建立步骤分析方法的建立步骤分析方法的建立步骤第一步：第一步：第一步：第一步：检测条件的筛选检测条件的筛选检测条件的筛选检测条件的筛选第二步：第二步：第二步：
22、第二步：分离条件的筛选分离条件的筛选分离条件的筛选分离条件的筛选第二十四页，本课件共有100页25(一一)检测条件的筛选检测条件的筛选 标标准准物物质质 照照照照拟拟拟拟定定定定的的的的分分分分析析析析方方方方法法法法(不不不不包包包包括括括括生生生生物物物物基基基基质质质质的预处理的预处理的预处理的预处理)测定测定 确定最佳分析检测条件确定最佳分析检测条件(如色谱条件如色谱条件如色谱条件如色谱条件)和检测灵敏度和检测灵敏度HPLC 调调整整检检测测器器(类类类类型型型型、条条条条件件件件)、色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱(型型型型号号号号、牌牌牌牌号号号号、填填填填料料料料性性性性状状状状与与与与
23、粒粒粒粒经经经经、柱柱柱柱长长长长度度度度)、流流流流动动动动相相相相(组组分分及及其其配配比比)及及及及其其其其流流流流速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等 使各物质具有足够的方法灵敏度使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ LOQ LOQ LOQ)良好的色谱参数良好的色谱参数(n n n n、R R、T T)适当的保留时间适当的保留时间(t tR R R R)第二十五页，本课件共有100页26(二二)分离条件的筛选分离条件的筛选在在在在进进进进行行行行分
24、分分分离离离离条条条条件件件件筛筛筛筛选选选选时时时时，应应应应考考考考察察察察生生生生物物物物基基基基质质质质中中中中的的的的内内内内源源源源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：1 1空白溶剂试验空白溶剂试验空白溶剂试验空白溶剂试验 溶剂溶剂(方法特异性方法特异性方法特异性方法特异性)2 2空白生物基质试验空白生物基质试验空白生物基质试验空白生物基质试验 (方法特异性方法特异性方法特异性方法特异性)3 3模拟生物样品试验模拟生物样品试验模拟生物样品试验
25、模拟生物样品试验 方法效能指标方法效能指标方法效能指标方法效能指标4 4 4 4实际生物样品测试实际生物样品测试 代谢产物代谢产物(方法特异性方法特异性)第二十六页，本课件共有100页271空白溶剂试验空白溶剂试验待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液）采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理样品预处理样品预处理样品预处理（反应试
26、剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）测定响应信号（如测定响应信号（如测定响应信号（如测定响应信号（如HPLCHPLCHPLCHPLC峰面积或峰高）峰面积或峰高）峰面积或峰高）峰面积或峰高）考察目标考察目标考察目标考察目标方法的特异性方法的特异性方法的特异性方法的特异性空白值应尽可能小，并能有效校正空白值应尽可能小，并能有效校正空白值应尽可能小，并能有效校正空白值应尽可能小，并能有效校正第二十七页，本课件共有100页28对色谱分析法而言对色谱分析法而言可可可可通通通通过过过过改改改改变变变变反反反
27、反应应应应条条条条件件件件、萃萃萃萃取取取取方方方方法法法法或或或或萃萃萃萃取取取取条条条条件件件件（萃萃萃萃取取取取溶溶溶溶剂剂剂剂的的的的极极极极性性性性、混混混混合合合合溶溶溶溶剂剂剂剂的的的的配配配配比比比比，固固固固相相相相萃萃萃萃取取取取填填填填料料料料性性性性质质质质、冲冲冲冲洗洗洗洗剂剂剂剂与与与与洗洗洗洗脱剂及其用量等），甚至脱剂及其用量等），甚至脱剂及其用量等），甚至脱剂及其用量等），甚至检测器类型检测器类型检测器类型检测器类型空白试剂信号应空白试剂信号应空白试剂信号应空白试剂信号应不干扰药物的测定不干扰药物的测定不干扰药物的测定不干扰药物的测定（如（如（如（如R R R
28、R1.51.51.51.5）本步骤主要考察本步骤主要考察本步骤主要考察本步骤主要考察需需需需经经经经化化化化学学学学反反反反应应应应的的的的预预预预处处处处理理理理过过过过程程程程，若若若若预预预预处处处处理理理理过过过过程程程程仅仅仅仅为为为为生生生生物物物物样样样样品品品品的的的的提提提提取取取取分分分分离离离离，则则则则可可可可不不不不进进进进行行行行该该该该步步步步骤骤骤骤，直直直直接接接接进进进进行行行行空空空空白白白白生生生生物物物物基基基基质质质质试验试验试验试验 第二十八页，本课件共有100页292.空白生物基质试验空白生物基质试验空白生物基质空白生物基质 (blank bio
29、logical matrixblank biological matrix)如空白血浆如空白血浆如空白血浆如空白血浆按按按按“空白溶剂试验空白溶剂试验空白溶剂试验空白溶剂试验”项下方法操作项下方法操作项下方法操作项下方法操作考察目标考察目标生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）在在在在待待待待测测测测药药药药物物物物(或或特特定定的的活活性性代代谢谢物物、内内标标物物质质等等)的的“信号窗信号窗信号窗信号窗”内不应出现内源性物质信号内不应出现内源性物
30、质信号内不应出现内源性物质信号内不应出现内源性物质信号第二十九页，本课件共有100页30celecoxib塞来考昔第三十页，本课件共有100页313.模拟生物样品试验模拟生物样品试验 模模模模拟拟拟拟生生生生物物物物样样样样品品品品空空空空白白白白生生生生物物物物基基基基质质质质中中中中加加加加入入入入待待待待测测测测药药药药物物物物，照照照照 “空空空空白白白白溶溶溶溶剂试验剂试验剂试验剂试验”项下方法操作项下方法操作项下方法操作项下方法操作考察目标：考察目标：考察目标：考察目标：方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度、方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度、方法的线性范围、精密度与准确度、
31、灵敏度、方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度、药物的萃取回收率等各项技术指标药物的萃取回收率等各项技术指标药物的萃取回收率等各项技术指标药物的萃取回收率等各项技术指标 同同同同时时时时进进进进一一一一步步步步检检检检验验验验生生生生物物物物基基基基质质质质中中中中内内内内源源源源性性性性物物物物质质质质以以以以及及及及可可可可能能能能共共共共同同同同使使使使用用用用的的的的其其其其他他他他药物对测定的干扰程度，即方法特异性药物对测定的干扰程度，即方法特异性药物对测定的干扰程度，即方法特异性药物对测定的干扰程度，即方法特异性第三十一页，本课件共有100页32对色谱分析法而言对色谱分析法而言进进
32、进进一一一一步步步步考考考考察察察察待待待待测测测测药药药药物物物物、内内内内标标标标物物物物与与与与内内内内源源源源性性性性物物物物质质质质(或或其其它药物它药物)的分离情况的分离情况如色谱峰的如色谱峰的 t tR R R R、n n n n 和和 T T 是否与水溶液的一致是否与水溶液的一致是否与水溶液的一致是否与水溶液的一致 色谱峰是否为单一成分色谱峰是否为单一成分色谱峰是否为单一成分色谱峰是否为单一成分（如何确定？）（如何确定？）标准曲线的截距是否显著偏离零点等标准曲线的截距是否显著偏离零点等均均可可说说明明内内源源性性物物质质是是否否对对待待测测药药物物或或内内标标物物质质构成干扰构
33、成干扰第三十二页，本课件共有100页334.实际生物样品的测试实际生物样品的测试 空空白白生生物物基基质质和和模模拟拟生生物物样样品品试试验验确确定定的的分分析析方法及其条件方法及其条件不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定药药药药物物物物在在在在体体体体内内内内可可可可能能能能与与与与内内内内源源源源性性性性物物物物质质质质结结结结合合合合(如如血血浆浆蛋蛋白白结结合合物物)或或代代代代谢谢谢谢生生生生成成成成数数数数个个个个代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物及及及及其其其其进进进进一一一一步步步步的的的的结结结结合合合合物物物物(或或缀合物缀合物)实
34、实际际生生物物样样品品确确立立分分析析方方法法后后，尚尚需需进进行行实实际际生生物物样品的测试样品的测试考考考考察察察察目目目目标标标标：代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物对对对对药药药药物物物物、内内内内标标标标物物物物质质质质的的干干扰扰情情况况进一步验证方法的可行性进一步验证方法的可行性？第三十三页，本课件共有100页34空白血浆空白血浆+标准标准溶液志愿者实际样品空白溶剂试验 多余？第三十四页，本课件共有100页35第三节第三节 分析方法分析方法验证的内容与要求验证的内容与要求 基于以下原因需要对建立的分析方法学进行基于以下原因需要对建立的分析方法学进行验证：验证：1 1、生物样品量少、
35、生物样品量少2 2、药物或活性代谢产物浓度低、药物或活性代谢产物浓度低3 3、内源性物质的干扰、内源性物质的干扰4 4、生物的个体差异较大、生物的个体差异较大第三十五页，本课件共有100页36（二）方法学确证（二）方法学确证建立可靠的和可重复的定量分析方法是进行临床药代动建立可靠的和可重复的定量分析方法是进行临床药代动力学研究的关键之一。为了保证分析方法可靠，必须对力学研究的关键之一。为了保证分析方法可靠，必须对方法进行充分方法进行充分确证确证，一般应进行以下几方面的考察：，一般应进行以下几方面的考察：1、特异性、特异性(Specificity)2、标准曲线和定量范围（、标准曲线和定量范围（C
36、alibration Curve）3、定量下限（、定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ）4、精密度与准确度（、精密度与准确度（Precision and Accuracy）5、样品稳定性、样品稳定性(Stability)6、提取回收率、提取回收率7、微生物学和免疫学方法确证、微生物学和免疫学方法确证8、方法学质控、方法学质控摘自摘自:化学药物临床药代动力学研究技术指导原则化学药物临床药代动力学研究技术指导原则 第三十六页，本课件共有100页37 用于实际生物样品分析之前：用于实际生物样品分析之前：用于实际生物样品分析之前：用于实际生物样品分析之前：需需要要
37、验验验验证证证证 (validationvalidation)分分析析方方法法的的可可可可行行行行性性性性与与可可可可靠靠靠靠性性性性方法验证时应考虑影响分析方法的所有可变因素：方法验证时应考虑影响分析方法的所有可变因素：取样、样品制备、色谱分离、检测与数据评价取样、样品制备、色谱分离、检测与数据评价 使用的样品使用的样品通通常常采采用用模模拟拟生生物物样样品品和和用用药药后后的的实实际际生生物物样样 验证的技术指标验证的技术指标验证的技术指标验证的技术指标效能指标效能指标效能指标效能指标 第三十七页，本课件共有100页38验证步骤验证步骤首先为分析方法的验证首先为分析方法的验证首先为分析方法
38、的验证首先为分析方法的验证特特特特异异异异性性性性、精精精精密密密密度度度度与与与与准准准准确确确确度度度度、回回回回收收收收率率率率、定定定定量量量量限限限限与与与与检测限、稳定性等检测限、稳定性等检测限、稳定性等检测限、稳定性等其次为生物基质中待测药物稳定性的验证其次为生物基质中待测药物稳定性的验证其次为生物基质中待测药物稳定性的验证其次为生物基质中待测药物稳定性的验证室温放置、冷冻（或冷藏）、冻室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环融循环融循环融循环 Freeze-and-thaw cycle第三十八页，本课件共有100页39验证的效能指标与基本要求验证的效能指标与基本要求1特异性（专属性
39、）特异性（专属性）避免干扰避免干扰2标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围覆盖所有浓度范围3准确度准确度与实际状况相符与实际状况相符4精密度精密度结果可重现结果可重现5定量限定量限达到峰浓度的达到峰浓度的1/101/206稳定性稳定性确保所有样品准确测定确保所有样品准确测定7提取回收率提取回收率确保检测的灵敏度确保检测的灵敏度第三十九页，本课件共有100页40一、方法特异性一、方法特异性(专属性或选择性专属性或选择性)方法的特异性方法的特异性方法的特异性方法的特异性(specificityspecificity)又称专属性或专一性，通常与选择性又称专属性或专一性，通常与选择性又称
40、专属性或专一性，通常与选择性又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivityselectivity)互用互用互用互用系系系系指指指指当当当当有有有有内内内内源源源源性性性性物物物物质质质质存存存存在在在在时时时时，方方方方法法法法准准准准确确确确测测测测定定定定待待待待测测测测物物物物质质质质的的的的能能能能力力力力，通常表示所检测的通常表示所检测的通常表示所检测的通常表示所检测的信号信号信号信号(响应响应响应响应)系属于系属于系属于系属于待测药物所特有待测药物所特有待测药物所特有待测药物所特有选选选选择择择择性性性性包包包包括括括括将将将将待待待待测测测测物物物物质质质质与与与与其其
41、其其代代代代谢谢谢谢物物物物及及及及同同同同服服服服的的的的其其其其它它它它药药药药物物物物加加加加以以以以区分区分区分区分(分离分离分离分离)的能力的能力的能力的能力特异性特异性特异性特异性函盖二者，以函盖二者，以函盖二者，以函盖二者，以验证验证验证验证所测定的物质与待测药物的所测定的物质与待测药物的所测定的物质与待测药物的所测定的物质与待测药物的同一性同一性同一性同一性 特特特特异异异异性性性性用用用用于于于于考考考考察察察察方方方方法法法法的的的的抗抗抗抗干干干干扰扰扰扰程程程程度度度度。如如如如果果果果特特特特异异异异性性性性不不不不佳佳佳佳，方方方方法法法法的的的的准准准准确确确确度
42、度度度、精精精精密密密密度度度度、线线线线性性性性都都都都将将将将受受受受到到到到影影影影响响响响。因因因因此此此此确确确确保保保保特特特特异异异异性性性性是是是是建建建建立立立立和和和和验验验验证一个分析方法的第一步。证一个分析方法的第一步。证一个分析方法的第一步。证一个分析方法的第一步。第四十页，本课件共有100页411.1.内源性物质的干扰内源性物质的干扰比比比比较较较较待待测测药药物物或或其其活活性性代代谢谢产产物物的的对对照照品品 （或或标准品）标准品）空白生物基质空白生物基质 模模模模拟拟拟拟生生生生物物物物样样样样品品品品（空空空空白白白白生生生生物物物物基基基基质质质质中中中中
43、添添添添加加加加对对对对照照照照品品品品）的检测信号的检测信号的检测信号的检测信号如如如如HPLCHPLC色色色色谱谱谱谱峰峰峰峰的的的的 t tR R、n n n n 和和和和拖拖拖拖尾尾尾尾因因因因子子子子（T T T T）是是否否一一致致，以及与内源性物质色谱峰的分离度（以及与内源性物质色谱峰的分离度（R R）确证确证确证确证内源性物质对分析方法有无干扰内源性物质对分析方法有无干扰内源性物质对分析方法有无干扰内源性物质对分析方法有无干扰考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点考察
44、一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：第四十一页，本课件共有100页422.2.代谢产物的干扰代谢产物的干扰 比比比比较较较较模模模模拟拟拟拟生生生生物物物物样样样样品品品品和和和和用用用用药药药药后后后后的的的的实实实实际际际际生生生生物物物物样样样样品品品品的的的的检检检检测测测测信号信号信号信号如如如如HPLCHPLCHPLCHPLC中中中中药药药药物物物物色色色色谱谱谱谱峰峰峰峰的的的的 t tR R R R、n n n n 和和和和 T T T T 是是是是否否否否一一一一致致致致，或或或或改改改改变变变变色色色色谱谱谱谱条条条条件件件件(色色谱谱柱柱)再再比比较较，以以以
45、以及及及及与与与与代代代代谢谢谢谢产物的产物的产物的产物的R R R R，来确证代谢产物对分析方法有无干扰。来确证代谢产物对分析方法有无干扰。来确证代谢产物对分析方法有无干扰。来确证代谢产物对分析方法有无干扰。结构已知的特定活性代谢物的测定结构已知的特定活性代谢物的测定通过通过HPLC-DADHPLC-DAD和和LC-MSLC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性确证色谱峰的单纯性和同一性确证色谱峰的单纯性和同一性确证色谱峰的单纯性和同一性对于结构未知的代谢产物的测定对于结构未知的代谢产物的测定对于结构未知的代谢产物的测定对于结构未知的代谢产物的测定采采用用LC-LC-NMRLC-LC-NMRLC-
46、LC-NMRLC-LC-NMR进进行行结结构构的的初初步步推推测测后后，考考察察其其干干扰扰情情况。况。第四十二页，本课件共有100页43 对于色谱法对于色谱法至少要考察至少要考察6个不同个体的个不同个体的空空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图，以反映分析方法的特异性。对于品色谱图，以反映分析方法的特异性。对于以软电离质谱为基础的检测法（以软电离质谱为基础的检测法（LC-MS、LC-MS-MS）应注意考察分析过程中的介质）应注意考察分析过程中的介质效应，如离子抑制等。效
47、应，如离子抑制等。摘自摘自:化学药物临床药代动力学研究技术指导原则化学药物临床药代动力学研究技术指导原则 第四十三页，本课件共有100页443.3.伍用药物的干扰伍用药物的干扰TDMTDMTDMTDM时时 还要考虑患者可能同时服用药物的干扰还要考虑患者可能同时服用药物的干扰 通通通通过过过过比比比比较较较较待待待待测测测测药药药药物物物物及及及及可可可可能能能能同同同同时时时时服服服服用用用用药药药药物物物物的的的的模模模模拟拟拟拟生生生生物样品的检测信号物样品的检测信号物样品的检测信号物样品的检测信号如如HPLCHPLC色谱峰的色谱峰的 t t t tR R R R、n n n n 和和和和
48、 T T 是否一致是否一致来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况第四十四页，本课件共有100页454.4.与参比方法的相关性与参比方法的相关性 除上述方法外，有时还可使用参比方法对照法。除上述方法外，有时还可使用参比方法对照法。参参比比方方法法一一般般选选用用特特异异性性强强、准准确确度度高高、线线性性关关系系良良好好的的色色谱谱法法。如如在在TDMTDM中中使使用用UV(UV(UV(UV(或或RIA)RIA)时时,可可可可以以以以HPLC(HPLC(或或GC)GC)为参比为参比
49、参参比比方方法法测测定定结结果果为为横横坐坐标标(X X X X););););拟拟拟拟定定定定方方方方法法法法结结结结果果果果为为为为纵纵纵纵坐标坐标坐标坐标(Y Y)用用最最小小二二乘乘法法计计算算回回归归方方程程 Y Ya a a ab bX X (坐坐坐坐标标标标标标标标度度度度相相相相等等等等)、相相关关系系数数(r r r r)表表表表示示示示两两两两种种种种方方方方法法法法测测测测得得得得结结结结果果果果的的的的一一一一致致致致性性性性，若若若若 r r r r 11，表表表表示示示示拟拟拟拟定定定定方方方方法法法法为为为为非非非非线线线线性性性性，如如如如 RIA RIA RI
50、A RIA 中中抗抗血血清清滴滴度度选择不当选择不当第四十五页，本课件共有100页464.4.与参比方法的相关性与参比方法的相关性Y Ya a a ab bX X X X 截截距距(a)(a)(a)(a)表表示示拟拟定定方方法法受受到到恒恒定定干干扰扰的的程程度度内内源性物质源性物质(UV)(UV)斜斜率率(b)(b)(b)(b)表表示示拟拟定定方方法法受受到到比比例例干干扰扰的的程程度度标标标标记抗原不纯记抗原不纯记抗原不纯记抗原不纯(RIA)(RIA)(RIA)(RIA)与与参参比比方方法法的的相相关关性性比比较较，除除显显示示分分析析方方法法的的特特异性外，还反映分析方法的准确度。异性外