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1、关于植物细胞培养及次生产物代谢生产第一页，本课件共有81页一、悬浮培养一、悬浮培养二、单细胞培养二、单细胞培养三、植物细胞的规模化培养及有三、植物细胞的规模化培养及有用物质生产用物质生产第二页，本课件共有81页一、悬浮培养一、悬浮培养（cell suspension culture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。术。第三页，本课件共有81页1、愈伤组织诱导、愈伤组织诱导要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观
2、一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。适于悬浮培养适于悬浮培养适于再生植株适于再生植株第四页，本课件共有81页如何获得符合要求的愈伤组织？如何获得符合要求的愈伤组织？1、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶、选择适宜的外植体：胚、胚轴、子叶是最常用的外植体，特别是幼胚。是最常用的外植体，特别是幼胚。2、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要、选择适宜的培养基：生长素浓度很重要配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。配合一定浓度的细胞分裂素；添加附加物。3、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性、愈伤组织要进行继代选择：选择疏松性好、细胞状态好的细胞
3、不断继代培养。好、细胞状态好的细胞不断继代培养。第五页，本课件共有81页悬浮系建立过程：悬浮系建立过程：影响悬浮细胞生长的因素：影响悬浮细胞生长的因素：1、起始愈伤组织的质量起始愈伤组织的质量2、接种细胞密度接种细胞密度3 3、培养条件：方式、温度、培养条件：方式、温度、4、继代周期继代周期2、悬浮系的建立与继代培养、悬浮系的建立与继代培养愈伤组织愈伤组织1g愈伤愈伤/10ml培养基培养基150、250ml三角瓶三角瓶（30、70ml培养基）培养基）120rpm,25黑暗培养黑暗培养,换液换液1次次/3d以防粘稠以防粘稠蔗糖梯度离心或过滤法蔗糖梯度离心或过滤法(淘汰过大或生理状态不好的细胞团淘
4、汰过大或生理状态不好的细胞团)继代培养继代培养80rpm（悬浮细胞系稳定以后）（悬浮细胞系稳定以后）继代时间为继代时间为1周时（周时（原悬浮液：新培养基原悬浮液：新培养基=1：4）每次继代都要进行选择，筛选生活力好的细胞继代每次继代都要进行选择，筛选生活力好的细胞继代第六页，本课件共有81页成功的悬浮细胞培养体系必须满足成功的悬浮细胞培养体系必须满足3 3个条件：个条件：1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一般在般在3050个细胞以下，在实际培养中个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。2、
5、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。黄色。3、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加天甚至更短时间便可增加1倍。倍。第七页，本课件共有81页3 3、悬浮细胞生长动态：、悬浮细胞生长动态：基本的悬浮培养体系均基本的悬浮培养体系均是将细胞分散在一定容是将细胞分散在一定容积的培养液中进行，在积的培养液中进行，在一个培养周期不添加培一个培养周期不添加培养基
6、。这种培养体系基养基。这种培养体系基本是处于封闭状态。当本是处于封闭状态。当一种营养物质耗尽时，一种营养物质耗尽时，细胞及停止生长。在这细胞及停止生长。在这种悬浮培养体系中，细种悬浮培养体系中，细胞扩增生长成胞扩增生长成S形曲线。形曲线。第八页，本课件共有81页培养周期的概念培养周期的概念具有一定起始培养密度的单细胞，从开具有一定起始培养密度的单细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止这一过始培养到细胞数目和总重量增长停止这一过程，称为一个培养周期。程，称为一个培养周期。第九页，本课件共有81页接种初期的细胞密度过低会使延迟期加接种初期的细胞密度过低会使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在长
7、，悬浮细胞的起始密度一般在（0.52.5）*105个范围内调整。个范围内调整。一般继代培养可降低密度；若在短时间一般继代培养可降低密度；若在短时间内获得大量细胞可提高接种密度。内获得大量细胞可提高接种密度。在实际应用中，还需要确定一些参数：在实际应用中，还需要确定一些参数：最低起始密度、最大生长速率、每个培养最低起始密度、最大生长速率、每个培养周期所经历的天数等。周期所经历的天数等。第十页，本课件共有81页4、悬浮细胞培养的同步化、悬浮细胞培养的同步化细胞同步化：细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。时通过细胞周期的某一特定时期。
8、植物细胞在悬浮培养植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。当困难。分选法：分选法：通过细胞体积大小分级，直接将通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。态的细胞继代培养于同一培养体系中。饥饿法：饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。
9、从而停留在某一分裂时期。第十一页，本课件共有81页抑制剂法：抑制剂法：通过一些通过一些DNA合成抑制剂处理合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期制后，即可获得处于同一细胞周期G1期的期的同步化细胞。同步化细胞。低温法：低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞冷处理也可提高培养体系中细胞同步化程度。同步化程度。第十二页，本课件共有81页二、二、单细胞培养单细胞培养1、平板培养、平板培养2、看护培养、看护培养3、微室培养、微室培养4、双层滤纸培养、双层滤纸培养第十三页，本课件共有81页悬浮培养不能对某一细胞进行定点观悬
10、浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析，也就不能进行定点选择。因此，察和分析，也就不能进行定点选择。因此，在进行细胞株（种子细胞）选择和需要对在进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上的单细胞培养。由于植物细胞的正意义上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性，单细胞培养还比较困难。团聚性，单细胞培养还比较困难。第十四页，本课件共有81页1、细胞平板培养、细胞平板培养平板培养平板培养(plateculture)：将一定密度的悬浮将一定密度的悬浮细胞细胞接种接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。到一薄层固体培养基中进行培养的技
11、术。单细胞的分离：单细胞的分离：用于平板培养的用于平板培养的小细胞团不能超小细胞团不能超过过6个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。单细胞悬浮液的制备：单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经低速离分离的单细胞经低速离心，培养液洗涤心，培养液洗涤2次后，调整密度为次后，调整密度为5105ml。植板：植板：将将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，厚度约培养皿中，厚度约12mm。封口：封口：用石蜡膜封培养皿。用石蜡膜封培养皿。第十五页
12、，本课件共有81页平板培养的效果一般用平板培养的效果一般用植板率植板率来衡量。来衡量。植板率：植板率：能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。植板率（）植板率（）每个平板形成的细胞团数每个平板形成的细胞团数每个平板接种的细胞总数每个平板接种的细胞总数平板培养中平板培养中细胞密度细胞密度和和培养基成分培养基成分是培养成功的关键，而细胞密度和培养是培养成功的关键，而细胞密度和培养基成分互相依赖（负相关）。基成分互相依赖（负相关）。镜检：镜检：用倒置显微镜观察将单细胞做标记，用倒置显微镜观察将单细胞做标记，已获得真正的单细胞系。已获得真正的单细胞系
13、。培养：培养：25黑暗培养。黑暗培养。第十六页，本课件共有81页2、看护培养、看护培养看护培养（看护培养（nurseculture）：）：是由是由Muir1954年设计的。年设计的。操作方法：操作方法：在固体培养基上置入一块在固体培养基上置入一块活跃生长的愈组织，再在愈活跃生长的愈组织，再在愈伤组织上放一小片滤纸，待伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。当培养细胞长出微小纸上。当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转至细胞团以后，将其直接转至琼脂培养基上让其琼脂培养基上让其迅速生长迅速生长第十七页，本课件共有81页3、微室培养、微室培养它可对单细胞进行活
14、体连续它可对单细胞进行活体连续观察。这一方法也可用于原观察。这一方法也可用于原生质体培养观察细胞壁的再生质体培养观察细胞壁的再生和细胞分裂过程。生和细胞分裂过程。第十八页，本课件共有81页4、双层滤纸培养、双层滤纸培养Horsch等（等（1980）将平板培养与饲养）将平板培养与饲养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植板层培养技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法。培养方法。第十九页，本课件共有81页三、三、植物细胞大规模培养及有用物质生产植物细胞大规模培养及有用物质生产（一）、概述（一）、概述（二）、植物细胞规模化培养体系的建立（二）、植物细胞规模化培养体系的建立（三）、利用细胞培养生产有用物质
15、（三）、利用细胞培养生产有用物质第二十页，本课件共有81页 植物次生代谢产物：植物次生代谢产物：植物中一大类并非植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。合成与分解过程称为次生代谢。（一）、概述（一）、概述第二十一页，本课件共有81页 植物产生代谢产物的类型植物产生代谢产物的类型 根据分子结构不同大致分为：根据分子结构不同大致分为：酚类化合物：酚类化合物：黄酮类；醌类（苯醌、
16、萘醌、蒽醌）黄酮类；醌类（苯醌、萘醌、蒽醌）萜类化合物：萜类化合物：三萜皂甙；甾体皂甙；单萜、倍半萜、二萜三萜皂甙；甾体皂甙；单萜、倍半萜、二萜 含氮化合物：含氮化合物：生物碱；胺类（伯、仲、叔、季胺）生物碱；胺类（伯、仲、叔、季胺）非蛋白氨基酸非蛋白氨基酸 生氰甙生氰甙 多炔类、有机酸多炔类、有机酸第二十二页，本课件共有81页 植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。等领域具有重要意义。李时珍在李时珍在本草纲目本草纲目中所开列的中所开列的18921892种药物种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约绝大多数是植物药物，目前仍有约2525的法
17、定药品的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。许多植来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害是理想的环保产品。菌，而对环境和人畜无害是理想的环保产品。第二十三页，本课件共有81页自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较生产方式生产方式生产周期生产周期紫草宁含量（干重）紫草宁含量（干重）完整植物完整植物23年年12植物细胞培养植物细胞培养3周周14第
18、二十四页，本课件共有81页植物次生代谢产品的市场潜能植物次生代谢产品的市场潜能产品成分用途年销售额（亿美元）产品成分用途年销售额（亿美元）长春花碱治疗白血病长春花碱治疗白血病1820（美国）（美国）奎宁治疗疟疾奎宁治疗疟疾510（美国）（美国）致热素杀虫剂致热素杀虫剂20（全世界）（全世界）毛地黄心脏病药毛地黄心脏病药2055（美国）（美国）第二十五页，本课件共有81页植物细胞大规模培养的技术要求：植物细胞大规模培养的技术要求：从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和次生代谢产物生产的生物反应器，建立最佳的控胞生长和次生代谢产物生
19、产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。制和调节系统。从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件：个条件：1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。的产物。2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。到较高产量的终产物。3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。其释放到培养基中。第二十六页，本课件共有81页（二）、植物细胞规模化培养体系的建立（二
20、）、植物细胞规模化培养体系的建立1、种子细胞的选择、种子细胞的选择（1）准确选择能产生目的化合物的植物种类；）准确选择能产生目的化合物的植物种类；（2）尽量选择自然状态下产生天然产物的组织器官）尽量选择自然状态下产生天然产物的组织器官为外植体；为外植体；(3)(3)高产种子细胞克隆的方法：单细胞培养后，将高产种子细胞克隆的方法：单细胞培养后，将单细胞扩增形成的愈伤组织分单细胞扩增形成的愈伤组织分2份，份，1份成分含份成分含量分析，另量分析，另1份保留培养。份保留培养。第二十七页，本课件共有81页2、种子细胞系的增殖与放大培养、种子细胞系的增殖与放大培养种子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积
21、从种子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从几百毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定几百毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定值后，应转移至体积较小的生物反应器培养。值后，应转移至体积较小的生物反应器培养。第二十八页，本课件共有81页3、大规模培养体系的建立、大规模培养体系的建立（1 1）成批培养：）成批培养：在一个培养体积中接种细胞在一个培养体积中接种细胞 或添加培养基后，中途不添加也不更换培或添加培养基后，中途不添加也不更换培 养基的方式。养基的方式。（2 2）连续培养：）连续培养：在培养过程中，不断向反应在培养过程中，不断向反应 器中以一定流量添加新培养基，同时以器中以一定流量添
22、加新培养基，同时以 一定流量从系统中取出培养基的方式。一定流量从系统中取出培养基的方式。(3)(3)半连续培养：半连续培养：在完成成批培养的一个周期在完成成批培养的一个周期 后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只 保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的 种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养 的方式。的方式。第二十九页，本课件共有81页(三三)生物反应器类型及特点生物反应器类型及特点 大规模培养系统基本原理方法与上述大规模培养系统基本原理方法与上述实验室悬浮培养一致，但大规模培养所采实验室悬浮
23、培养一致，但大规模培养所采用的设备及控制技术比实验室小规模培养用的设备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多。要复杂的多。第三十页，本课件共有81页植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的是生产天然产物，所以，植物细胞培养反应器的是生产天然产物，所以，植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有利于细胞生长，还要考虑有利设计不仅要考虑有利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累和分离。于产物的积累和分离。总体上，适合植物细胞培养的反应器应具有总体上，适合植物细胞培养的反应器应具有
24、适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。第三十一页，本课件共有81页机械搅拌式培养系统机械搅拌式培养系统机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由
25、于植物细胞的生理活动因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；所以必须设计通气装置；为便于取样观察，一般为便于取样观察，一般还设计有取样口。还设计有取样口。第三十二页，本课件共有81页生物反应器生物反应器第三十三页，本课件共有81页Stirred Tank BioreactorsAn external motor is used to agitate the growth medium with impellers.Sterile air or combinations of gas
26、es can be introduced(sparkling)第三十四页，本课件共有81页气压搅拌式培养系统气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。但其缺点是搅拌不均匀。第三十五页，本课件共有81页Bubble Column Bioreactor(Airlift Reactor)Introduction of sterile air or pu
27、re gases is used both for agitation and oxygenation第三十六页，本课件共有81页Internal Loop Airlift BioreactorTube placed inside the reactor creates internal circulation loop 第三十七页，本课件共有81页External Loop Airlift BioreactorCirculation through an external loop 第三十八页，本课件共有81页旋转式培养系统旋转式培养系统一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才一般用于产品中试或
28、某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。理灵活，缺点是培养体积较小。第三十九页，本课件共有81页固定化培养系统固定化培养系统这一技术的优点在于：这一技术的优点在于：可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；定的代谢途径，并便于调节；细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有
29、利于次生产物的合成；有利于次生产物的合成；由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；出的时间和费用；正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断
30、提取产物，因此，它可以进行连续生产。中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。第四十页，本课件共有81页细胞固定化培养技术按照其支持物不细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：同可以分为两大类：包埋式固定化培养系统：支持物多采包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；附着式固定化培养系统：支持物采用附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。第四十一页，本课件共有81页1、利用细胞培养生产有用物质的一般程序、利用细胞培养生产有用物质的一般程序（1）选材）选材应
31、注意以下条件：应注意以下条件：药效肯定；药效肯定；对其有效成分有充分的了解；对其有效成分有充分的了解；有测定有效成分和药理的可靠方法；有测定有效成分和药理的可靠方法；市场短缺或价格昂贵；市场短缺或价格昂贵；取有药效成分的部位，且该部位较取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织。易形成愈伤组织。（四）、（四）、利用利用细胞培养生产有用物质细胞培养生产有用物质第四十二页，本课件共有81页（2）细胞株系建立）细胞株系建立将诱导产生的愈伤组织进行分离，建立悬浮细将诱导产生的愈伤组织进行分离，建立悬浮细胞繁殖体系（液体培养）。胞繁殖体系（液体培养）。在工厂化生产中，为了提高有用物质产品的产在工厂化生
32、产中，为了提高有用物质产品的产量和质量，对细胞培养的选择有两个基本要求：量和质量，对细胞培养的选择有两个基本要求：有用物质的合成积累能力强有用物质的合成积累能力强生长速度快生长速度快第四十三页，本课件共有81页（3）大量培养）大量培养将选出的优良细胞株扩大繁殖后，可作为将选出的优良细胞株扩大繁殖后，可作为细胞工厂化培养的生产细胞工厂化培养的生产“种子种子”，进行大量培，进行大量培养。养。（4）产品提取与纯化）产品提取与纯化从从植植物物细细胞胞培培养养物物中中提提取取和和纯纯化化有的产品。有的产品。第四十四页，本课件共有81页2、提高有用物质生产效率的技术因素提高有用物质生产效率的技术因素筛选高
33、产细胞系筛选高产细胞系从实验材料中筛选高产的细胞株系是提高生从实验材料中筛选高产的细胞株系是提高生产率、降低生产成本的重要因素。特异的次生代产率、降低生产成本的重要因素。特异的次生代谢产物往往是特异的器官中形成的。因此，用特谢产物往往是特异的器官中形成的。因此，用特异器官为材料，建立特异功能的细胞系，并从中异器官为材料，建立特异功能的细胞系，并从中反复多代培养选择有效的、高产的细胞株。反复多代培养选择有效的、高产的细胞株。第四十五页，本课件共有81页筛筛选选出出的的高高效效、高高产产细细胞胞株株系系，有有的的植植物物细细胞胞系系其其高高效效、高高产产性性能能稳稳定定多多年年，但但有有的的植植物
34、物细细胞胞系系不不稳稳定定，因因此，还需要定期检测，更新细胞株系。此，还需要定期检测，更新细胞株系。第四十六页，本课件共有81页第一步：解决生物量生产（促进细胞裂）；第一步：解决生物量生产（促进细胞裂）；第二步：促进次生代谢物合成，即在细胞第二步：促进次生代谢物合成，即在细胞指数生长停止期前后才更换培养基，有利指数生长停止期前后才更换培养基，有利于次生物质的积累。于次生物质的积累。、二步培养法、二步培养法第四十七页，本课件共有81页、培养基中添加前体、培养基中添加前体前体：有用次生代谢物的前驱物。前体：有用次生代谢物的前驱物。烟草愈伤组织培养中，将前体物质烟草愈伤组织培养中，将前体物质烟碱酸加
35、入，会增加烟碱的生成量。烟碱酸加入，会增加烟碱的生成量。第四十八页，本课件共有81页、培养基中生长调节剂的作用、培养基中生长调节剂的作用植物生长调节剂不仅影响植物的脱分化与植物生长调节剂不仅影响植物的脱分化与再分化，而且能影响次生代谢物质的产生。如再分化，而且能影响次生代谢物质的产生。如烟草愈伤组织培养中，培养基中添加烟草愈伤组织培养中，培养基中添加IAA，能，能合成烟碱，而在含有合成烟碱，而在含有2,4-D的培养基上，烟的培养基上，烟碱合成受阻。碱合成受阻。第四十九页，本课件共有81页、培养条件的影响、培养条件的影响光照、温度等影响次生代谢。在胡萝光照、温度等影响次生代谢。在胡萝卜愈伤组织培
36、养中，光照条件使紫红色卜愈伤组织培养中，光照条件使紫红色愈伤组织能够生成大量的花箐苷，并且愈伤组织能够生成大量的花箐苷，并且低温条件下，生成量高。低温条件下，生成量高。第五十页，本课件共有81页、采用固相细胞培养系统、采用固相细胞培养系统细细胞胞生生长长分分裂裂旺旺盛盛时时，次次生生代代谢谢物物产产量量低低。采采用用固固相相培培养养，将将细细胞胞培培养养在在惰惰性性基基质质中中，细细胞胞生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量。生长缓慢，可提高次生代谢物质的产量。第五十一页，本课件共有81页思考题思考题1 1一个好的悬浮细胞系有哪些特征？一个好的悬浮细胞系有哪些特征？用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何
37、用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何 要求？要求？2 2建立悬浮细胞系的关键技术有哪些？建立悬浮细胞系的关键技术有哪些？3 3悬浮细胞系在继代培养中其群体生长悬浮细胞系在继代培养中其群体生长 规律？规律？4 4细胞大规模培养有哪些培养系统？细胞大规模培养有哪些培养系统？第五十二页，本课件共有81页第五十三页，本课件共有81页第五十四页，本课件共有81页紫杉醇：二萜类化合物最早由太平洋红豆杉Taxus brevifoliabrevifolia的树皮中分离广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几种癌症目前主要来源于红豆杉属植物紫杉醇简介第五十五页，本课件共有81页理化性质理化性质英文名：英文名：
38、Paclitaxel,Taxol or Paclitaxel,Taxol or TMTM分子式：分子式：C C4747H H5151NONO4 4水溶性：水溶性：0.7mg0.7mgmlml稳定性：稳定性：pH4pH488稳定；稳定；pH4pH8pH8易分解；易分解；在特定条件下紫杉醇可被氧化，在特定条件下紫杉醇可被氧化，但极难还原；但极难还原；第五十六页，本课件共有81页紫杉醇研发过程年年年年 代代代代进进进进 展展展展19581958 NCI NCI开始大规模植物药研发筛选开始大规模植物药研发筛选19671967 发现紫杉醇抗癌活性发现紫杉醇抗癌活性19681968 从红豆杉中分离出紫杉醇
39、从红豆杉中分离出紫杉醇19711971 完成结构鉴定完成结构鉴定19791979 发表作用机制发表作用机制19831983 临床临床试验试验19851985 临床临床IIII期期19911991 临床临床IIIIII期期19921992 FDAFDA批准上市批准上市NCI称其为过去15年中开发的最好的抗癌药物20世纪90年代抗肿瘤药的三大成就之一汤姆森科技桂冠奖Ramesh Panchagnula,International Journal of Pharmaceutics.1998(172)1-15.第五十七页，本课件共有81页市场需求市场需求抗癌一线用药抗癌一线用药抗癌一线用药抗癌一线用药
40、销售额销售额年增长率年增长率5 5亿美元亿美元 理论需求量理论需求量理论需求量理论需求量 2g/2g/人人,500,500万人万人/年年 1000kg/1000kg/年年实际销量实际销量实际销量实际销量350 kg/350 kg/年年紫杉醇供需相差十分悬殊紫杉醇供需相差十分悬殊紫杉醇供需相差十分悬殊紫杉醇供需相差十分悬殊 图图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）图图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）：国际紫杉醇销售额（亿美元）第五十八页，本课件共有81页紫杉醇开发的关键问题上游产业药源问题 下游制剂产业 药效（活性、水溶性）药效（活性、水溶性）安全
41、性生物相容性第五十九页，本课件共有81页药源问题红豆杉红豆杉红豆杉红豆杉 主要原料植物主要原料植物 国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种 之一之一生长缓慢生长缓慢生长缓慢生长缓慢 分布有限分布有限分布有限分布有限 TaxolTaxol含量低含量低含量低含量低 树皮中树皮中TaxolTaxol含量含量:0.00001-0.069%:0.00001-0.069%3000 3000棵树棵树=10=10吨树皮吨树皮=1kg Taxol=500=1kg Taxol=500病人病人第六十页，本课件共有81页人工栽培 采用种子繁殖、扦插等无性繁殖方法快速、采用种子繁殖
42、、扦插等无性繁殖方法快速、大面积人工繁育红豆杉幼苗大面积人工繁育红豆杉幼苗寻找红豆衫的替代物 从红豆杉非树皮部位提取从红豆杉非树皮部位提取 产紫杉醇的非红豆杉植物产紫杉醇的非红豆杉植物优点：生长周期缩短 简便、直接缺点：1、紫杉醇含量低 生长缓慢 2、提取工艺复杂药源问题解决办法（一）第六十一页，本课件共有81页药源问题解决办法（二）化学合成全合成全合成 19941994年获得成功年获得成功 现有六种途径现有六种途径半合成半合成 以以10-DAB10-DAB和和Baccatin Baccatin 作为半合成原料获得紫杉作为半合成原料获得紫杉醇醇 新方法用新方法用10-DAT 10-DAT 缺点
43、：1、合成过程烦琐复杂，几十步 2、费用高，化学试剂昂贵 3、总收率太低（2%）优点：1、原料枝叶含量丰富、提取相 对容易，充分利用再生资源 2、产率高 3、最具实用价值可以工业化生产 4、获取紫杉醇构效关系信息，进行结构改造缺点：合成过程相对复杂 （11步化学转化和7步分离）第六十二页，本课件共有81页药源问题解决办法（三）生物方法生物方法生物方法生物方法组织和细胞培养组织和细胞培养微生物发酵微生物发酵生物合成生物合成 研究阶段研究阶段 红豆杉生物合成途径基本明确红豆杉生物合成途径基本明确 1010种相关酶基因被克隆表达种相关酶基因被克隆表达 利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量利用基因
44、工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量 优点：1、摆脱自然因素，可长期稳定 生长 2、适应市场、方便调节 3、成分简单，有利于分离纯化 4、成本低、生长周期短 5、为半合成提供原料 6、有望工业化生产缺点：1、产量低、不稳定 2、工业化放大研究第六十三页，本课件共有81页紫杉醇水溶性很差0.770.77mMmM/L/L使用增溶剂：聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇 存在问题存在问题 稳定性和水溶性较差（稳定性和水溶性较差（7mm/L7mm/L）过敏反应过敏反应 产生沉淀产生沉淀缺点：1、产量低、不稳定 2、工业化放大研究药效问题第六十四页，本课件共有81页一、植物来源药物的特点一、植物来源药物的特点 全世界有
45、40%的药物来源于植物。我国是中草药资源最丰富的国家，有详细记载的近5000种。中草药治疗疾病的历史上千年，中医药已形成完整的科学体系。对于植物药效成分的研究已形成“天然药物化学”研究的新领域。药用植物中具有药物功能的物质种类繁多，结构复杂。除小分子的天然有机化合物以外，还有多种生物大分子活性物质。对不同组方的药用成分和功能的研究是一项巨大的工程，相当于基因组和蛋白质组工程。中药复方复杂系统研究（北京大学韩启德院士）第六十五页，本课件共有81页二、植物来源药物的种类二、植物来源药物的种类 1、天然有机化合物 （1）糖和糖苷类 （2）苯丙素类：苯丙烯、苯丙酸、香豆素等 （3）醌类：辅酶Q10、紫
46、草素 （4）黄酮类：黄酮醇、花色素 （5）鞣质：奎宁酸、槲皮醇。（6）萜类：青蒿素、齐墩果酸 （7）甾体：乌沙苷元、毛第黄毒苷元 （8）生物碱：咖啡因、喜树碱第六十六页，本课件共有81页2、植物蛋白质、多肽、酶类生理活性物质 表2-163、植物糖类药物包括单糖、聚糖和糖衍生物。表2-174、植物脂类药物 （1）脂肪和脂肪酸类：亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸 （2）磷脂类：大豆磷脂 （3）固醇类：豆固醇、-谷固醇。第六十七页，本课件共有81页三、植物来源药物的植被实例三、植物来源药物的植被实例 1、植物SOD 2、植酸钙镁与肌醇 3、植物不饱和脂肪酸四、植物药物来源的研究前景四、植物药物来源的研究前
47、景 1、植物细胞培养 2、植物组织培养 3、有效成分的分离、纯化，结构和功能测定。第六十八页，本课件共有81页第六十九页，本课件共有81页第七十页，本课件共有81页3、若干有用物质的生产、若干有用物质的生产、生物碱、生物碱许许多多生生物物碱碱已已经经用用作作医医学学上上的的药药物物。如如吗吗啡啡等等生生物物碱碱通通常常从从鸦鸦片片中中提提取取，用用作作神神经经麻麻醉醉剂剂，利利用用罂罂粟粟种种子子的的愈愈伤伤组组织织培培养，可提取吗啡碱及其它生物碱。养，可提取吗啡碱及其它生物碱。第七十一页，本课件共有81页、苷类物质、苷类物质利用人参愈伤组织培养生产皂苷已进入利用人参愈伤组织培养生产皂苷已进入
48、工厂化生产。工厂化生产。、醌类物质、醌类物质利利用用紫紫草草、决决明明等等愈愈伤伤组组织织培培养养，生产具有抗细菌活性的醌类物质。生产具有抗细菌活性的醌类物质。第七十二页，本课件共有81页、蛋白质、蛋白质酶制剂酶制剂菜菜豆豆悬悬浮浮细细胞胞培培养养液液中中，检检查查到到有有过氧化酶等多种酶类物质，且活性较高。过氧化酶等多种酶类物质，且活性较高。第七十三页，本课件共有81页胰岛素胰岛素商品胰岛素多数从动物的胰脏提取，商品胰岛素多数从动物的胰脏提取，但价格昂贵。从苦瓜离体培养物种可提但价格昂贵。从苦瓜离体培养物种可提取胰岛素。取胰岛素。氨基酸氨基酸从聚合草愈伤组织中可提取从聚合草愈伤组织中可提取L
49、-谷氨谷氨酰胺，而且含量比植株叶子高酰胺，而且含量比植株叶子高260倍。倍。第七十四页，本课件共有81页、食品添加剂、食品添加剂色素色素单冠毛菊的愈伤组织，可提取红色的花色单冠毛菊的愈伤组织，可提取红色的花色素；葡萄细胞培养，可获得花色素和苷色素；素；葡萄细胞培养，可获得花色素和苷色素；甜菜和菠菜培养，可获得甜菜苷。甜菜和菠菜培养，可获得甜菜苷。第七十五页，本课件共有81页芳香油、香精芳香油、香精芳香油一般是在植物的特殊结构中合芳香油一般是在植物的特殊结构中合成的。据研究，黄菊、鸡冠紫苏等植物成的。据研究，黄菊、鸡冠紫苏等植物的培养细胞能合成芳香油，并可从愈伤的培养细胞能合成芳香油，并可从愈伤
50、组织中提取之。并且鸡冠紫苏的培养细组织中提取之。并且鸡冠紫苏的培养细胞能合成香精。胞能合成香精。第七十六页，本课件共有81页调味剂调味剂甜甜菊菊的的愈愈伤伤组组织织中中可可提提取取甜甜味味剂剂；长春花的培养细胞能生产磷酸二酯。长春花的培养细胞能生产磷酸二酯。第七十七页，本课件共有81页、农药、农药从从除除虫虫菊菊的的愈愈伤伤组组织织中中可可提提取取除除虫虫菊菊酯酯，除除虫虫菊菊是是一一种种特特别别有有效效的的杀杀虫虫剂剂。虽虽然然人人工工可可以以合合成成拟拟除除虫虫菊菊酯酯，但昆虫会逐渐产生抗性，且污染环境。但昆虫会逐渐产生抗性，且污染环境。第七十八页，本课件共有81页4 4、存在问题、存在问