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1、关于核酸提取与鉴定第一页，本课件共有54页1 核酸的提取与鉴定第一节 预处理 第二节 DNA的提取 第三节 RNA的提取 第四节 核酸的鉴定 概述 第二页，本课件共有54页研究对象：研究对象：基因组基因组DNA、质粒、质粒DNA、总、总RNA、mRNA过程：过程：裂解：裂解：破碎细胞，使细胞中的核酸游离在破碎细胞，使细胞中的核酸游离在裂解体系中裂解体系中 纯化：纯化：使核酸与其它杂质彻底分离，如使核酸与其它杂质彻底分离，如蛋白质、盐等蛋白质、盐等一、概一、概 述述 总原则：总原则：应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。鉴定：鉴定：浓度、
2、纯度、分子量、测序浓度、纯度、分子量、测序 （技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）（技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）第三页，本课件共有54页1 1、植物样品、植物样品 新鲜组织新鲜组织先用无菌生理盐水洗；干药材除去霉点，无菌水浸洗；（一）样品预处理（获取分散细胞）（一）样品预处理（获取分散细胞）捣碎或剪碎；加液氮液氮研磨成粉状。第四页，本课件共有54页2、动物样品（1）组织样品：）组织样品：新鲜样品新鲜样品，生理盐水洗，直接使用（或分装、-70/液氮低温保存）；甲醛固定组织甲醛固定组织要先去掉甲醛；石蜡包埋组织石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。第五页，本课件共有54页（2）血细
3、胞样品：）血细胞样品：（3）培养细胞：）培养细胞：离心，弃细胞培养液；用缓冲液多次漂洗；来源：来源：新鲜血液或者冻贮血液；抗凝剂：抗凝剂：一般用EDTA-Na2或柠檬酸钠（枸橼酸钠柠檬酸钠（枸橼酸钠），），不可使用肝素；肝素；分离：分离：红白细胞，一般用明胶，加缓冲液悬浮白细胞。（血清（血清DNA是研究肿瘤的材料之一）是研究肿瘤的材料之一）第六页，本课件共有54页3、微生物培养物样品离心获取菌体细胞，加缓冲液洗涤，加缓冲液悬浮菌体细胞。4、微生物混合样品用缓冲液悬浮菌体，低速离心，沉淀杂质。高速离心获取菌体细胞。用缓冲液洗涤菌体细胞。加缓冲液悬浮菌体细胞。第七页，本课件共有54页（二）提取用具
4、预处理（二）提取用具预处理1 1、DNADNA提取用具的处理提取用具的处理 要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶处理。2 2、RNARNA提取用具的处理提取用具的处理要求无菌，防止二次污染。RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温，提取条件要求严格。第八页，本课件共有54页二、真核生物基因组二、真核生物基因组DNADNA的常规提取的常规提取裂解细胞，溶出裂解细胞，溶出DNA除去杂质除去杂质重新溶解重新溶解DNA沉淀、浓缩沉淀、浓缩DNA第九页，本课件共有54页 破碎细胞，溶解破碎细胞，溶解DNADNA：用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。用提取液（裂解液）破坏细胞壁
5、、细胞膜和核膜。微生物样品提取液：含表面活性剂微生物样品提取液：含表面活性剂SDSSDS、溶菌酶等、溶菌酶等动物样品提取液：含动物样品提取液：含SDSSDS、蛋白酶、蛋白酶K K等等植物样品提取液：含植物样品提取液：含CTABCTAB核酸酶可被核酸酶可被CaCa2+2+、MgMg2+2+等激活，提取液均含有螯合剂（如等激活，提取液均含有螯合剂（如EDTAEDTA，柠，柠檬酸等），螯合这些离子。檬酸等），螯合这些离子。第十页，本课件共有54页2、除去杂质（主要是蛋白质）（SDSSDS，破膜、蛋白质变性沉淀），破膜、蛋白质变性沉淀）苯酚抽苯酚抽提蛋白质提蛋白质氯仿抽提、萃取苯酚氯仿抽提、萃取苯酚经
6、离心后溶液分为三层：上层是核酸溶液、经离心后溶液分为三层：上层是核酸溶液、中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯中间不溶物为变性蛋白质，下层是苯酚氯仿溶液。仿溶液。蛋白质蛋白质苯酚氯仿苯酚氯仿核酸溶液核酸溶液第十一页，本课件共有54页3.沉淀DNA有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀DNADNA：2 2倍体积无水乙醇（或倍体积无水乙醇（或1 1倍体积的异戊醇）倍体积的异戊醇）再用再用75%75%乙醇清洗多次。乙醇清洗多次。4.重新溶解DNA将将DNADNA溶于水或溶于水或TETE溶液。溶液。第十二页，本课件共有54页qCTAB法原理法原理（植物（植物DNA提取经典方法）提取经典方法）CTAB（hexadec
7、yltrimethylammonium bromide，十六烷基，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。基因组DNACTAB法
8、第十三页，本课件共有54页q SDS法原理法原理基因组DNASDS法SDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂，在在高高温温（5565）条条件件下下能能裂裂解解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提提高高盐盐(KAc或或NH4Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度（冰冰浴浴），使使蛋蛋白白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上上清清液液中中的的DNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提，反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水相中的水相中的DNA。第十四页，本课件共有54页DNA提取的一般流程提取的一般流程第十五页，本课件共有
9、54页三、质粒DNA的提取质粒质粒DNA特点：特点：（1）细菌基因组）细菌基因组DNA以外的小型闭合环状双链以外的小型闭合环状双链DNA分子。分子。（2）大都含有抗生素抗性基因。）大都含有抗生素抗性基因。（3）可自我复制或表达。）可自我复制或表达。（重组（重组DNA技术中构建载体）技术中构建载体）（4）大小）大小1-300 kb。第十六页，本课件共有54页1 1、培养细菌和扩增质粒、培养细菌和扩增质粒n 加适当的抑制剂（如氯霉素），抑制细菌蛋加适当的抑制剂（如氯霉素），抑制细菌蛋白质合成，抑制细胞分裂，但质粒会继续复制。白质合成，抑制细胞分裂，但质粒会继续复制。第十七页，本课件共有54页2 2
10、、收获细菌和溶菌、收获细菌和溶菌 离心收集细菌细胞。离心收集细菌细胞。细菌裂解方法：细菌裂解方法：机械法机械法 化学试剂法化学试剂法 （SDSSDS）溶菌酶化学试剂联合法（最常用）溶菌酶化学试剂联合法（最常用）第十八页，本课件共有54页3 3、分离质粒、分离质粒DNADNA基因组基因组DNADNA与质粒与质粒DNADNA分离分离碱裂解法（最常用）碱裂解法（最常用）用溶液用溶液1 1（EDTAEDTA）悬浮菌体。）悬浮菌体。溶液溶液2 2（NaOHNaOH和和SDSSDS）裂解菌体，蛋白质与）裂解菌体，蛋白质与DNADNA发生变性。发生变性。溶液溶液3 3中和中和pHpH，质粒，质粒DNADNA
11、分子能够迅速复性，呈溶解状态，基分子能够迅速复性，呈溶解状态，基因组因组DNADNA不复性与蛋白质形成絮状沉淀。不复性与蛋白质形成絮状沉淀。离心后，质粒离心后，质粒DNADNA留在上清液中。留在上清液中。第十九页，本课件共有54页通过加热，使细菌裂解、蛋白质和通过加热，使细菌裂解、蛋白质和DNADNA变性。变性。降低温度，质粒降低温度，质粒DNADNA复性留于上清液，基因组复性留于上清液，基因组DNADNA复性很慢与蛋白复性很慢与蛋白质形成沉淀，可通过离心除去。质形成沉淀，可通过离心除去。煮沸裂解法（偶尔用）煮沸裂解法（偶尔用）梯度离心法（极少用）梯度离心法（极少用）基因组基因组DNADNA断
12、裂，吸附大量断裂，吸附大量EBEB，密度大；质粒，密度大；质粒DNADNA密度小。密度小。利用氯化铯梯度离心，分离基因组利用氯化铯梯度离心，分离基因组DNADNA和质粒和质粒DNADNA。第二十页，本课件共有54页离心分离后，吸取含有质粒离心分离后，吸取含有质粒DNADNA的上清液。的上清液。用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白质。用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白质。用乙醇或异戊醇沉淀质粒用乙醇或异戊醇沉淀质粒DNADNA（与基因组（与基因组DNADNA方法同）。方法同）。4 4、质粒、质粒DNADNA的纯化的纯化蛋白质蛋白质苯酚氯仿苯酚氯仿核酸溶液核酸溶液第二十一页，本课件共
13、有54页四、四、RNARNA的提取的提取（一）总RNA的提取所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。最关键的是抑制RNA酶的活性。第二十二页，本课件共有54页常用的常用的RNARNA酶抑制剂酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的是一种强烈但不彻底的RNARNA酶酶抑制剂。抑制剂。异硫氰酸胍：可裂解细胞并抑制RNA酶，目前被认为是最有效的最有效的RNARNA酶抑制剂酶抑制剂。RNA酶的蛋白抑制剂(RNAsin)
14、等。第二十三页，本课件共有54页（1 1）提取）提取RNARNA所用器皿的处理及溶液的准备所用器皿的处理及溶液的准备塑料制品：塑料制品：使用灭菌的一次性用品。或用0.1DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用氯仿处理）。玻璃用品：玻璃用品：使用前于180的高温下干烤6h以上，或在220下干烤3h以上。有机玻璃的电泳槽等，有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再用3H2O2室温浸泡10min，然后用0.1DEPC水冲洗，晾干。第二十四页，本课件共有54页所需溶液的配制：所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干
15、烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。严格来说，所有溶液均应用0.1DEPCDEPC于于37处理1212小时以上，然后于小时以上，然后于100加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPCDEPC。第二十五页，本课件共有54页 在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩，应勤换手套。（2 2）RNARNA提取中提取中RNaseRNase污染的控制污染的控制 第二十六页，本课件共有54页第二十七页，本课件共有54页RNARNA的提取方法的提取方法 1 1、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法氯化铯超速离心法使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效抑制RNA酶的活
16、性；再进行CsCl密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清液中。这种方法能得到高质量的RNA，同时分离出细胞染色体DNA。第二十八页，本课件共有54页2 2、盐酸胍、盐酸胍-有机溶剂法有机溶剂法利用盐酸胍使蛋白质变性，抑制RNA酶；3 3、氯化锂、氯化锂-尿素法尿素法利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶；氯化锂选择性沉淀RNA。其缺点是有时会存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会丢失一些小分子RNA。第二十九页，本课件共有54页4 4、一步快速热酚抽提法、一步快速热酚抽提法将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂SDS等联合使用，抑制RNA的降解，裂解细胞，增强对核蛋白复合物的解离，使
17、RNA与蛋白质分离；用高温苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和DNA，乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA。此法操作简便快速，可在3小时以内处理大批样品，对大量或少量组织的细胞RNA提取均甚合适。第三十页，本课件共有54页5 5、试剂盒快速提取法、试剂盒快速提取法裂解液含胍盐，抑制RNA酶，使蛋白质和DNA同时变性；氯仿等抽提去除蛋白质和DNA；乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA；此法操作简便快速。第三十一页，本课件共有54页Trizol一步提取总RNA：TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽
18、可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。第三十二页，本课件共有54页1）实验前取冰，）实验前取冰，4离心机预冷，离心机预冷，DEPC处理水处理水（高压灭菌处理）（高压灭菌处理）配制的配制的75%乙醇乙醇4预冷；预冷；步骤：2）1ml Trizol匀浆好的样品；匀浆好的样品；3）加入）加入0.2ml氯仿氯仿，颠倒颠倒混匀（混匀（15秒秒）“慢慢”，氯仿使蛋白，氯仿使蛋白变性变性4）室温室温，静置，静置3分钟分钟；5）离心机）离心机4、14000转转/分，离心分，离心15分钟分钟；静置；静置1分钟分钟（分层
19、即可；（分层即可；样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要存在于水相中）主要存在于水相中）6）取上清取上清0.5ml（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点也不要吸到（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点也不要吸到中间层的物质）中间层的物质）放入另一个放入另一个1.5ml的的EP管中；管中；7）加入等体积的）加入等体积的异丙醇异丙醇（0.5ml），涡旋混匀；），涡旋混匀；第三十三页，本课件共有54页8）室温室温，静置，静置10分钟分钟（该条件由（该条件由Trizol试剂盒提供；其他提供的条件用试剂盒提供；其他提供的
20、条件用-20、1小时，目的为了更好分层）小时，目的为了更好分层）9）离心机）离心机4、14000转转/分，离心分，离心10分钟分钟10）弃上液弃上液(移液器调至移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，沿液面吸步，沿液面吸弃约弃约0.9ml上清；第上清；第2步，沿液面吸弃其余上清步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接触到沉淀斑区）注意吸头不要接触到沉淀斑区）11)沿试管内壁轻轻加入沿试管内壁轻轻加入1ml 4预冷的预冷的75%乙醇乙醇,注意切勿冲注意切勿冲击到沉淀斑区击到沉淀斑区12）离心机）离心机4、10000转转/分，离心分，离心5分钟分钟13）弃上液弃
21、上液（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过程中把程中把RNA烤干），烤干），60恒温箱干燥恒温箱干燥5分钟分钟（注意：打开管盖；或用真（注意：打开管盖；或用真空干燥空干燥5分钟）分钟）14）加入）加入50l DEPC处理水处理水溶解溶解（可以根据管底的白色沉淀判断（可以根据管底的白色沉淀判断RNA量的多少加量的多少加DEPC处理水）处理水）15）-80冰箱保存。冰箱保存。第三十四页，本课件共有54页组织匀浆 第三十五页，本课件共有54页（二）mRNA的提取从总RNA中分离mRNA，用Oligo（dT）层析柱。mRNA含polyA，在高盐
22、浓度条件下与Oligo（dT）结合，其他成分被洗掉，再用低盐浓度洗脱mRNA。第三十六页，本课件共有54页（一）核酸浓度检测 OD2601时（比色皿厚度时（比色皿厚度1.0cm）双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml，单链单链DNA或或RNA浓度为浓度为40 g/ml。DNA(g/ml)=OD26050RNA（g/ml）=OD26040五、核酸的鉴定五、核酸的鉴定第三十七页，本课件共有54页（二）核酸纯度检测（紫外吸收法紫外吸收法）核酸在260 nm处有吸收峰，蛋白质在280 nm有吸收峰核酸的纯度用ODOD260/OD280比值表示。DNA样品：样品：OD260260/OD280280 1
23、.8，DNA纯度高纯度高OD260260/OD280280 1.8，含，含RNA，或，或DNA部分降解部分降解OD260260/OD280280 1.8，含苯酚或蛋白杂质，含苯酚或蛋白杂质RNA样品：样品：OD260260/OD280280 1.82.0 RNA纯度高纯度高 2.0，RNA出现降解出现降解第三十八页，本课件共有54页（三）核酸完整性检测（三）核酸完整性检测核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。凝胶上RNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应该清晰地看到28s rRNA、18s rRNA、5s
24、 rRNA的三条带，其中28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍，5s rRNA 较弱。电泳：带电颗粒在电场的作用下发生迁移。第三十九页，本课件共有54页根据电泳支持介质分为根据电泳支持介质分为琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：多用于鉴定较大核酸片段（0.160 kb）聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于鉴定较小的核酸片段（501000 bp）六、电泳六、电泳第四十页，本课件共有54页琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种多糖。凝胶具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。琼脂糖浓度()线型DNA分子的分
25、离范围(kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12第四十一页，本课件共有54页琼脂糖凝胶电泳装置琼脂糖凝胶电泳装置 第四十二页，本课件共有54页琼脂糖凝胶电泳有许多优点：琼脂糖凝胶电泳有许多优点：操作简单，电泳速度快，分离核酸范围广；电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；电泳后区带易染色，便于定量测定；可用于核酸的纯化和分离（电洗脱法）；可制成干膜可长期保存。第四十三页，本课件共有54页RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的在非变性电泳中，可以分离混
26、合物中不同分子量的RNA分子，但是无法确定分子量。分子，但是无法确定分子量。第四十四页，本课件共有54页RNA变性电泳：变性电泳：RNA为单链分子，局部形成发卡结构，直接电泳无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，迁移率才与分子量成正比。方法：方法：电泳前样品保温60，RNA分子伸展。凝胶中加有甲醛，使RNA在电泳过程中保持单链结构。第四十五页，本课件共有54页操作流程大致为：操作流程大致为：凝胶的制备加样电泳染色观察和拍照电泳缓冲液：电泳缓冲液：TAE、TBE（用于电泳和制胶）第四十六页，本课件共有54页上样缓冲液：制胶制胶第四十七页，本课件共有54页加样加样第四十八页，本课件
27、共有54页常常用用的的电电泳泳缓缓冲冲液液电泳过程电泳过程电泳电泳第四十九页，本课件共有54页DNA电泳（紫外灯）电泳（紫外灯）第五十页，本课件共有54页 基因组基因组DNA抽提结果电泳图抽提结果电泳图 第五十一页，本课件共有54页总总RNARNA抽提结果电泳图抽提结果电泳图 mRNA利用凝胶电泳进行核酸的纯化和回收（电利用凝胶电泳进行核酸的纯化和回收（电利用凝胶电泳进行核酸的纯化和回收（电利用凝胶电泳进行核酸的纯化和回收（电洗脱法）洗脱法）洗脱法）洗脱法）第五十二页，本课件共有54页聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。凝胶孔径大小由聚合链的长度及交联度所决定。分辨力高于琼脂糖凝胶电泳，主要用于分子量小的DNA的分离，或在DNA测序中使用，操作复杂。第五十三页，本课件共有54页感感谢谢大大家家观观看看第五十四页，本课件共有54页