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1、关于显微操作技术荧光显微镜技术的特点和应用第一页，本课件共有24页荧光显微镜的种类荧光显微镜的种类透射式透射式落射式落射式第二页，本课件共有24页和传统显微技术相比和传统显微技术相比,荧光显微技术具有以下优点荧光显微技术具有以下优点:(1)(1)荧光显微镜所用光源的波长比传统显微镜光源的荧光显微镜所用光源的波长比传统显微镜光源的波长短波长短1/2,1/2,因此荧光显微镜的分辨能力超出了传统因此荧光显微镜的分辨能力超出了传统显微镜的分辨率的极限显微镜的分辨率的极限(2)(2)荧光显微镜技术具有高度灵敏性和专一性荧光显微镜技术具有高度灵敏性和专一性.它所用它所用染料的量是极其微小的染料的量是极其微
2、小的,只相当于传统显微技术中染只相当于传统显微技术中染料消耗量的几千分之一料消耗量的几千分之一.第三页，本课件共有24页(3)(3)荧光显微镜能够直接显示细胞内的生物化学成分荧光显微镜能够直接显示细胞内的生物化学成分,并且显示的彩色效果很明亮并且显示的彩色效果很明亮,极易观察极易观察,极易进行极易进行定量分析定量分析,而且能以极低浓度的染料检测出含量极微的而且能以极低浓度的染料检测出含量极微的物质物质.(4)(4)随着新的荧光染料的发明随着新的荧光染料的发明,可不断扩大被测物质可不断扩大被测物质的范围的范围.第四页，本课件共有24页生物学材料，有各种产生荧光生物学材料，有各种产生荧光:1.1.
3、自发荧光自发荧光:或原发荧光或原发荧光 细胞组织中自然存在的某些物质可被激发产生荧细胞组织中自然存在的某些物质可被激发产生荧光光2.2.诱发荧光诱发荧光 材料中的某些物质经一定的化学处理后，可转化为材料中的某些物质经一定的化学处理后，可转化为荧光色团，由此被诱发产生荧光。最常见的是甲醛诱发荧光色团，由此被诱发产生荧光。最常见的是甲醛诱发蛋白质中所含的芳香乙胺基团转化为荧光色团。戊二醛蛋白质中所含的芳香乙胺基团转化为荧光色团。戊二醛也能诱发荧光也能诱发荧光第五页，本课件共有24页3 3荧光染料染色：荧光染料染色：应用含荧光色团的物质作为染料，使与生物组织应用含荧光色团的物质作为染料，使与生物组织
4、中和该物质有特殊亲和力的成分相结合，即可被激发中和该物质有特殊亲和力的成分相结合，即可被激发荧光。这类染料称为荧光染料或荧色素。许多常规染荧光。这类染料称为荧光染料或荧色素。许多常规染色剂色剂(如刚果红、曙红、碱性品红、水溶性苯胺蓝等如刚果红、曙红、碱性品红、水溶性苯胺蓝等)兼有荧光染料的性能兼有荧光染料的性能第六页，本课件共有24页1.DNA1.DNA研究研究用细胞荧光测定技术测量用细胞荧光测定技术测量DNA,DNA,是荧光显微技术和细是荧光显微技术和细胞光度技术相结合的产物胞光度技术相结合的产物,标志着前者由定性向定量标志着前者由定性向定量测定发展测定发展.第七页，本课件共有24页吖啶橙吖
5、啶橙3 3，6 6（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 C17H19N3 HCl ZnCl HCl ZnCl,分子量分子量438.12g/mol,438.12g/mol,是一种荧光是一种荧光色素色素，其检测激发滤光片波长，其检测激发滤光片波长488nm,488nm,阻断阻断滤光片滤光片波长波长515nm515nm。第八页，本课件共有24页吖啶橙吖啶橙染色原理染色原理:吖啶橙可对细胞中的吖啶橙可对细胞中的DNADNA和和RNARNA同时染色而同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm492nm，荧光发射，荧光发射峰为峰
6、为530nm530nm（DNADNA）、）、640640（RNARNA），它与双链），它与双链DNADNA的结的结合方式是嵌入双链之间，而与单链合方式是嵌入双链之间，而与单链DNADNA和和RNARNA则由静则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（502nm502nm）激发下，）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约细胞核发亮绿色荧光（约530nm530nm），胞质），胞质RNARNA发橘红发橘红色荧光（色荧光（580nm580nm）。）。第九页，本课件共有24页它与它与细胞细胞中中DNADNA和和RNARNA结合量存在差别，可发出不同结合量存在差别，可发出不同颜色的颜色
7、的荧光荧光，与，与DNADNA结合量少发绿色荧光，与结合量少发绿色荧光，与RNARNA结合结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核能透过细胞膜，使核DNADNA和和RNARNA染色。因此，在荧光显染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光。绿色或黄绿色均匀荧光。第十页，本课件共有24页体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色可见含可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质显
8、示橘红色荧光的细胞质显示橘红色荧光第十一页，本课件共有24页DAPIDAPIDAPIDAPI即即4,6-4,6-二脒基二脒基-2-2-苯基吲哚苯基吲哚(4,6-diamidino-2-(4,6-diamidino-2-phenylindole)phenylindole)，是一种能够与，是一种能够与DNADNA强力强力结合的结合的荧光荧光染料染料，最大吸收波长为，最大吸收波长为358nm358nm，最大发射波长为，最大发射波长为461nm461nm。第十二页，本课件共有24页DAPIDAPI染色原理：染色原理：DAPI DAPI 为一种为一种荧光染料荧光染料，可以穿透细胞膜与，可以穿透细胞膜与细
9、胞核细胞核中的双链中的双链DNADNA结合而发挥标记的作用，可以产生比结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPIDAPI自身强自身强2020多倍的荧光，和多倍的荧光，和EBEB相比，对双链相比，对双链DNADNA的的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记细胞标记的效率高的效率高(几乎为几乎为100%)100%)，且对活细胞无毒副作用。，且对活细胞无毒副作用。第十三页，本课件共有24页第十四页，本课件共有24页2.2.细胞壁研究细胞壁研究 荧光显微技术在植物细胞学中应用的一个突出方面荧光显
10、微技术在植物细胞学中应用的一个突出方面,是用于鉴定细胞壁成分是用于鉴定细胞壁成分,研究壁形成和再生研究壁形成和再生,以及壁在植以及壁在植物发育过程中和环境影响下性质的变化物发育过程中和环境影响下性质的变化 观察细胞壁的方法很多观察细胞壁的方法很多,如用专一的染料染色或如用专一的染料染色或利用纤维素的偏振光性质等。现在国外常用的方法是利用纤维素的偏振光性质等。现在国外常用的方法是荧光增白剂染色荧光增白剂染色,在在4QOnm4QOnm左右的激发光照射下观察细左右的激发光照射下观察细胞壁胞壁(纤维素纤维素)所产生的绿色荧光来判断细胞壁的有无所产生的绿色荧光来判断细胞壁的有无 第十五页，本课件共有24
11、页荧光增白剂染色荧光增白剂染色荧光增白剂和细胞壁成分有强烈亲和力荧光增白剂和细胞壁成分有强烈亲和力,当前常用的荧当前常用的荧光增白剂有光增白剂有ST,M2R,VBL.STST,M2R,VBL.ST开始被用于显示细菌开始被用于显示细菌,放线放线菌与真菌的细胞壁菌与真菌的细胞壁,在粘菌材料中在粘菌材料中,它被证明与纤维素它被证明与纤维素和几丁质有亲和力和几丁质有亲和力胼胝质是一种以胼胝质是一种以-1,3-1,3键结合的葡聚糖。在植物的键结合的葡聚糖。在植物的筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要的筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要的调节作用，其合成、分解直接关系植物正常的生长调节作用，
12、其合成、分解直接关系植物正常的生长代谢过程。代谢过程。第十六页，本课件共有24页胼胝质是一种以胼胝质是一种以-1,3-1,3键结合的葡聚糖。在植物的键结合的葡聚糖。在植物的筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重要的调节作用，其合成、分解直接关系植物正常的的调节作用，其合成、分解直接关系植物正常的生长代谢过程。生长代谢过程。第十七页，本课件共有24页3 3细胞生活力测定细胞生活力测定荧光素荧光素双醋酸酯（双醋酸酯（FDAFDA）是一种常用的培养动）是一种常用的培养动植物细胞植物细胞以及以及植物细胞植物细胞原生质体原生质体的生活力鉴定染料，其染色机理也利
13、用了的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：死活细胞在代谢上的差异：FDAFDA本身不产生荧光，也无极性，本身不产生荧光，也无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。当能自由渗透出入完整的细胞膜。当FDAFDA进入活细胞后，被细胞进入活细胞后，被细胞内的脂酶分解，生成有极性的、能产生荧光的物质内的脂酶分解，生成有极性的、能产生荧光的物质荧光荧光素素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞膜内，因，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞膜内，因而使有活力的细胞产生绿色荧光；而无活力的细胞因不能使而使有活力的细胞产生绿色荧光；而无活力的细胞因不能使FDAFDA分解，而无法产生荧光
14、分解，而无法产生荧光 第十八页，本课件共有24页活体染色活体染色vital staining 将无毒或毒性较小的某种染料注入动物体内,可被机体内某些组织或细胞所摄取,称为活体.第十九页，本课件共有24页影响荧光的因素影响荧光的因素1.pH1.pH的影响的影响 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一般都与溶液光一般都与溶液PHPH值有关，例如：在值有关，例如：在pH=7-12pH=7-12的溶液的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色荧光；而在中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色荧光；而在pH2pH13pH13的溶液中苯胺以离子形式存在，都不会的溶
15、液中苯胺以离子形式存在，都不会发出荧光。发出荧光。同时所用酸的种类也影响荧光的强度，例如：奎同时所用酸的种类也影响荧光的强度，例如：奎宁在硫酸溶液中的荧光比在盐酸中的要强。宁在硫酸溶液中的荧光比在盐酸中的要强。第二十页，本课件共有24页2.2.温度的影响温度的影响 温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度下降时，温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度下降时，介质的粘度增大，荧光物质与分子的碰撞也随之减少，介质的粘度增大，荧光物质与分子的碰撞也随之减少，去活化过程也减少，则荧光强度增加。相反，随着温去活化过程也减少，则荧光强度增加。相反，随着温度上升，荧光物质与分子的碰撞频率增加，使去活化度上升，荧光
16、物质与分子的碰撞频率增加，使去活化几率增加，则荧光强度下降。几率增加，则荧光强度下降。第二十一页，本课件共有24页3.3.荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 在稀溶液中：在稀溶液中：F FKc F Kc F 为荧光强度为荧光强度 K-K-检测检测效率（由仪器决定）效率（由仪器决定）c c 为液体的浓度高浓度时，荧为液体的浓度高浓度时，荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使光物质发生熄灭和自吸收现象，使F F与与c c不呈线性关系不呈线性关系第二十二页，本课件共有24页4猝灭剂猝灭剂 何为猝灭何为猝灭?由于某些原因使发光材料发生非辐射跃迁，从而由于某些原因使发光材料发生非辐射跃迁，从而降低了发光效率的现象叫做猝灭降低了发光效率的现象叫做猝灭 在荧光物质溶液中在荧光物质溶液中,加入某种化合物加入某种化合物,使溶液的荧使溶液的荧光强度显著降低光强度显著降低,这种化合物称为猝灭剂这种化合物称为猝灭剂第二十三页，本课件共有24页08.12.2022感感谢谢大大家家观观看看第二十四页，本课件共有24页