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1、第五章植物原生质体的分离、培养与杂交杨柏云南昌大学生命科学与食品工程学院一.引言在细胞工程中，植物原生质体不但是植物细胞杂交良好的亲本，而且是植物细胞遗传工程的理想受体，此外，植物原生质体也是细胞生物学研究的很有用的实验材料。植物原生质体的分离和培养是达到这些目的的重要技术基础，因此，掌握和运用这一技术是十分重要的。二.植物原生质体的基本特点与作用植物原生质体是脱掉了细胞壁的、仅有质膜包围、裸露的、活植物细胞。与完整的植物细胞相比，它有下列主要特点：1.游离的原生质体是真正的单细胞，在同一时间内能得到大量的遗传上同质的原生质体，用它可象细菌细胞那样进行多种遗传学研究。2.原生质体能超越性细胞的
2、一些不亲和障碍，为较远缘的植物细胞杂交提供了融合亲本。二.植物原生质体的基本特点与作用3.原生质体能有效地摄取多种外源颗粒，如DNA，质粒、病毒、细菌和其它细胞器，因此在植物遗传工程中有重要作用。4.植物原生质体也和植物细胞一样，具有该植物体的全部遗传信息，在合适的培养条件下，它能象一粒种子那样发育成与其亲本相似的新的植物，即具有遗传全能性。二.植物原生质体的基本特点与作用5.植物原生质体为研究细胞壁的生物合成提供了方便。6.植物原生质体为研究细胞膜与信息的传递，能量的转换，物质的运输等基本现象之间的密切联系提供了可能。7.植物原生质体不但是良好的受体，同时又是分离细胞内各种细胞器，如细胞核、
3、叶绿体、线粒体等的好材料。见图1：三三.植物原生质体的材料来源植物原生质体的材料来源研究表明，几乎能从植物的所有部位得到原生质体(详见图二)，其中以叶片为多，因为植物叶肉细胞的原生质体有下面几个优点：1.取材容易，植株可来自盆栽和温室栽培，也可在试管中培育无菌苗。2.原生质体在生理和遗传特性上比较一致。三三.植物原生质体的材料来源植物原生质体的材料来源3.比较容易用酶解法分离。根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。花粉经特异酶处理也能得到原生质体，在单倍体遗传育种中有特殊的用途。三三.植物原生质体的材料来源植物原生质体的材料来源原生质体也可以从组织培养的材料中大量
4、获得。由于组织培养的严格条件，使得材料的重复性好，实验材料可做到常年供应。值得注意的是，在考虑分离植物原生质体时，既要采用容易获得原生质体的植物材料，但更重要的是要选用易于再生完整植株的细胞。详见图2四.植物原生质体的分离和纯化(一一)原生质体的分离原生质体的分离旱在1892年就有人用机械法分离原生质体。直到1960年，英国的科金(Cocking)首先采用酶解法分离原生质体，这一重要发现开辟了细胞工程研究的许多领域，作出了巨大的贡献。四.植物原生质体的分离和纯化酶解法有下面几个优点：l能获得大量的原生质体；l条件温和，原生质体完整性好；l原生质体纯净度高；下面以叶片和悬浮培养的细胞为材料介绍分
5、离原生质体的一般步骤：(详见图3)四.植物原生质体的分离和纯化1.材料的准备与消毒：取充分展开的幼叶，用自来水冲冼干净后，放入70%洒精中进行表面消毒，再放入2%的次氯酸钠溶液中处理10分钟，再用无菌水冲冼3-4次。悬浮培养的细胞一般是用胚性细胞，这有利于原生质体的再生。2.酶解：用镊子撕去叶子的下表皮后，切成2厘米见方的小片，使去表皮的一层朝下放入酶液中处理，在25-28摄氏度，黑暗条件下酶解3-4小时。若采用悬浮培养的细胞，则采用继代3天的细胞最好，经离心收集细胞，放入酶液中置低速转床酶解8-12小时。分离植物原生质体常用试剂见表1.四.植物原生质体的分离和纯化(二)原生质体的纯化植物材料
6、经酶解后纯化原生质体的步骤如下：1.酶解悬浮液用400目的不锈钢或尼龙网过滤，以除去未消化的碎片。2.将含有原生质体的酶液收集到离心管中，低速离心使原生质体沉于管底，倒掉上清液。(二)原生质体的纯化3.在离心管中加入适量的洗涤液，并离心。4.重复上述操作三次，使酶解液充分除去，最后用原生质体培养液洗涤一次。上述的离心纯化法可细分为：A沉降法；B漂浮法；C沉降法和漂浮法结合等三种。(详见图4)四.植物原生质体的分离和纯化(三)原生质体的活力测定用于培养和细胞工程操作的必须是健康的有活力的原生质体。方法有二：一是凭借形态可识别原生质体的存活性。二是采用特异的染色方法来确定，可用0.1%酚藏花红液染
7、色，活的原生质体能着红色；最好是采用荧光素双醋酸酯(FDA)染色。有活力的原生质体带有荧光，无活力的不产生荧光。五.影响原生质体分离的几个因素1.材料不同其细胞壁的组成和结构也有差异。因此分解细胞壁的酶的种类和浓度也不相同，如分离根尖细胞的原生质体要有较多的果胶酶。2.渗透压稳定剂的种类和浓度也因材料不同而有变化。3.在酶液中加入适量的氯化钙和磷酸二氢钾作为原生质体稳定剂，可增强质膜的稳定性。五.影响原生质体分离的几个因素4.酶液的pH值也直接影响分离的速度和稳定性。pH值低则分离速度较快，而损坏的较多；pH值高则分离速度较慢，而完整性较好；故酶液的pH值一般为57左右。5.取材植株的生理状态
8、也是重要的因素，如采用悬浮培养的细胞一般用继代三天的较为理想。(详见表二)六.培养原生质体的几种方法原生质体经分离和纯化后，需要进行活力测定和计数。原生质体培养时有一种密度效应，一般在每毫升培养液中应有10个左右的原生质体有利于培养。计数可用血球计数板进行。常用的原生质体培养方法有以下几种：(详见图5)1.液体培养法：是把纯化后的原生质体悬浮于液体培养基中的培养方法。又可分为液体浅层培养法和液体悬滴法二种。六.培养原生质体的几种方法2.固体平板法：它是把原生质体均匀地埋入琼脂培养基中的培养方法。3.双层培养法：是在琼脂培养基上部加入一薄层液体原生质体培养液的培养方法。4.琼脂糖包埋法：同固体平
9、板法。详见图5六.培养原生质体的几种方法七.植物原生质体的发育和植株再生植物原生质体在培养过程中，一般要经过下面几个不同的阶段：1.细胞壁再生：2.细胞分裂：3.愈伤组织或胚状体的形成：4.植株再生：有二条途径，一是从愈伤组织诱导形态发生；二是诱导胚状体。八.原生质体融合原生质体融合，也叫体细胞杂交，就是使分离出来的不同亲本的原生质体之间在人工控制的条件下，像性细胞受精作用那样互相融合成一体。受精作用是一种自发的融合，而原生质体由于质膜表面带有负电荷，它们之间通常是相互排斥的，所以自然融合频率极低。所以要采用一定的方法加以诱导以促进原生质体的融合。八.原生质体融合八.原生质体融合八.原生质体融
10、合原生质体的融合过程八.原生质体融合原生质体的融合过程八.原生质体融合八.原生质体融合（一）原生质体融合的方法1.无机盐诱导融合用来做融合剂的无机盐是硝酸钠，1972年Carlsony就是用它来融合烟草的原生质体，并首次获得种间的体细胞杂种。其原理是硝酸钠的作用是中和了质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起，但硝酸钠对原生质体有害作用，且诱导频率也很低，所以目前很少有人采用。八.原生质体融合2.聚二乙醇（PEG）与高pH的Ca2+相结合的诱导融合法（1）以常规的方法收集原生质体，将两亲本的原生质体高密度等体积混合。（2）滴3滴混合的原生质体悬浮液于载玻片上，放置10分钟。（3）
11、加PEG450L。PEG的制备方法：1gPEG加入pH5.5的2ml的0.1mol/L的葡萄糖、0.5mmol/LCaCl2的0.7mmol/LKH2PO4溶液中，再放置1020分钟。八.原生质体融合(4)加0.5ml高Ca2+、高pH溶液，间隔10分钟再加一次。其组成是50mmol/LCaCl2、50mmol/L的甘氨酸钠，pH10.5。(5)加1ml原生质体培养基洗涤，洗涤5次，每次间隔5分钟。(6)最后加300-500L原生质体培养基，以微滴形式培养。八.原生质体融合用此方法的诱导频率可以高达10%-50%。并无种属特性，几乎可以诱导任何原生质体之间的融合。其原理是PEG是一种略带负电的
12、高分子化合物，在原生质体的融合中起到一种桥的作用，可以使原生质体凝聚，而钙离子的加入会在质膜与PEG中间起到连接作用。在洗脱PEG过程中，会导致质膜表面电荷重排。由于粘连的质膜大面积紧密相连，这种电荷的重排会导致一个原生质体的负性电荷部分与另一个原生质体的正电荷部分相连而导致融合。P1P1P2P2P1 P2P1 P2高Ca2+高pH融 合洗 涤培 养选 择混合静止1min1min加入PEGPEG加入培养基融合技术要点：电场下形成原生质体原生质体凝聚体体八.原生质体融合3.电融合技术就是使用电融合仪，其优点在于避免了PEG、高钙离子，高pH强加于原生质体的生理非常条件，同时融合的条件更加数据化，更便于控制和相互比较。交变电流的强弱、处理时间的长短、电泳冲的大小等因素对融合的效果都有明显的影响。八.原生质体融合（二）杂种细胞的选择与细胞杂种的鉴定1.杂种细胞的选择方法2.（1）培养基促进异核体生长的选择方法3.（2）叶绿素缺失互补选择法4.（3）机械分离，肉眼分辩法5.（4）双突变系选择法6.（5）荧光标记选择法八.原生质体融合2.体细胞杂种的鉴定这种鉴定不但在于确认细胞杂种的杂种性，而且必须弄清楚融合亲本的双方各贡献了哪些遗传成分，因为在杂种细胞发育成完整植株的过程中，往往有一方的染色体更易消减掉。（1）形态学鉴定（2）细胞学鉴定（3）DNA内切图谱分析