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1、第二节第二节 DNA连接酶连接酶（DNA ligase）一、一、DNADNA连接酶的作用连接酶的作用1 1、修复双链、修复双链DNADNA上缺口处的磷酸二酯键上缺口处的磷酸二酯键2 2、修复与修复与RNARNA链结合的链结合的DNADNA链上缺口处链上缺口处的磷酸二酯键的磷酸二酯键3 3、连接多个平头双链、连接多个平头双链DNADNA分子分子（1）DNA连接酶连接酶只能只能连接相邻核苷酸之间的连接相邻核苷酸之间的切刻（切刻（nick）；（2）如果是缺少一个或几个核苷酸的）如果是缺少一个或几个核苷酸的裂口裂口（gap），），DNA连接酶是连接酶是无法无法连接的；连接的；注注 意意（3 3）DNA
2、DNA连接酶连接酶不能不能连接连接两条单链两条单链DNADNA分子分子或或环化的环化的单链单链DNADNA分子，分子，被连接的被连接的DNADNA链链必须必须是是双螺旋双螺旋DNADNA分子分子的一部分；的一部分；（4 4）DNADNA连接酶催化的连接反应是连接酶催化的连接反应是需要能量需要能量的：在的：在大肠杆菌大肠杆菌或或其他细菌其他细菌中，利用中，利用NADNAD+（烟酰胺腺嘌呤二（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），核苷酸），在在动物细胞中动物细胞中及及噬菌体中噬菌体中，利用，利用ATPATP（腺（腺苷三磷酸苷三磷酸）。）。注注 意意 T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶 大肠杆菌大肠杆菌DNA连接
3、酶连接酶二、二、DNADNA连接酶的种类连接酶的种类 T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶 该酶最早是该酶最早是从从T4噬菌体感染的大肠杆菌噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，中提取的，是是T4噬菌体基因噬菌体基因30编码的产物，分子量为编码的产物，分子量为68ku，需要，需要ATP作为辅助因子。作为辅助因子。两个带有互补粘性末端的双链两个带有互补粘性末端的双链DNA分子分子一条带有切刻的双链一条带有切刻的双链DNA分子分子两个带有平头末端的双链两个带有平头末端的双链DNA分子分子DNA-RNA杂合体分子中切刻杂合体分子中切刻该该酶酶可可连连接接 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶 该
4、酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌该酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌基因组中基因组中lig基因编码，分子量为基因编码，分子量为75ku，需要，需要NAD+作作为辅助因子。为辅助因子。具有同源互补粘性末端的不同具有同源互补粘性末端的不同DNA分子分子 一条带有切刻的双链一条带有切刻的双链DNA分子分子该酶可连接该酶可连接但该酶几乎不能催化两个平头末端但该酶几乎不能催化两个平头末端DNADNA分子的连接分子的连接T4噬菌体噬菌体DNA连接酶：连接酶：该酶在该酶在DNA体外重组中体外重组中比大肠杆菌比大肠杆菌DNA连接酶连接酶应用应用广泛广泛(既能连接粘性末端既能连接粘性末端,也也能连
5、接平头末端能连接平头末端)。两两种种酶酶各各自自的的优优点点大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶：连接酶：该酶的连接产物转化细菌后，该酶的连接产物转化细菌后，假阳性背假阳性背景低景低(由于它对由于它对DNADNA末端的要求比较严格末端的要求比较严格-互补粘性末端互补粘性末端)。两种两种DNADNA连接酶的比较连接酶的比较E.coliE.coli DNA ligaseDNA ligaseT T4 4-DNA ligase-DNA ligase来源来源来源来源大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体分子量分子量分子量分子量75,00075,00068,00068,000
6、辅助因子辅助因子辅助因子辅助因子NADNAD+ATPATP底物底物底物底物1.1.同源互补粘端同源互补粘端同源互补粘端同源互补粘端2.2.双链分子中的单双链分子中的单双链分子中的单双链分子中的单链缺口链缺口链缺口链缺口1.1.双链双链双链双链DNADNA分子的粘端、平端分子的粘端、平端分子的粘端、平端分子的粘端、平端 2.RNADNA2.RNADNA杂和体，杂和体，杂和体，杂和体，RNARNA链缺口链缺口链缺口链缺口3.3.双链双链双链双链DNADNA分子中的单链缺口分子中的单链缺口分子中的单链缺口分子中的单链缺口应用范围应用范围应用范围应用范围窄窄窄窄广泛、效率高广泛、效率高广泛、效率高广泛
7、、效率高三、三、DNADNA连接酶的反应体系连接酶的反应体系DNA酶的连接作用过程1、辅助因子ATP（或NAD+）提供的激活AMP，与连接酶形成共价结合的酶-AMP复合物（腺苷酰酶）；同时释放出焦磷酸（PPi）或烟酰胺单核苷酸NMN。2、激活的AMP转移到DNA一条链的5-末端磷酸基团上形成DNA-腺苷酸复合物。3、3-OH末端对活跃的磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键将缺口封起来，同时释放出AMP。酶酶AMP复合物复合物DNA 腺苷酸复合物腺苷酸复合物四、影响连接反应的因素四、影响连接反应的因素1 1、DNADNA浓度：浓度：浓度：浓度：插插插插入入入入片片片片段段段段：载载载载体体体体分分分
8、分子子子子的的的的摩摩摩摩尔尔尔尔比比比比=3=3：1 1较较较较好好好好，一一一一般般般般在在在在2-20 2-20 nmol/L nmol/L 2 2、反应时间与温度：、反应时间与温度：、反应时间与温度：、反应时间与温度：温度一般在温度一般在温度一般在温度一般在4-164-16间，常用间，常用间，常用间，常用1212-16-1630min-16h30min-16h 黏末端：黏末端：黏末端：黏末端：2020，30min30min；2020，60min60min（有氢键）（有氢键）（有氢键）（有氢键）平末端：平末端：平末端：平末端：可使用较高温度（无氢键）可使用较高温度（无氢键）可使用较高温度
9、（无氢键）可使用较高温度（无氢键）3 3、连接酶的用量：、连接酶的用量：、连接酶的用量：、连接酶的用量：粘末端：粘末端：粘末端：粘末端：0.1 U/g DNA0.1 U/g DNA 平末端：平末端：平末端：平末端：1-2 U/g DNA1-2 U/g DNA4 4、其其其其他他他他干干干干扰扰扰扰因因因因素素素素如如如如EDTAEDTA、杂杂杂杂蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质、存存存存留留留留有有有有活活活活性的酶等影响酶切的因素也影响连接效果。性的酶等影响酶切的因素也影响连接效果。性的酶等影响酶切的因素也影响连接效果。性的酶等影响酶切的因素也影响连接效果。5 5、ATPATP浓度：最适浓度：最适浓
10、度：最适浓度：最适0.5mmol-1mmol/L0.5mmol-1mmol/L四、影响连接反应的因素四、影响连接反应的因素第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase）DNADNA聚合酶指的是在聚合酶指的是在聚合酶指的是在聚合酶指的是在DNA(DNA(或或或或RNA)RNA)模板指导模板指导模板指导模板指导下，以下，以下，以下，以4 4种种种种dNTPdNTP为底物，在引物为底物，在引物为底物，在引物为底物，在引物3-OH3-OH末端聚合末端聚合末端聚合末端聚合DNADNA链的一类酶。链的一类酶。链的一类酶。链的一类酶。特点：特点：需模板需模板(DNA或或RNA)需有需有带带
11、3-OH末端的末端的引物引物 聚合方向聚合方向53 同同时时具有具有35和外切和外切53外切活性外切活性定定 义义目前已开目前已开发发的的DNA聚合聚合酶酶vDNA聚合酶聚合酶(全酶全酶)(E.coli)vKlenow片段片段(E.coli)vTDNA聚合酶聚合酶vTDNA聚合酶聚合酶vTaq DNA聚合酶聚合酶(耐热耐热)vDNA末端转移酶末端转移酶(小牛胸腺小牛胸腺)v反转录酶反转录酶(依赖依赖RNA)聚合酶聚合酶依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶不依赖不依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶1 1、DNADNA聚合
12、酶的分类聚合酶的分类 目前，从大肠杆菌中已分离出目前，从大肠杆菌中已分离出3 3种种DNADNA聚合酶，聚合酶，分别为：分别为：DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶：与与DNADNA复制有关复制有关主要参与主要参与DNA的修复的修复分子克隆中常用分子克隆中常用DNADNA聚合酶聚合酶2 2、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的性质的性质 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶是是KronbergKronberg等等19561956年发现年发现的第一个的第一个DNADNA聚合酶，故也称为聚合酶，故也称为KronbergKronberg酶。酶。5 3D
13、NA聚合酶活性聚合酶活性 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶(DNApol)发挥聚合酶活性发挥聚合酶活性需要需要:DNADNA模板、引物、模板、引物、dNTP和和Mg2+2+。2 2、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的性质的性质 3 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性 该活性识别单链，能将复制过程中该活性识别单链，能将复制过程中3 3端的错配碱端的错配碱基切除，从而保证基切除，从而保证DNADNA复制的高保真度，也称为校对复制的高保真度，也称为校对功能。功能。DNADNApolpol5 53 35 5 5 3核酸外切酶活性核酸外切酶活性2 2、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚
14、合酶的性质的性质535353535 3外切核酸酶活性的水解作用有外切核酸酶活性的水解作用有3 3个特征个特征：待切除的核酸分子必须具有待切除的核酸分子必须具有5 5端磷酸基团端磷酸基团。核苷酸分子被切除前位于已配对的核苷酸分子被切除前位于已配对的DNADNA双螺双螺 旋区段上。旋区段上。被切除的核苷酸既可以是被切除的核苷酸既可以是DNA也可以是也可以是RNA.3 3、大肠杆菌、大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的用途的用途 合成合成ds-cDNAds-cDNA第二链第二链 杂交探针的制备杂交探针的制备 DNADNA序列分析序列分析在在DNA聚合反应体系中，如果加入聚合反应体系中，如果加入放射性核
15、素标记放射性核素标记的的核苷酸核苷酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生基，产生带标记的带标记的DNA分子分子，这就是所谓的，这就是所谓的DNA分分子杂交探针子杂交探针。标记标记核酸探针（核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。结合的，带有标记的寡聚核酸分子。用用DNA聚合酶聚合酶I 制备探针制备探针已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断显示位置显示位置与互补的待测序列杂交与互补的待测序列杂交标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断探针的标记方式探针的标记方式标记
16、标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断5 3 杂交探针的制备过程杂交探针的制备过程3553355335533*553*DNAaseE.Coli DNA pol*dNTP切切刻刻平平移移反反应应原原理理切口转移法切口转移法(nick translation)通常所用的通常所用的Klenow片段是由片段是由枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶切割完整的切割完整的DNA聚合酶片段而成，或是经过克隆聚合酶片段而成，或是经过克隆产生的一条多肽链产生的一条多肽链(Mr=76 kDa)(Mr=76 kDa)。Klenow 片段片段 1、Klenow 片段
17、的由来片段的由来 Klenow 片段片段1 1、Klenow 片段的由来片段的由来E.coli DNA pol 蛋白酶蛋白酶较小片段较小片段较大片段较大片段(Klenow片段片段)5 33 5聚聚 外外合合 切切酶酶 酶酶活活 活活性性 性性性质性质5 3外切酶活性外切酶活性 Klenow 片段片段2、Klenow 片段的用途片段的用途l 填补由填补由DNADNA限制酶反应产生的限制酶反应产生的凹陷凹陷3 3末端末端。l DNA DNA分子的分子的末端标记末端标记。l 在在cDNAcDNA克隆出来后，克隆出来后，合成合成cDNAcDNA第二条链第二条链。l 用用SangerSanger双脱氧链
18、末端终止法进行双脱氧链末端终止法进行DNADNA序列分序列分 析等。析等。3端补平端补平5 5 klenow DNA 3末端标记末端标记补平限制性内切酶切后形成的补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端隐蔽端。在在3隐蔽端隐蔽端加上放射性标记的加上放射性标记的dNTP。klenow主要用途主要用途3隐蔽末端的隐蔽末端的DNA片断片断Klenow fragment补平补平根据末端的顺序选择根据末端的顺序选择一种一种 -32P-dNTPs末端标记的末端标记的DNA 限制性内切酶切限制性内切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-C
19、CTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h cDNA第二链的合成第二链的合成mRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow5 3 3 5 5 3 引物引物 T4 DNA聚合酶聚合酶1、T4 DNA聚合酶的性质聚合酶的性质T4 DNA聚合酶的外切酶活性聚合酶的外切酶活性比比Klenow片段片段高高1001000倍倍与与Klenow片段片段不同不同具有具有5 5 3 3聚合酶活性聚合酶活性具有具有3 3 5 5外切酶活性外切酶活性与与Klenow片段片段相同相同不
20、具有不具有5 5 3 3外切酶外切酶活性活性 T4 DNA聚合酶聚合酶2、T4 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途 填补或标记填补或标记由限制酶切割由限制酶切割DNADNA后产生的后产生的凹陷凹陷3 3末端末端，标记反应时需要高浓度的标记反应时需要高浓度的dNTP，以保证聚合反应，以保证聚合反应（填补）大于（填补）大于3 3 5 5核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。进行进行3 3突出末端的突出末端的DNADNA末端标记。末端标记。T4DNA聚合酶聚合酶2、T4 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途 标记用作杂交探针的标记用作杂交探针的DNADNA片段。片段。由由3 3 5 5核酸外切酶活性部分酶切双链核酸
21、外切酶活性部分酶切双链DNA，得到，得到凹缺凹缺3 3末端用末端用 32P dNTP填补（取代合成）。填补（取代合成）。将双链将双链DNADNA的末端转化成平头末端。的末端转化成平头末端。利用利用T4DNAT4DNA聚合酶的聚合酶的3 3 5 5核酸外切酶活性从双链核酸外切酶活性从双链DNADNA上切除突出上切除突出3 3末端，在高浓度末端，在高浓度dNTPdNTP中模板上双链中模板上双链区的降解与合成达到平衡。区的降解与合成达到平衡。5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶聚合酶无无dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶有有dNTPs5 5 酶切中间酶切中间产生两个产生两个末端标记末端
22、标记加入某种加入某种32P-dNTP和和dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶（35外切）外切）DNA酶切片断酶切片断T4 DNA聚合酶聚合酶（53聚合）聚合）5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 内切酶切内切酶切无无dNTPs T7 噬菌体噬菌体 DNA 聚合酶聚合酶来源：来源：T7噬菌体感染的噬菌体感染的E.coli结结构：构：由由2个蛋白个蛋白亚亚基基组组成：成：T7噬菌体基因噬菌体基因5编码编码的蛋白的蛋白和和宿主宿主细细胞的硫氧胞的硫氧还还蛋白蛋白活性：活性：53聚合，在所有聚合，在所有DNA聚合聚合酶酶中持中持续续反反应时间应时间最最长长，所以
23、合成的，所以合成的DNA链较长链较长，在在DNA测测序中有很大序中有很大优优越性；越性；35外切活性（由外切活性（由 T噬菌体基因噬菌体基因5编编码码，是，是Klenow酶酶的的 1000倍）倍）用用 途途 复制复制较长较长的模板，在的模板，在测测序中可序中可读读出出较长较长的序列的序列55333355与与T TDNA polDNA pol一一样样，平，平齐齐粘性末端。粘性末端。定点突定点突变变中互中互补链补链的合成。的合成。用填用填补补或交或交换换反反应应快速快速进进行末端行末端标记标记。修饰的修饰的T7 DNA聚合酶聚合酶测序酶测序酶（Sequenase）测测序序酶酶是美国是美国 Unit
24、ed States Biochemical 公公司改造的司改造的 T7 噬菌体噬菌体 DNA 聚合聚合酶酶，切除了，切除了 99%以上的以上的 3-5外切活性。外切活性。改改进进的的Sequenase 2.0则则切除了所有的切除了所有的 3-5 外切活性，是用双脱氧外切活性，是用双脱氧链终链终止法止法对长对长片段片段进进行行测测序的理想用序的理想用酶酶。Taq DNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶最初是从聚合酶最初是从耐热细菌耐热细菌Thermusaqraticus中纯化而得，因此是一中纯化而得，因此是一种单亚基种单亚基耐热耐热的的依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶，现，现已广泛用于基因
25、工程的操作中。已广泛用于基因工程的操作中。1、来源、来源 Taq DNA聚合酶聚合酶u具有具有5 3聚合酶活性聚合酶活性u最适反应温度为最适反应温度为7580（据目的序列不（据目的序列不 同而不同）同而不同）uTaq DNA聚合酶在聚合酶在60时其聚合酶活性下降时其聚合酶活性下降2倍，在倍，在37时下降时下降10倍。倍。2、性质、性质 Taq DNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶主要用于聚合酶主要用于聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR），），在体外扩增特定的在体外扩增特定的DNA片段，片段，DNA或单链或单链cDNA都可作为起始模板。都可作为起始模板。但在使用中应注意：但在使用中应注意：
26、Taq DNA聚合酶需要聚合酶需要Mg2+。磷酸缓冲液抑制该酶活性，应避免使用。磷酸缓冲液抑制该酶活性，应避免使用。3、用途、用途 逆转录酶逆转录酶1、一般知识、一般知识 逆转录酶逆转录酶的特性与的特性与转录酶转录酶的活性完全的活性完全不同不同，实际上它是实际上它是DNA聚合酶聚合酶的一种，的一种，又称又称依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶、聚合酶、RNA指导的指导的DNA聚合酶、聚合酶、RNA肿肿瘤病毒的瘤病毒的DNA聚合酶。聚合酶。分子量约为分子量约为1616万，由分子万，由分子量分别为量分别为6.26.2万和万和9.59.5万的两个结构相关的亚单位万的两个结构相关的亚单位组成。组成。逆转
27、录酶逆转录酶2、来源、来源 逆转录酶最主要的逆转录酶最主要的来源来源是是鸟类成髓细胞性白血鸟类成髓细胞性白血病病毒病病毒（AMV）。）。3、特性、特性AMVAMV逆转录酶的活性首先表现为逆转录酶的活性首先表现为DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。模板模板既可以是既可以是DNADNA，也可以是，也可以是RNARNA，在以，在以RNARNA为为模板是模板是称为称为RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性，而以，而以DNADNA为为模板是则模板是则叫做叫做DNADNA为指导的为指导的DNADNA聚合酶。聚合酶。.逆转录酶逆转录酶3、特性、特性 AMV逆转录酶的活性逆转录酶的活性其
28、次其次表现为表现为RNaseH活性活性。此酶可以特异性此酶可以特异性降解降解RNA-DNA杂种双链中的杂种双链中的RNA部分。部分。另外，还具有另外，还具有DNA内切酶活性内切酶活性和和核酸结合活性。核酸结合活性。逆转录酶逆转录酶4、用途、用途 逆转录酶逆转录酶在基因工程中可用于在基因工程中可用于cDNA的合成的合成。即可将任何真核基因的即可将任何真核基因的mRNA经经反转录反转录形成形成cDNA拷贝拷贝，然后构建，然后构建克隆克隆，大量，大量扩增扩增，并，并表达表达这种基因，这种基因，从而为真核基因的研究与其核遗传工程提供了一项从而为真核基因的研究与其核遗传工程提供了一项必不可少的手段。必不
29、可少的手段。1、性质、性质 来源于小牛胸腺。来源于小牛胸腺。催化催化脱氧核苷酸脱氧核苷酸添加到添加到DNA分分子的子的3 3-OH-OH末端末端。这与这与DNADNA聚合酶通过聚合酶通过5 5 3聚合聚合5-脱氧核苷三磷酸脱氧核苷三磷酸合成一条合成一条DNA链过程相似。所链过程相似。所不同不同的是末端转移酶的是末端转移酶不需要不需要模板模板。末端转移酶末端转移酶2、用途、用途进行进行DNA 3DNA 3-OH末端标记。末端标记。标记物可以是标记物可以是放射性放射性的，如的，如-32P-dNTP,也可以也可以是是非放射性非放射性的的,如如生物素生物素-11-dUTP,它们可用于它们可用于DNA序
30、列序列分析分析、DNase足迹分析足迹分析、分子杂交等实验中分子杂交等实验中。2、用途、用途 进行同聚物接尾：进行同聚物接尾：主要是给主要是给载体载体和和外源外源DNADNA分别加上分别加上互补互补的同聚物尾巴，以便二者在的同聚物尾巴，以便二者在体外体外连接。连接。用末端转移酶给用末端转移酶给一群一群DNA分子分子3-OH末端接上末端接上oligo（dA）或或（dG），给，给另一群另一群DNA分子分子3-OH末端末端接上接上oligo（dT）或或（dC），混合，混合这两群分子，就能使这两群分子，就能使末端转移酶接上的同聚物尾部末端转移酶接上的同聚物尾部退火退火形成形成环状分子环状分子。这。这种
31、方法称为种方法称为同聚物接尾法。同聚物接尾法。第四节第四节 核酸酶核酸酶 核酸酶核酸酶 核酸酶是一类能降解核酸的水解酶，它在基因工核酸酶是一类能降解核酸的水解酶，它在基因工程操作中应用非常广泛。根据核酸酶对底物作用的程操作中应用非常广泛。根据核酸酶对底物作用的专一性，可将其分为三类：专一性，可将其分为三类：l 核糖核酸酶（核糖核酸酶（RNase）：）：只作用于只作用于RNA。l 脱氧核糖核酸酶（脱氧核糖核酸酶（DNase）：）：只作用于只作用于DNA。l 核酸酶（核酸酶（nuclease）：）：既作用于既作用于DNA，又，又 作用于作用于RNA。ds-DNA结构结构:切口切口,缺口缺口,断口断
32、口缺口缺口(gap)切口切口(nick)断口断口(cut)3HO P53HO P5一、核酸外切酶一、核酸外切酶 exo是一种促加工的是一种促加工的单链核酸外切酶单链核酸外切酶，它能够从，它能够从5 5末端末端或或3 3末端末端降解降解DNADNA分子，产生出寡核苷酸短片段，分子，产生出寡核苷酸短片段，且不需要且不需要MgMg2+2+的参与。的参与。（一）（一）核酸外切酶核酸外切酶（exo）（二）核酸外切酶（二）核酸外切酶（exo ）该酶可以从该酶可以从双链双链DNA的的3 3-OH-OH末端末端起逐一切去起逐一切去5 5单单核酸核酸，其作用底物为含切口或缺口的，其作用底物为含切口或缺口的线性双
33、链线性双链DNADNA和和开环开环DNADNA。作用后在双链。作用后在双链DNA上形成一条长的上形成一条长的单链区单链区，这种外切酶这种外切酶不能不能降解降解单链单链DNA和带和带突出突出3 3末端的双末端的双链链DNA。（二）核酸外切酶（二）核酸外切酶（exo ）（三）（三）核酸外切酶（核酸外切酶（exo）53外切。外切。主要用途：主要用途：使使DNA双链变成单链、进行序列分析；双链变成单链、进行序列分析；除除去去5-端突起，产生端突起，产生3-端突起，便于加尾端突起，便于加尾5 P-P 5 5 5 exo 成为测序模板成为测序模板识别识别5-P（但不能降解（但不能降解5-OH）（四）（四）
34、T7基因基因6核酸外切酶核酸外切酶 53外切。外切。用途与用途与 exo一样。一样。既能识别既能识别5-P，又能识别，又能识别5-OH。5 5 5 5 已被克隆到大肠杆菌中表达。已被克隆到大肠杆菌中表达。（一）核酸酶（一）核酸酶S1 核酸酶核酸酶S1S1是从米粉状曲菌（是从米粉状曲菌（Aspergillus Aspergillus oryzaeoryzae）提取带的一种金属蛋白，分子量）提取带的一种金属蛋白，分子量32,00032,000，相对耐热，催化反应通常需要，相对耐热，催化反应通常需要Zn2+和酸性条和酸性条件，产生带件，产生带5 5磷酸的寡核苷酸磷酸的寡核苷酸。1、来源、来源二、核酸
35、内切酶二、核酸内切酶2、特性、特性 降解降解单链单链DNADNA或或RNARNA，包括双链分子中的单链区域，包括双链分子中的单链区域(如如发夹结构发夹结构)，这种单链区域甚至可以小到，这种单链区域甚至可以小到1 1个碱基个碱基对对的程度。的程度。降解单链降解单链DNADNA的速度比的速度比RNARNA的速度的速度快快1010倍倍。降解反应的方式为降解反应的方式为内切内切和和外切外切。降解反应的降解反应的最适最适pH为为4.04.04.54.5。酶量酶量过大过大时，伴有时，伴有双链双链核酸的降解，该酶的双链核酸的降解，该酶的双链降解活性仅为单链的降解活性仅为单链的1/75,0001/75,000
36、。核酸酶核酸酶S1的基本反应的基本反应：内切单链内切单链DNA或或RNA核酸酶核酸酶S1的基本反应的基本反应：内切带切刻或缺口的双链内切带切刻或缺口的双链DNA3、用途（在、用途（在DNA上定位上定位RNA）（二）（二）Bal 31核酸酶核酸酶1.来源来源埃氏交替单胞菌（埃氏交替单胞菌（Alteromonoas espejiana）2.功能功能既有既有单链单链特异的特异的DNA（RNA）内切酶活性；）内切酶活性；又有又有双链双链特异的特异的DNA外切酶活性。外切酶活性。降解双链降解双链DNA或其上的单链缺口、未配对的或其上的单链缺口、未配对的单链区域。单链区域。4.Bal314.Bal31的用
37、途的用途的用途的用途定位测定定位测定DNA片断中的限制酶位点分布。片断中的限制酶位点分布。3.反应条件反应条件需要需要Mg2+、Ca2+EGTA（乙二醇双四乙酸）专一性螯合（乙二醇双四乙酸）专一性螯合Ca2+，可终止反应，不影响，可终止反应，不影响Mg2+，也不影响也不影响限制限制性内切性内切酶酶活性。活性。EcoR IEcoR IBamH IHind IIIEcoR IEcoR IBamH IHind III分别用各个内切酶切后电泳，记录分别用各个内切酶切后电泳，记录片断数目和大小。片断数目和大小。EcoR IBamH IHind IIIMarker（三）（三）RNA酶酶A RNA酶酶A是一
38、种是一种RNA限制酶限制酶，专一性地作用于，专一性地作用于单单链链RNA的的3 3端嘧啶残基端嘧啶残基，切开其与邻近核苷酸相连的，切开其与邻近核苷酸相连的磷脂键磷脂键。产物为带。产物为带3 3-P的的嘧啶嘧啶和和末端为末端为3-P嘧啶嘧啶的寡的寡核苷酸。核苷酸。从从DNA-RNADNA-RNA中切除未杂交的中切除未杂交的RNARNA区；区；图谱分析图谱分析DNADNA或或RNARNA上单碱基突变体；上单碱基突变体；确定确定RNARNA序列中胞嘧啶的位置进行序列中胞嘧啶的位置进行RNARNA测序。测序。用用途途（四）（四）RNA酶酶H 该酶也为该酶也为RNARNA限制酶，可水解限制酶，可水解RN
39、A-DNARNA-DNA杂交杂交分子中的分子中的RNARNA链，产生链，产生5 5-P-P核苷酸。核苷酸。cDNAcDNA第一条链合成的过程中除去第一条链合成的过程中除去RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链或进行第二条链合成前切割链或进行第二条链合成前切割RNARNA引物引物.检测检测RNA-DNARNA-DNA杂合体；杂合体；通过与寡聚通过与寡聚dTdT杂交，从杂交，从mRNAmRNA中除去多聚中除去多聚A A序列序列.特异性地切割与寡脱氧核苷酸结合的特异性地切割与寡脱氧核苷酸结合的RNARNA。用用途途（五）（五）RNA酶酶T RNA RNA酶酶T T是一种是一种RNARNA限制酶，特异性地作用于限制酶，特异性地作用于鸟嘌鸟嘌呤核苷酸的呤核苷酸的3 3磷酸基团磷酸基团，切割与其邻近核苷酸相连的，切割与其邻近核苷酸相连的5 5磷酸键磷酸键，最终产物为，最终产物为3 3磷酸鸟嘌呤磷酸鸟嘌呤和和带带3 3磷酸鸟嘌呤末磷酸鸟嘌呤末端的寡核苷酸端的寡核苷酸。从从DNA-RNADNA-RNA杂合体上切除非杂交的杂合体上切除非杂交的RNARNA区；区；用于用于RNARNA序列分析和指纹图谱分析中。序列分析和指纹图谱分析中。用用途途