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1、植物花药培养及单倍体植株鉴定20学时安徽农业大学生命科学学院高俊山花药培养：是指将未成熟的花药接种是指将未成熟的花药接种在人工培养基上分化成为植株的过程。在人工培养基上分化成为植株的过程。属于器官培养。属于器官培养。供体植株供体植株小孢子小孢子（n）花培花培花粉植株花粉植株（n）雄核发育雄核发育自然加倍自然加倍人工加倍人工加倍纯合植株纯合植株DH（2n）一年内获得纯系一年内获得纯系常规育种需常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。一、实验目的与原理一、实验目的与原理原理原理：利用组织培养技术对利用组织培养技术对植物花药进行离体植物花药进行离体培养，诱
2、导产生再生植株。通过形态观察培养，诱导产生再生植株。通过形态观察和染色体分析鉴定单倍体植株，作为新的和染色体分析鉴定单倍体植株，作为新的遗传资源和选择材料。遗传资源和选择材料。目的：目的：u掌握植物花药离体培养技术；掌握植物花药离体培养技术；u掌握单倍体植株鉴定的方法；掌握单倍体植株鉴定的方法；u了解单倍体育种的意义。了解单倍体育种的意义。花药培养基本流程：花药培养基本流程：预处理花药（物理或生理逆境）预处理花药（物理或生理逆境）收集具有胚性小孢子的花药收集具有胚性小孢子的花药培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固
3、化培养基上胚状体转移至固化培养基上”萌发萌发”形成小植株形成小植株选择合适的供体植株选择合适的供体植株单倍体植株鉴定单倍体植株鉴定二、实验内容二、实验内容1 1、镜检花粉发育时期、镜检花粉发育时期2 2、花药离体培养、花药离体培养 2.1 2.1 取样取样 2.2 2.2 消毒消毒 2.3 2.3 接种接种 2.4 2.4 培养培养3 3、单倍体植株的鉴定、单倍体植株的鉴定三、实验器材三、实验器材材料：烟草花药。材料：烟草花药。试剂：试剂：MSMS培养基、培养基、N6N6培养基、培养基、B5B5培养基、培养基、酒精、酒精、2,4-D2,4-D、NAANAA、KTKT、蔗糖、醋酸洋红、蔗糖、醋酸
4、洋红、蒸馏水。蒸馏水。仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普仪器：电子天平、磁力加热搅拌器、普通光学显微镜、微波炉、通光学显微镜、微波炉、pHpH计、培养箱、计、培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、超净工作台、高压灭菌锅、镊子、剪刀、解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、解剖针、烧杯、试剂瓶、三角瓶、封口膜、橡皮筋、低温冰箱。橡皮筋、低温冰箱。四、实验步骤四、实验步骤1.1.适期花药的选择适期花药的选择 花药中的花粉是由生殖细胞花药中的花粉是由生殖细胞（体细胞）经过减数分裂而来，（体细胞）经过减数分裂而来，其染色体只是体细胞中的一半，其染色体只是体细胞中的一半，如果通过一定的途径将花粉培如
5、果通过一定的途径将花粉培养成植株，获得单倍体植株。养成植株，获得单倍体植株。再经过染色体加倍，得到纯合再经过染色体加倍，得到纯合的二倍体，大大缩短育种进程。的二倍体，大大缩短育种进程。一般而言，单核期（第一次有丝一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。最佳培养期。形成双核后，在合适的条件下，形成双核后，在合适的条件下，主要由营养细胞分裂产生胚状体。主要由营养细胞分裂产生胚状体。花粉发育时期：花粉发育时期：被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（小孢子期）、被子植物的花粉发育可分为四分体期、单核期（小孢子期）、二核期和三核期（雄配子期）二
6、核期和三核期（雄配子期）4 4个时期。个时期。四分体时期四分体时期单核靠边期单核靠边期花药切片显微观察花药切片显微观察花粉的发育花粉的发育 营养细胞营养细胞生殖细胞生殖细胞精子精子四分体四分体:醋酸洋红染色醋酸洋红染色四分体四分体:Alexanders 染色染色单核期单核期双核期双核期成熟花粉粒成熟花粉粒烟草花粉发育时期的检测：烟草花粉发育时期的检测：一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加一般将植物的花药置于载玻片上压碎，加1-21-2滴滴1%1%醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育时期。醋酸洋红染色，再进行镜检，以确定花粉发育时期。单核晚期单核晚期液泡液泡第一次有丝分裂后期第一次有丝分裂后
7、期双核早期双核早期双核中期双核中期生殖核生殖核生殖核生殖核营养核营养核处于不同发育阶段的烟草花芽处于不同发育阶段的烟草花芽 烟草花粉发育时期的确定烟草花粉培养，选择单核靠边期的花药，培养效果最好。烟草花粉培养，选择单核靠边期的花药，培养效果最好。从烟草花的外部形态变化来看，从烟草花的外部形态变化来看，当花蕾的花冠长度与花萼的长当花蕾的花冠长度与花萼的长度相等度相等时，花药里面的多数花时，花药里面的多数花粉粒正处于单核靠边的阶段。粉粒正处于单核靠边的阶段。不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期发育时期物种物种减数分裂期减数分裂期草莓、番茄草莓、番
8、茄四分孢子期四分孢子期葡萄葡萄单核早中期单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期单核早期至晚期烟草烟草单核早期至双核期单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核期四分孢子期至双核期玉米玉米2.2.花药离体培养花药离体培养（1 1）取材）取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。（考虑供体植物基因型、生理状态）宜的花蕾。（考虑供体植物基因型、生理状态）（2 2）消毒）消毒 70酒精擦洗花蕾表面，酒精擦洗花蕾表面，70酒精浸
9、泡酒精浸泡15-30s后，在后，在1次氯酸钠溶液中浸泡次氯酸钠溶液中浸泡8-10min或在或在0.1的的氯化汞溶液中消毒氯化汞溶液中消毒8-10min，无菌水冲洗，无菌水冲洗3-5次。次。（3 3）接种）接种 剥去萼片和花瓣，将花药取出。去除花丝，剥去萼片和花瓣，将花药取出。去除花丝，但不应使花药受到损伤。但不应使花药受到损伤。（4 4）培养）培养 先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。；后转入分化培养基培养，形成小植株。花药培
10、养过程取花蕾（镜检）取花蕾（镜检）预预处理处理取花药取花药消毒消毒接种接种培养培养愈伤组织发生愈伤组织发生 预处理预处理 预处理是小孢子培养成功的前提条件。预处理是小孢子培养成功的前提条件。预处理目的：预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。能使绿苗产量大量增加。预处理方法：预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、
11、高温、化学物质、离心、射线等。包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。烟草花药培养，烟草花药培养，44低温低温预处理预处理2-32-3天。天。培养基培养基 主要为主要为MS、H、N6、B5和和Nitsch培养基，在此培养基，在此基础上发展出一些其它的培养基。基础上发展出一些其它的培养基。H H培养基（基本成分培养基（基本成分+6-6-BA/KT2mg/L+NAA/2,4-D 2mg/L+NAA/2,4-D 0.2mg/L0.2mg/L+30g/L+30g/L蔗糖蔗糖+7g/L+7g/L琼脂琼脂+1g/L+1g/L活性炭，活性炭，pHpH值）值）上诱导愈伤组织；愈伤组织形成后转移到上诱导愈伤组织
12、；愈伤组织形成后转移到H H培养基（培养基（基基本成分本成分+NAA 2mg/L+6-NAA 2mg/L+6-BA 0.2mg/L 0.2mg/L+20g/L+20g/L蔗糖蔗糖+7g/L+7g/L琼脂）上分化成苗。琼脂）上分化成苗。1/2 MS 1/2 MS培养基培养基+激素激素+蔗糖蔗糖+琼脂琼脂+活性炭活性炭高浓度的高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。显著抑制花粉愈伤组织形成。铁盐铁盐对花粉胚状体发育很重要。对花粉胚状体发育很重要。活性炭活性炭促进胚状体发育。促进胚状体发育。较高浓度蔗糖较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织；可诱导花粉形成愈伤组织；较低浓度蔗糖较低浓度蔗糖可使愈伤组织
13、分化成苗。可使愈伤组织分化成苗。细胞分裂素细胞分裂素可促进胚状体形成；可促进胚状体形成；生长素生长素可诱导愈伤组织形成。可诱导愈伤组织形成。细胞分裂素与生长素比值高细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗。时可诱导愈伤组织分化苗。氨基酸氨基酸有机附加物有机附加物类别化合物培养基浓度(mg/L)母液扩大倍数500mL母 液中药品量(g)每升培养基取母液的量(ml)大量元素KNO395020倍9.550NH4NO37207.2MgSO47H2O1851.85CaCl22H2O1661.66KH2PO4680.68微量元素MnSO44H2O25200倍2.55ZnSO47H2O101.0H3B
14、O3101.0Na2MoO42H2O0.250.025CuSO45H2O0.0250.0025铁盐Na2EDTA37.3200倍3.735FeSO47H2O27.82.78有机物盐酸硫胺素(B1)0.5200倍0.055盐酸吡哆素(B6)0.50.05甘氨酸20.2叶酸0.50.05烟酸50.5生物素(维生素H)0.050.005肌醇10010H培养基的配制培养基的配制类别化合物培养基浓度(mg/L)母液扩大倍数500mL母 液中药品量(g)每升培养基取母液的量(ml)大量元素KNO3190020倍1950NH4NO3165016.5MgSO47H2O3703.7CaCl22H2O4404.4
15、KH2PO41701.7微量元素MnSO44H2O22.3200倍2.235ZnSO47H2O8.60.86H3BO36.20.62KI0.830.083Na2MoO42H2O0.250.025CuSO45H2O0.0250.0025CoCl2.6H2O0.0250.0025铁盐Na2EDTA37.3200倍3.735FeSO47H2O27.82.78有机物盐酸硫胺素(B1)0.4200倍0.045盐酸吡哆素(B6)0.50.05甘氨酸20.2烟酸0.50.05肌醇10010MS培养基的配制培养基的配制激素激素名称名称浓浓度度（mg/mL）100mL母液中母液中药药品量（品量（g）配方配方NA
16、A101先少量先少量95%乙醇乙醇或或1 1当量的当量的NaOHNaOH溶溶解解，后加水定容后加水定容6-BA10 1先少量先少量浓浓HCl或或1 1当量的当量的盐酸酸溶溶解解，后加水定容后加水定容2,4-D101先少量先少量95%95%乙醇或乙醇或1 1当量的当量的NaOHNaOH溶解，溶解，后加水定容后加水定容KT101先少量先少量浓浓HClHCl或或1 1当量的当量的盐酸酸溶解，溶解，后加水定容后加水定容 培养条件培养条件 1 1、温度、温度 适宜温度是适宜温度是2528，一般不应低于，一般不应低于25。2 2、光照、光照 每天每天 1212小时光照小时光照,光强为光强为 1800-20
17、00lx1800-2000lx。3 3、接种密度、接种密度 每瓶接种花药多少，应根据三角瓶的大小来决定。每瓶接种花药多少，应根据三角瓶的大小来决定。50mL三角瓶一般接种三角瓶一般接种10个花药。个花药。1 1、胚状体发育途径、胚状体发育途径 小小孢孢子子经经历历胚胚发发生生的的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。2 2、愈愈伤伤组组织织发发育育途途径径 小小孢孢子子分分裂裂数数次次形形成成愈愈伤伤，再再分分化化形形成成花花粉粉植植株株。此此途途径径产产生生的的植株会出现变异且倍性复杂。植株会出现变异且倍性复杂。花粉植株形态发生方式花粉植株形态发生方式单
18、倍体植株的发育方式单倍体植株的发育方式胚状体发育途径部分花药通过部分花药通过胚状体途径形胚状体途径形成小植株。成小植株。烟草花药培养A：从裂开的花药中长出胚状体;B、C：从药室中直接长出的幼苗;D、E：具有根、茎、叶的小苗;F：小苗发达的根系愈伤组织发育途径部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药水稻花药培养愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株 白化苗现象白化苗现象（一）白化苗产生的影响因素及机理（一）白化苗产生的影响因素及机理1 1、内因、内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。花粉发育时期。2 2、外因、外因 预处
19、理、培养基成分、激素水平与种类、培养预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3 3、机理、机理 核基因起关键作用，导致质体核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生缺失，产生白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。（二）白化苗的控制（二）白化苗的控制 通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。调控。3.3.单倍体植株的鉴定单倍体植株的鉴定 通过花药培养获得的再生植株的染色体数目也常发通过花药培养获得的再生植株的染色体数目也常
20、发生变异，其后代常是混倍体，所以必须对其后代进行鉴生变异，其后代常是混倍体，所以必须对其后代进行鉴定。定。鉴定方法既可以根据形态特征进行间接鉴定，也可鉴定方法既可以根据形态特征进行间接鉴定，也可以镜检体细胞中的染色体数或花粉母细胞中染色体数以以镜检体细胞中的染色体数或花粉母细胞中染色体数以及染色体配对的情况进行直接鉴定。此外还可以根据花及染色体配对的情况进行直接鉴定。此外还可以根据花粉的育性或利用遗传标记性状进行鉴定。粉的育性或利用遗传标记性状进行鉴定。（1 1）染色体直接计数法）染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织用醋酸洋红染色进行通常取根尖、茎尖等分生组织用醋酸洋红染色进行制片，直
21、接计数染色体数目。制片，直接计数染色体数目。（2 2）间接鉴定）间接鉴定（1 1）植株形态学鉴定法）植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。花小柱头长，花粉粒小，不结实。（2 2）细胞形态学鉴定法）细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。性具有高度的相关性。（3 3）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）主要测主要测定叶片单个细胞中定叶片单个细胞中DNADNA的含量确定细胞
22、的倍性。的含量确定细胞的倍性。（4 4）杂交鉴定法）杂交鉴定法 自交或测交鉴定自交或测交鉴定 根据后代分离情根据后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。（5 5）分子标记鉴定）分子标记鉴定 包括生化标记（如同工酶标记）包括生化标记（如同工酶标记）和分子标记（如和分子标记（如RFLPRFLP、RAPDRAPD、AFLPAFLP等）。等）。醋酸洋红染色法观察植物根尖细胞染色体醋酸洋红染色法观察植物根尖细胞染色体 实验步骤：实验步骤：1 1、取材、取材：烟草根尖。：烟草根尖。2 2、预处理、预处理：冷冻处理。：冷冻处理。根尖置于冰水浴中，放到根尖置于
23、冰水浴中，放到4 4的冰箱中处理的冰箱中处理2424小时。小时。3 3、固定、固定 冲洗干净处理的材料，卡诺氏液（冰乙酸：无水乙醇冲洗干净处理的材料，卡诺氏液（冰乙酸：无水乙醇=1=1：3 3或冰乙酸：氯仿：无水乙醇或冰乙酸：氯仿：无水乙醇=1=1；3 3：6 6）固定）固定24h24h。4 4、解离、解离 取出取出4-54-5条根置于表面皿中，用条根置于表面皿中，用蒸馏蒸馏水冲洗水冲洗3-43-4次，加入数滴次，加入数滴1N1N盐酸于表面皿中，在酒精灯上间歇式加热盐酸于表面皿中，在酒精灯上间歇式加热2-42-4分钟。分钟。5 5、染色、染色 加几滴醋酸洋红于表面皿内，在灯上加热。取一根已染过
24、色加几滴醋酸洋红于表面皿内，在灯上加热。取一根已染过色的根放在载玻片上，加一滴的根放在载玻片上，加一滴1%1%醋酸洋红溶液，盖上盖玻片轻敲醋酸洋红溶液，盖上盖玻片轻敲盖玻片，使根尖压成一薄层。盖玻片，使根尖压成一薄层。6 6、镜检、镜检 先在先在1010倍下找到分裂相后，再换倍下找到分裂相后，再换4040倍观察。倍观察。四、注意事项四、注意事项1.1.提高诱导效率。提高诱导效率。2.2.降低白化苗的发生频率。降低白化苗的发生频率。五、作业与思考题五、作业与思考题1.1.花药培养的一般程序；花药培养的一般程序；附培养结果（照片）附培养结果（照片）2.2.影响花药培养的因素；影响花药培养的因素；诱
25、导率诱导率/%=(/%=(愈伤组织数愈伤组织数/接种花药数接种花药数)100)100出苗率出苗率/%=(/%=(花药出苗数花药出苗数/接种花药数接种花药数)100)1003.3.单倍体植株的鉴定方法；单倍体植株的鉴定方法；4.4.单倍体育种的意义和不足之处。单倍体育种的意义和不足之处。胚状体形成：胚状体形成：MSMS培养基（培养基（1/21/2大量元素大量元素+基本成分）基本成分）+NAA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+6-6-BA2mg/L 2mg/L+30g/L+30g/L蔗糖蔗糖+7g/L+7g/L琼脂琼脂+1g/L+1g/L活性炭，活性炭，pHpH值）值）分化成苗：分化成苗：
26、MSMS培养基（培养基（1/21/2大量元素大量元素+基本成分）基本成分）+NAA 2mg/L+NAA 2mg/L+6-6-BA0.2mg/L 0.2mg/L+20g/L+20g/L蔗糖蔗糖+7g/L+7g/L琼脂，琼脂，pHpH值值5.5-5.5-5.8 5.8）胚状体形成：胚状体形成：H H培养基（基本成分）培养基（基本成分）+NAA 0.2mg/L+6-+NAA 0.2mg/L+6-BA2mg/L 2mg/L+30g/L+30g/L蔗糖蔗糖+7g/L+7g/L琼脂琼脂+1g/L+1g/L活性炭，活性炭，pHpH值）值）分化成苗：分化成苗：H H培养基（培养基（1/21/2大量元素大量元素+基本成分）基本成分）+NAA 2mg/L+NAA 2mg/L+6-6-BA0.2mg/L 0.2mg/L+20g/L+20g/L蔗糖蔗糖+7g/L+7g/L琼脂，琼脂，pHpH值值5.5-5.5-5.8 5.8）