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1、 细菌内毒素定量检查法的发展概况及方法简介单亚(安徽省蚌埠市药品检验所,安徽蚌埠 233000摘要:简要介绍细菌内毒素定量检查法的发展情况,概述了几种定量测定法的原理和适用范围及特点,着重介绍了动态浊度法在做干扰试验时,呈现出凝胶半定量法无可比拟的快速、大范围浓度定量的优势,预示着在国内医药界,一个鲎试验法全面替代家兔法检查热原的时代即将到来。关键词:细菌内毒素;定量检查法;干扰试验细菌内毒素定量检查法是在凝胶法的基础上建立发展起来的。由于凝胶法是根据形成凝胶的有无及硬度作为判断标准,所以人为的主观判断误差很大,而且只能在0.03E U/m l 以上进行半定量。细菌内毒素的定量分析开始于 60
2、 年代中期,当时人们采用分光光度法定量检测凝胶反应过程中的浊度变化情况,从而建立了细菌内毒素定量分析的比浊法(Tur-b i dine tric A ssay。到了 70 年代中期,随着鲎试验法研究的不断深入及分析手段技术的进步,各种新的定量分析方法不断被开发出来。1977 年日本学者岩永贞昭等在 TA L 试剂中,添加凝固酶的模拟底物,从而开发了更加灵敏的合成基质显色法(比色法1。到了 90 年代之后,由于各种分析技术的交融,尤其是电子计算机的普及应用,有关细菌内毒素定量方法的开发更是突飞猛进。1 细菌内毒素定量检查法简介目前,国内外广泛应用且检测技术比较成熟的细菌内毒素定量检查法主要有以下
3、四种。1.1 凝胶法是目前最常用的细菌内毒素检查法。即在 10 mm75mm 的小试管内,加入待检样品和鲎试剂各 0.1m l 混合,37e、60m i n 保温反应后,180b 倒转,根据凝胶形成的情况(凝胶是否坚实作为判定指标的一种半定量法。此法操作简单,经济而且不需要专用仪器。凝胶法既可限量检测内毒素,也可在 0.03EU#m l-1 以上进行半 定量测定。1.2 显色基质法(合成基质法、显色合成基质法,Ch ro m oge-n ic T echn ique 系根据细菌内毒素与 LA L(或 TA L 试剂中的 C 系反应所激活的凝固酶,使用人工合成的鲎三肽(即与 PNA 相连的显色基
4、质如 BOC-LEU-GLY-ARG-PNA 等作为显色基质,水解鲎三肽中的精氨酸肽链,通过测量反应液中释放出游离的对硝基苯胺(PNA 的吸光值而进行定量的一种检测方法。该法需要专用仪器。目前主要用于微量血浆、血清、全血、骨髓液及尿、乳汁等的临床检验以及家禽、实验动物、人工脏器的安全性评估等方面。根据测定原理的不同分为终点显色法和动态显色法。1.2.1 终点显色法(Endopoint Co l or i m etr i c A ssay 系根据在一定时间内游离出的 PNA 的量与细菌内毒素浓度成正比例关系进行测定的一种分析方法。PNA(黄色的吸光度值可使用单波长 405n m 或双波长(测定波
5、长 405nm、参照波长 492n m 测量,或利用游离的 PNA 与红色偶氮试剂发生反应所形成的红色偶氮蓝复合物在 545nm 单波长或双波长(测定波长 545n m、参照波长 630n m 进行检测。一般可在0.006 15EU/m l 范围内进行定量。1.2.2 动态显色法(K i ne ti c Co l o ri m etric A ssay 系根据游离的 PNA 的吸光度变化率(mA bs/m i n 与细菌内毒素浓度成正比例关系(比色反应速度法 Pa te A ssay或到达事先设定的反应吸光度变化值所需要的时间 T a 的对数值与细菌内毒素浓度的对数值成反比例关系(比色反应时间
6、法 OD-T i m e A s-say 进行测定的一种分析方法。一般可在 0.00650EU/m l 范围内进行定量。1.3 酶联免疫测定法(EL ISA 法基于抗原抗体的酶联免疫测定法,目前在国外应用十分普遍。主要由外加热原质刺激巨嗜细胞后产生的内热原物质(如 TN F,T L-1等,而进行的定量测定方法。体外人全血热原检测方法是近年来国内外6S chw ab I R,L i nb erg J V,G i o i a V M,et a.l Foreshorten i ng of the i nfer-ior con j unctival forn i x as soci ated w i
7、th ch ron i c gl au co m a m ed icati onsJ.Oph t hal mo l ogy,2006,113:197-202.7Bandou i n C,Pisell a P J,Fill aci erK,et a.l O cular surface i n fla mm at o- ry changes i nduced by top ical anti glauco m a drugs:hum an and an-i m al st udiesJ.Oph t h al m ol ogy,1999,106:556-63.8Baudou i n C,G arch
8、er C,H aouatN,et a.l Exp ressi on of i n fl amm at orym e m b rane m ark ers by con j un cti va l cells i n chron i call y treated p a-ti en tsw i th gl auco m aJ.Oph t hal m ology,1994,101:454-601 9H arrison SA,M ondinoBJ,Kagan J M.M odu l ati on ofHLA anti gen ex-pressi on on con j uncti val fi br
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13、 on f o-llo w i ng ch ron ic app licati on of an ti glauco m atou s d rugsJ.G raef eA rc h C li n E xp Ophthal m o,l2002,240:929-35.(收稿日期:2007-12-09#361#安徽医药 A nhuiM edical and Phar m aceutical J ournal2008A pr;12(4正在兴起的一种研究热原检测的新方法,具有检测范围广,灵敏度高,不同个体血液的结果差异小等优点2,3。国内一些学者,已采用酶联免疫测定法对体外人全血热原检测方法的可行性进行
14、研究和优化,取得了可喜的进展4。1.4 浊度法(T urbid i m etrc Techn ique 系微量的内毒素与 TAL(LA L 试剂中的 C因子发生反应,由内毒素引发激活的凝固酶,切断凝固蛋白特定位置的精氨酸肽键,形成凝固蛋白从而产生凝胶过程中的浊度变化,采用适当的光学仪器测量的一种分析 方法。此法操作比较简单、经济、灵敏度高,检测范围广。通常在 0.006300EU/m l的范围内进行定量,但需要专用仪器。根据测定原理的不同又可分为终点浊度法和动态浊度法。1.4.1 终点浊度法(Endop i nt Turbi d i m etr ic T echn i que 即根据到达规定点
15、上反应液的最终浊度值(吸光度或透过光亮值与细菌内毒素浓度成正比例或反比例的关系而进行测量的一种检测方法。由于未形成标准化,目前国内外都很少使用,也未见有专门仪器使用。1.4.2 动态浊度法(K i netic T urb i d i m e tric T echn i que 即根据测定到达事先设定反应液的浊度变化(吸光度变化值所需要的时间(T a 比浊反应法或浊度变化(透过光量比值所需要的时间(T g:比浊时间分析法的对数值与细菌内毒素浓度的对数值成反比例关系或浊度的(吸光度值每分钟变化(吸光度变化 mA bs/m i n 与细菌内毒素浓度成正比例关系(比浊反应速度法而进行测量的一种分析方法
16、。通常,浊度法一般是指动态浊度法,而且在日、美、欧等国有专用仪器,并通过美国 FDA 认可,其中作为动态比浊仪一般要求为:恒温槽(37?1e、光源、检测器及内置数据分析等。其中检测波长从 80660n m,主要根据仪器的不同而各异,检测时间为 6090m i n 之间。由于国内对细菌内毒素定量检查法的研究起步较晚,专门用于定量的高灵敏度TA L(最低检测限是 0.006EU/m l 还未研制开发出来,还受细菌内毒素检查用水(内毒素的含量小于 0.005E U/m l、内毒素标准品质量不高等因素的制约,对仪器定量法研究较多且检测技术较为成熟的就是动态浊度法。本法收载于 2000 年版 5 中国药
17、典6 二部附录中,在 2005 年版 5 中国药典 6 二部附录中,将浊度法和显色基质法修订为光度测定法,作为测定内毒素含量的方法。2 动态浊度法的适用范围和优点2.1 可以检测的样品常规输液药品;有干扰的药品;血液、脑脊液等液体;水及食品;任何其他需知道内毒素含量方面的药品和半成品。 2.2 定量测定的优越性通过反应曲线,直观显示鲎试剂的反应过程;通过反应曲线,考察样品中的干扰。快速、准确测到样品中的内毒素含量,有利于注射剂药品的生产过程质量控制;也可以测到病人体液中的内毒素含量,作为疾病诊断的依据。操作简单、可靠性高。2.3 动态浊度法和凝胶法的比较见表 1。从表 1 可看出,现在普遍使用
18、的凝胶半定量法在检测品种上有其局限性,尤其是做干扰试验,不但成本高又费时,效果也不理想。而动态浊度法在这方面却显示其独特的优越性。表 1 动态浊度法和凝胶法的特点比较项目动态浊度法(定量法凝胶法(半定量法结果判断方法直接测出内毒素的含量,与规定的限值(L 比较,用相应灵敏的鲎试剂(TAL 反应,不超过即为合格不发生凝胶即为合格试验反应速度使用光密度(OD 限值法一般可在 30m i n 内检测到 0.03EU/m l 以下规定 1h鲎试剂特性表示制作标准曲线描述鲎试剂(TAL 的检测能力,用灵敏度复核试验来标定鲎试剂灵敏度,检测结果与灵敏度(K 无关当 KL 时,鲎试剂(TAL 方能用于检测干
19、扰试验快速,具大范围定量的特性,大量的搜索实验,使干扰实验往往在一两次实验后完成,节约成本要耗费大量的时间和大量的试剂鲎试剂与供试品随仪器的不同而有所不同。如日本的 ET-201 加样比例为 1B1,美国的 0.1m l 鲎试剂(TAL 溶液,加 0.1m l 供试品加样量 LAL-5000 为 1B4,北京金山川的 EDS-96(98 为 1B1,天津的 BET-16(32 溶液,为 1:1 加样比较灵活,只要常规检测时加样量方法与标准曲线的做法相同即可 3 定量测定法的收载和应用,将加快热原检查法的品种改为细菌内毒素检查法的进展速度我国对细菌内毒素检查法的研究几乎与美国 FDA 批准使用的
20、时间同步,但扩大应用进展很慢。资料显示,目前 5 美国药典 6(U SP23 及 1 至 7 增补本采用细菌内毒素检查法的品种已达 620 余种;而 5 中国药典 61995 年版二部附录才首次收载了细菌内毒素检查法,正文中只有四种大输液和放射性药品采用了此法,总共不超过 12 个品种。5 中国药典 62000 年版二部对细菌内毒素检查法进行了修订,并收载了细菌内毒素定量测定法(浊度法和显色基质法;采用细菌内毒素检查法替代热原检查法的新增品种 40 多个,加上保留的 12 个品种,总共才 69 个品种,5 中国药典 62005 年版二部对细菌内毒素检查法又作了进一步修订,将细菌内毒素检查法的品
21、种数增至 136 个,即便如此,与 5 美国药典 6 相比,我国上药典的品种也实在太少,差异明显。将热原检查法的品种改为细菌内毒素检查法,首先要确定细菌内毒素的限值5,其次关键的问题就是做好干扰试验。现在,大量的实践证明,对供试品进行稀释是解决干扰的最好方法,因为 90%以上的干扰依赖于浓度,当供试品与细菌内毒素检查用水 1B40 稀释而可消除干扰,其它的问题采用稀释加上中和干扰因素的特殊处理方法即可解决6。而对一个新品种来说,究竟稀释到什么程度方可消除干扰,也就是说要稀释到多少倍,才能在一定条件下不干扰鲎试验,往往要做大量而重复的干扰试验来确定。因此干扰试验必须借助一个很好的方法才能容易完成
22、。定量测定法(浊度法在做干扰试验时,所呈现出的快速、大范围浓度定量的特性恰恰吻合了这一点,显示其独特的优越性。所以,内毒素定量测定法的收载和应用,必将加快热原检查法的品种改为细菌内毒素检查法的进展速度,投入成本高、试验周期长、因动物体质差异而引起试验结果重现性差的家兔法,将逐步会被细菌内毒素#362#安徽医药 A nhuiM edical and Phar m aceutical J ournal2008A pr;12(4 泌尿生殖道支原体感染的药物治疗葛兰(安徽蚌埠医学院第二附属医院药剂科,安徽蚌埠 233040关键词:泌尿生殖道;支原体感染;药物治疗支原体属柔膜体纲,是目前所知能独立生活,
23、自行繁殖的最小微生物,它缺少细胞壁,代之以三层结构的单位膜,具有多形性、可塑性、可滤过性、易溶解性及对青霉素等干扰细胞壁形成抗菌药物的天然抵抗性。从人体分离出的 16 种支原体中 5 种对人有致病性,即肺炎支原体(M p、解脲支原体(U u、人型支原体(M h、生殖支原体(M g 及发酵支原体(M f,其中 U u、M h、M g 等常经性接触及公用浴盆、毛巾等传播方式引起泌尿生殖道感染,U u 感染常见疾病为非淋菌性尿道炎(NGU,占非淋菌性尿道炎 60%,30%40%的 NGU 由 U u 所致,潜伏期 13 周1。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁,一般来讲,对作用于细胞壁生物合成的抗生
24、素,如 B-内酰胺类、万古霉素等完全不敏感,对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐药,对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗微生素药物是四环素类、大环内酯类及氟喹诺酮类。由于支原体存在于健康携带者中,多数患者的临床症状不明显,且症状较淋病轻,潜伏期较淋病长,各地区支原体检测条件的差异,以及抗生素的滥用与耐药性的普遍增高,导致临床上出现漏诊、误诊、治疗不及时、治疗不彻底等现象,给患者带来了极大的痛苦。现将治疗泌尿生殖道支原体感染的常用药物作一概述,为临床用药提供参考。1 四环素类药物四环素类抗生素主要抑制细菌蛋白质的合成,此类药物能与细菌核蛋白体的 30s亚基结合,从而抑制氨基酰-t R N
25、A 与起始复合物中核蛋白体的结合,使氨基酰-t RNA不能与 A 位结合,阻断蛋白质合成肽链延长。传统的四环素由于泌尿生殖道细菌广泛存在的 teM t 抗性因子,使其耐药率高,临床上治疗 NGU 已不再作为首选药物,目前被新型的半合成四环素类抗生素取代,代表性的药物主要有米诺环素和多西环素。 1.1 米诺环素(美满霉素,M inocycline 本品为高效、长效性的广谱抗生素,在四环素类抗生素中其抗菌作用最强,口服后迅速被吸收,食物对本品的吸收无明显影响,且脂溶性高,易渗透入许多组织和体液中,在胆汁和尿中的浓度比血药浓度高 1030 倍,本品排泄缓慢,半衰期为 11.122.1h,对 Ct、U
26、 u 有较好的抑制作用,是治疗 NGU 首选药物之一,主要不良反应有头晕、倦怠、恶心、呕吐、食欲不振等,加大或延长药物剂量可使血清氨基转移酶升高,加重肾功能不全者的肾损害,治疗期间应定期检查肝、肾功能,用药后应尽量避免日晒。王强2等对 32 例确诊为 NGU 的患者中,采用美满霉素每次 100m g,b i d,连用 10d,对衣原体治愈率为 68.2%,有效率为 90.9%;解脲支原体治愈率为 62.5%,有效率为 90.6%。傅志宜3等用盐酸米诺环素微丸型胶囊,每次 100m g,bid, 14d 为 1个疗程,治疗 61 例 NGU 患者,60 例患者完成了疗程,总有效率 88.3%,6
27、1 例头晕发生率为 9.8%,消化道症状发生率 4.9%,总计 18.3%。1.2 多西环素(强力霉素,Doxycyc line 为土霉素经 6A-位脱氧而成的一种半合成四环素类抗生素,抗菌活性较四环素为强,口服吸收完全(约 93%,易透过组织,分布较广,半衰期为 1220h,有 42%药物可自尿内回收,胃肠道反应较四环素为强,宜饭后服用。夏毓4等对 40 例 NGU 男性患者,口服多西环素每次 100m g,bi d,热淋清每次 2袋,ti d,连用 7d 治疗,总有效率 97.5%,疗效确切,不良反应发生率低。吴军5等对 112例 NGU 患者用盐酸多西环素 100mg,bid,餐后口服,
28、首剂加倍,连用 14d,结果 C t 感染中,男性治愈率 89.3%,女性治愈率 90.5%,总治愈率 89.8%,U u 感染中,男性治愈率70.0%,女性治愈率 69.7%,总治愈率 69.8%,112 例患者总治愈率 78.6%,不良反应 21例(18.75%,其中恶心 20 例,胃痛 1 例。2 大环内酯类药物大环内酯类抗生素的抗菌机制主要是与细菌核糖体的 50S 亚单位结合,从而抑制蛋白质的合成,属于生长期抑菌剂。由于 14 元环大环内酯药红霉素具有诱导耐药性,目前临床上已不作为治疗 NGU 首选药物。 2.1 阿奇霉素(Az ithro m yc i n 阿齐霉素为半合成的 15
29、元大环内酯类抗生素,系通过阻碍细菌转肽过程抑制细菌蛋白质的合成,口服后迅速吸收,生物利用度为 37%,在体内分布广泛,在各组织内浓度可达同期血浓度的 10100 倍,单剂给药后的半衰期为 3548h,药物作用时间长,不良反应低,服用方便,只需单剂量顿服或单剂量连续服用 37d,治疗 NGU 疗效确切,1995 年被 WHO 定为性病管理策略的首选药物。郑荣明6对 68 例 NGU 患者用阿奇霉素 1.5g,饭前 1h检查法所替代。但是,要赶上美国等发达国家的水平,我们还有一段艰辛的路要走。参考文献:1原田敏枝#森田隆司,岩永贞昭.添加显色底物的鲎试剂定量测定细菌内毒素的方法研究J.医用酵素,1
30、978,43:3.2Fenn ri ch S,F i scherM,H artung T,et a.l Det ecti on of endot oxi n s andot h er pyrogens u si ng hu m an wh ol e bloodJ.D ev B iol S tand,1999,101:131.3黄清泉.人全血热原实验细胞因子法研究进展J.国外医学#生物医学工程分册,2003,26(5:230.4黄清泉,刘文英.体外人全血热原检测方法的研究J.中国药学杂志,2004,39(5:372.5夏振民.药品细菌内毒素检查的限值J.药物分析杂志,1995,15(3:54.6黄清泉,夏振民.药品细菌内毒素检查实验设计J.中国药学杂志,1997,32(2:72. (收稿日期:2007-06-04#363#安徽医药 A nhuiM edical and Phar m aceutical J ournal2008A pr;12(4