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1、关于免疫组化讲课原关于免疫组化讲课原理及方法理及方法第一页，本课件共有73页免疫组织化学技术的原理及其方法免疫组织化学技术的原理及其方法一一.基本知识基本知识二二二二.基本原理基本原理基本原理基本原理三三.方法方法四四.结果的判断及异常着色原因分析和对策结果的判断及异常着色原因分析和对策第二页，本课件共有73页一、免疫组化技术的基本知识一、免疫组化技术的基本知识第三页，本课件共有73页一、一、免疫组化技术的基本知识免疫组化技术的基本知识n n免疫组化的基本概念 利用抗原-抗体特异性结合原理检测抗原或抗体一般是用抗体检测抗原n n抗原 两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白质具两个主要属性：免
2、疫原性及特异反应性，蛋白质具有抗原性有抗原性n n抗体 与抗原能特异性结合生物学结合是免疫球蛋白Ig第四页，本课件共有73页免疫球蛋白的化学结构及其模式图免疫球蛋白的化学结构及其模式图免疫球蛋白根据重链结构命名免疫球蛋白根据重链结构命名 IgG(),IgA()IgG(),IgA()，IgD(),IgD(),IgE(),IgM()IgE(),IgM()五种免疫球蛋白只有两种类五种免疫球蛋白只有两种类 型的轻连，即：型的轻连，即：Kappa()Kappa()和和和和Lambda()Lambda()每个抗体分子的轻链必须相同；某一单每个抗体分子的轻链必须相同；某一单独的抗体分子独的抗体分子 决不可能
3、既有决不可能既有 链又有链又有 链。这一点在免疫组化的淋巴瘤诊断链。这一点在免疫组化的淋巴瘤诊断中十分重要。中十分重要。第五页，本课件共有73页免疫球蛋白的化学结构及其模式图免疫球蛋白的化学结构及其模式图n nFc(Fragment crystalline)是免疫球蛋白的羧基端，意为结晶片是免疫球蛋白的羧基端，意为结晶片是免疫球蛋白的羧基端，意为结晶片是免疫球蛋白的羧基端，意为结晶片段，因其纯化时呈结晶状态而名之，段，因其纯化时呈结晶状态而名之，段，因其纯化时呈结晶状态而名之，段，因其纯化时呈结晶状态而名之，该片段与抗原特异性有关该片段与抗原特异性有关该片段与抗原特异性有关该片段与抗原特异性有
4、关 n nFab(Fragment antigen bingding)该端是抗体与抗原特异性结合的部该端是抗体与抗原特异性结合的部该端是抗体与抗原特异性结合的部该端是抗体与抗原特异性结合的部位，每分子位，每分子位，每分子位，每分子IgIg能结合能结合能结合能结合2 2个抗原分子个抗原分子个抗原分子个抗原分子 Fc c Fabab Ag g第六页，本课件共有73页多克隆抗体与单克隆抗体及其产生多克隆抗体与单克隆抗体及其产生n n多克隆抗体：多株多克隆抗体：多株B B细细胞针对多个抗原决定簇胞针对多个抗原决定簇产生的抗体产生的抗体n n单克隆抗体：针对某一单克隆抗体：针对某一抗原决定簇，由单株淋抗
5、原决定簇，由单株淋巴细胞（克隆）所产生巴细胞（克隆）所产生的抗体的抗体多克隆抗体多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体第七页，本课件共有73页多克隆抗体与单克隆抗体及其产生多克隆抗体与单克隆抗体及其产生n n多克隆抗体的产生n n以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断中，有利划归肿瘤的基本
6、类型。诊断中，有利划归肿瘤的基本类型。诊断中，有利划归肿瘤的基本类型。诊断中，有利划归肿瘤的基本类型。n n常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目录上常以录上常以录上常以录上常以RaHRaHRaHRaH（Rabbit against HumanRabbit against HumanRabbit against HumanRabbit against Human）表之。）表之。）表之。）表之。n n多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一多克隆抗体亦可产
7、生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用至关重要。至关重要。至关重要。至关重要。第八页，本课件共有73页多克隆抗体与单克隆抗体及其产生多克隆抗体与单克隆抗体及其产生 单克隆抗体的产生单克隆抗体的产生单克隆抗体的产生单克隆抗体的产生 应用细胞融合的杂交瘤技术应用细胞融合的杂交瘤技术（HybridizationHybridization），以针对单一
8、），以针对单一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨髓瘤细抗原决定簇的小鼠与小鼠骨髓瘤细胞（肿瘤性胞（肿瘤性B B细胞）融合形成杂交细胞）融合形成杂交瘤，其特点是既能产生特异性抗体，瘤，其特点是既能产生特异性抗体，又能在体外无限地增殖。将瘤细胞又能在体外无限地增殖。将瘤细胞在体外培养或注入小鼠腹腔内而获在体外培养或注入小鼠腹腔内而获单克隆抗体，由此产生的小鼠抗人单克隆抗体，由此产生的小鼠抗人（抗原）的抗体常以（抗原）的抗体常以MaHMaH表示，现表示，现在亦有兔的单克隆抗体在亦有兔的单克隆抗体第九页，本课件共有73页免免疫疫小小鼠鼠Mouse第十页，本课件共有73页n n抗原的制备：n n传统用蛋白提纯n
9、n近来可应用分子生物学技术：已知抗原的基因结构，用其合成多肽，作为抗原，如ER、PR抗原的制备n n现有兔的单抗第十一页，本课件共有73页n n多克隆抗体和多克隆抗体的选用n n单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂，价格更贵；在应用中不一定比多克隆抗体好。n n单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体则敏感性高，为何使用完全决定于使用的目的性第十二页，本课件共有73页n n市售抗体的种类n n某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如-胰蛋白酶n n有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检测。如Desmin来源于鸡的肌肉n n近年来,
10、市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔源性第十三页，本课件共有73页标记抗体标记抗体n n在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到n n标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，硷性磷酸酶，硷性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒n n标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性，从而使染色敏感性降低性，从而使染色敏感性降低第十四页，本课件共有73页酶酶 抗酶抗体复合物抗酶抗体复合物n n通过免疫反应而不是化学方法，将酶结合到抗体上，形成具酶活性的免疫复合物。如
11、PAP复合物（Peroxidase Peroxidase AntiPeroxidase AntiPeroxidase ComplexComplex），PAP复合物属非标记性，保护了酶的活性，比免疫荧光法敏感上千倍。第十五页，本课件共有73页亲和素亲和素生物素复合物生物素复合物（Avidin-Biotin Complex ABC）n n亲和素有四个生物素分子特异亲和素有四个生物素分子特异亲和素有四个生物素分子特异亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不性结合部位，其结合力强，不性结合部位，其结合力强，不性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或可逆，还可和辣根过氧化酶或可逆
12、，还可和辣根过氧化酶或可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合荧光素等结合荧光素等结合荧光素等结合n n亲和素亲和素亲和素亲和素-生物素复合物是一个三维生物素复合物是一个三维生物素复合物是一个三维生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中空间的结构，它利用亲和素为中空间的结构，它利用亲和素为中空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联介，一端通过生物素化的抗体联介，一端通过生物素化的抗体联介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素接第一抗体，另一端通过生物素接第一抗体，另一端通过生物素接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多化酶与显色系统相连接
13、，产生多化酶与显色系统相连接，产生多化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的级放大，从而提高此生物反应的级放大，从而提高此生物反应的级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性敏感性和特异性敏感性和特异性敏感性和特异性n nABAB复合物多用于复合物多用于复合物多用于复合物多用于ABCABC法的免疫组化法的免疫组化法的免疫组化法的免疫组化中中中中第十六页，本课件共有73页 酶标亲和素（酶标亲和素（Labelled streptavidin）n n在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶
14、与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感第十七页，本课件共有73页多聚物载体多聚物载体n n一步法及二步法载体试剂，可分别称一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOSDAKO EPOS及及DAKO EnvisionDAKO Envision试剂试剂n n核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用起到载体的作用n n一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物第十八页，本课件共有73页一步法：一步法：EPOS tissue antig
15、en dextran backbonedextran backbone primary antibody enzyme molecule enzyme molecule 第十九页，本课件共有73页二步法：二步法：EnVisionEnVision第二十页，本课件共有73页n n葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal protein A,SPA）第二十一页，本课件共有73页二、免疫过氧化物酶染色技术二、免疫过氧化物酶染色技术的基本原理的基本原理第二十二页，本课件共有73页免疫过氧化酶染色技术的基本原理免疫过氧化酶染色技术的基本原理第二十三页，本课件共有73页识别系统识别系统l l特异性抗体识
16、别组织或细胞中的靶抗原。特异性抗特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。特异性抗体具有识别并结合靶抗原的功能，这是本技术的理体具有识别并结合靶抗原的功能，这是本技术的理论依据所在论依据所在l l特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求选用特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求选用特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求选用特异性抗体品种繁多，应根据待检测抗原的要求选用l l特异性抗体有的属单抗，有的属多抗，有的既有单特异性抗体有的属单抗，有的属多抗，有的既有单抗又有多抗，可根据不同染色要求而选用抗又有多抗，可根据不同染色要求而选用l l识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第一抗完识别系
17、统的组成比较恒定，识别功能由特异的第一抗完识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第一抗完识别系统的组成比较恒定，识别功能由特异的第一抗完成成成成第二十四页，本课件共有73页显示系统显示系统n n也是显色系统。抗体抗原的结合是肉眼看不见的，显示也是显色系统。抗体抗原的结合是肉眼看不见的，显示系统的目的就是使这种看不见的反应变为看得见，从而系统的目的就是使这种看不见的反应变为看得见，从而确定抗原的存在及其定位确定抗原的存在及其定位n n显色系统由酶、底物加上显色剂组成，最终可在标记位点形成有色分子的终末产物，若显色剂为DAB，则出现棕褐色细颗粒沉淀 E(E(酶酶酶酶)+S()+S(底物底物底物底
18、物)E ES(S(酶底物复合物酶底物复合物酶底物复合物酶底物复合物)P(P(反应产物反应产物反应产物反应产物)+E(+E(酶酶酶酶)循环使用循环使用循环使用循环使用第二十五页，本课件共有73页显示系统显示系统n n辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程:HRP+H HRP+H2 2 2 2O O O O2 2 2 2 HRPHRP H H2 2O O2 2 有色分子终末产物有色分子终末产物有色分子终末产物有色分子终末产物 +HRP+HRP+HRP+HRP DABDABDABDAB（电子供体）（电子供体）（电子供体）（电子供体）HRPHRP：酶：酶 H H2 2
19、 2 2O O O O2 2：底物 HRPHRPHRPHRP H H2 2O O O O2 2：酶底物复合物 第二十六页，本课件共有73页n n免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点在于显色系统的差异：l l间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶l lPAPPAPPAPPAP法：法：法：法：利用利用利用利用PAPPAPPAPPAP复合物复合物复合物复合物l lABCABCABCABC法：法：法：法：利用利用利用利用ABABABAB复合物复合物复合物复合物l lLSABLSABLSABLSAB
20、法法法法:利用直接标记于亲和素的酶利用直接标记于亲和素的酶利用直接标记于亲和素的酶利用直接标记于亲和素的酶l lEPOSEPOSEPOSEPOS一步法及一步法及一步法及一步法及EnVisionEnVisionEnVisionEnVision二步法：多聚物载体二步法：多聚物载体二步法：多聚物载体二步法：多聚物载体 其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性其目的都是设法提高免疫组化染色的敏感性显示系统显示系统第二十七页，本课件共有73页联结系统联结系统l l联结或桥联抗体（一般为第二抗体）联结或桥联抗体（一般为第二抗体）l l按免疫学要求将识别系统与显色系统联结成为统一体按免疫学要求将识别系统与显色
21、系统联结成为统一体l l应采用何种联结抗体决定于特异性第一抗体是多克隆应采用何种联结抗体决定于特异性第一抗体是多克隆还是单克隆：还是单克隆：l l若一抗是多克隆抗体，则二抗是羊或其它动物的抗兔血清；l l若一抗是单克隆抗体，则二抗常是兔抗鼠的血清l l有的联结抗体既能联结多抗，亦能联结单抗有的联结抗体既能联结多抗，亦能联结单抗第二十八页，本课件共有73页三、免疫组化染色方法的类别三、免疫组化染色方法的类别第二十九页，本课件共有73页免疫组化染色方法的类别免疫组化染色方法的类别n n直接法n n间接法n nPAP法n nABC法n nLSAB法n n一步法（EPOS）n n两步法（Envisio
22、n）第三十页，本课件共有73页直接法直接法n n将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色，没有联结系统、未用桥抗体。n n优点：特异性高、非特异染色轻。n n缺点：敏感性低，要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记第三十一页，本课件共有73页第三十二页，本课件共有73页间接法间接法n n将标记物标记在桥联抗体上（即二抗、三抗）n n一抗往往是兔身上产生的多克隆抗体，其酶标抗体必须是针对兔n n优点：敏感性高，只需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配n n缺点：特异性差第三十三页，本课件共有73页Primary AntibodySecondary AntibodySubstrate-chromo
23、genesolution第三十四页，本课件共有73页PAPPAP法法（Peroxidase-AntiPeroxidasePeroxidase-AntiPeroxidasePeroxidase-AntiPeroxidasePeroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶，过氧化酶，过氧化酶，过氧化酶-抗过氧化酶法）抗过氧化酶法）抗过氧化酶法）抗过氧化酶法）n n组成：n n一抗是针对靶抗原的特异性抗一抗是针对靶抗原的特异性抗体体n n二抗是联结抗体，一面联结一二抗是联结抗体，一面联结一抗，另一面联结抗，另一面联结PAPPAP复合物复合物n n三抗是以过氧化物酶为抗原，三抗是以过氧化物
24、酶为抗原，在与一抗同种动物身上诱发产在与一抗同种动物身上诱发产生的抗体，并与辣根过氧化物生的抗体，并与辣根过氧化物酶形成复合物（酶形成复合物（PAPPAP）第三十五页，本课件共有73页PAPPAP法法（Peroxidase-AntiPeroxidasePeroxidase-AntiPeroxidasePeroxidase-AntiPeroxidasePeroxidase-AntiPeroxidase，过氧化酶，过氧化酶，过氧化酶，过氧化酶-抗过氧化酶法）抗过氧化酶法）抗过氧化酶法）抗过氧化酶法）n n优点：n nPAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免疫组化方法，敏感性更高n nPAP复合物
25、常来自两种不同的动物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多用于一抗为多克隆抗体的染色n n可用于福尔马林固定的石蜡切片第三十六页，本课件共有73页PAPPrimary AntibodySecondary AntibodyPeroxidase-anti-PeroxidaseSubstrate-chromogenesolution第三十七页，本课件共有73页ABCABC法法（Avidin-Biotin ComplexAvidin-Biotin Complex，亲和素，亲和素-生物素法）生物素法）n n组成：n n一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素）n n优点
26、：n n亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直接和间接酶标法更敏感，也超过PAP法。n n能用于常规石蜡切片。第三十八页，本课件共有73页亲和素亲和素生物素复合物生物素复合物（Avidin-Biotin Complex ABC）n n亲和素有四个生物素分子特异性结合亲和素有四个生物素分子特异性结合亲和素有四个生物素分子特异性结合亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和部位，其结合力强，不可逆，还可和部位，其结合力强，不可逆，还可和部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合辣根过氧化酶或荧光素等结合辣根过氧化酶或荧光素等结合辣根过氧化酶或荧光素等结合n n亲
27、和素亲和素亲和素亲和素-生物素复合物是一个三维空生物素复合物是一个三维空生物素复合物是一个三维空生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，间的结构，它利用亲和素为中介，间的结构，它利用亲和素为中介，间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一一端通过生物素化的抗体联接第一一端通过生物素化的抗体联接第一一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显抗体，另一端通过生物素化酶与显抗体，另一端通过生物素化酶与显抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从色系统相连接，产生多级放大，从色系统相连接，产生多级放大，从色系统相连接，产生多级放大，从
28、而提高此生物反应的敏感性和特异而提高此生物反应的敏感性和特异而提高此生物反应的敏感性和特异而提高此生物反应的敏感性和特异性性性性n nABAB复合物多用于复合物多用于复合物多用于复合物多用于ABCABC法的免疫法的免疫法的免疫法的免疫组化中组化中组化中组化中第三十九页，本课件共有73页ABCABC法法（Avidin-Biotin ComplexAvidin-Biotin Complex，亲和素，亲和素-生物素法）生物素法）第四十页，本课件共有73页一抗二抗ABCDABABC第四十一页，本课件共有73页ABCABC与与PAP PAP 法的比较法的比较第四十二页，本课件共有73页LSABLSAB（
29、SPSP）法）法（labelled streptavidin biotin methodlabelled streptavidin biotin method）标记的）标记的链霉亲和素链霉亲和素-生物素法生物素法n n特点：将HRP直接标记于链霉亲和素上n n优点：n n更快速：空间结构更小更快速：空间结构更小n n更敏感：链霉亲和素的亲和性更敏感：链霉亲和素的亲和性更强，更易于到达深部位点更强，更易于到达深部位点n n非特异背景更少：链霉亲和素非特异背景更少：链霉亲和素空间结构特殊，不易与高荷电空间结构特殊，不易与高荷电的组织成分（胶原纤维、结缔的组织成分（胶原纤维、结缔组织）联结组织）联结
30、第四十三页，本课件共有73页 酶标亲和素（酶标亲和素（Labelled streptavidin）n n在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感第四十四页，本课件共有73页SPPrimary AntibodyBiotinylatedSecondary AntibodyEnsyme-conjugatedStreptavidinSubstrate-chromogensolution第四十五页，本课件共有73页ABC与LSAB(SP)法的比较第四十六
31、页，本课件共有73页一步法（一步法（EPOS）及两步法（）及两步法（Envision）n n特点n n以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法）n n优点n n操作简便，省时n n提高了敏感性和特异性n n减少了背景着色n n避免内源性生物素的干扰第四十七页，本课件共有73页多聚物载体多聚物载体n n一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂n n核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用起到载体的作用n n一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶
32、，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物第四十八页，本课件共有73页一步法：一步法：EPOS tissue antigen dextran backbonedextran backbone primary antibody primary antibody enzyme molecule 第四十九页，本课件共有73页二步法：二步法：EnVisionEnVision第五十页，本课件共有73页一步法（一步法（EPOS）及两步法（）及两步法（Envision）比较）比较第五十一页，本课件共有73页Substrate-chromogensolutionEPOS一步法一步法第五十
33、二页，本课件共有73页Primary AntibodyPolymer complexSubstrate-chromogensolutionEnVision二步法二步法第五十三页，本课件共有73页四、免疫组化染色结果的判四、免疫组化染色结果的判断及异常着色的原因分析及断及异常着色的原因分析及其对策其对策第五十四页，本课件共有73页n n特异性着色具备特点 特定的组织特定的组织n n特定的定位 特定的细胞特定的细胞 特定的细胞内的部位特定的细胞内的部位 分布上的不均一分布上的不均一n n着色的不均一性 着色强度的不均一着色强度的不均一n n颗粒性显色：DABDAB显色剂应为棕黄到棕褐色显色剂应为棕
34、黄到棕褐色免疫组化染色结果的判断免疫组化染色结果的判断第五十五页，本课件共有73页CKCKCKCK染色，结肠腺癌细胞膜特异性着色染色，结肠腺癌细胞膜特异性着色染色，结肠腺癌细胞膜特异性着色染色，结肠腺癌细胞膜特异性着色第五十六页，本课件共有73页Kappa 胞浆着色胞浆着色第五十七页，本课件共有73页TdT染色，胞核着色染色，胞核着色第五十八页，本课件共有73页PR 胞核着色胞核着色第五十九页，本课件共有73页ER 胞核着色胞核着色第六十页，本课件共有73页免疫组化染色结果的判断免疫组化染色结果的判断n n对照的设置n n空白对照n n阳性对照n n吸收试验对照n n替代对照n n自身对照第六
35、十一页，本课件共有73页异常着色（假阳性）原因及对策异常着色（假阳性）原因及对策n n异常着色原因内源酶及内源性生物素内源酶及内源性生物素内源酶及内源性生物素内源酶及内源性生物素抗体本身原因抗体本身原因抗体本身原因抗体本身原因切片制作不当切片制作不当切片制作不当切片制作不当冲洗不充分冲洗不充分冲洗不充分冲洗不充分DABDAB显色产生背景着色显色产生背景着色显色产生背景着色显色产生背景着色抗原的丢失抗原的丢失抗原的丢失抗原的丢失抗原的遮蔽抗原的遮蔽抗原的遮蔽抗原的遮蔽抗体试剂因素抗体试剂因素抗体试剂因素抗体试剂因素操作不当操作不当操作不当操作不当n n假阴性的原因第六十二页，本课件共有73页内源
36、酶及内源内源酶及内源生物素生物素非特异性着色原因及对策非特异性着色原因及对策灭活过氧化物酶灭活过氧化物酶-3%H2O2灭活内源性生物素灭活内源性生物素-蛋清封闭或更换不含蛋清封闭或更换不含生物素的染色系统生物素的染色系统灭活碱性磷酸酶灭活碱性磷酸酶Desmin第六十三页，本课件共有73页抗体自身原抗体自身原因因抗体不纯抗体不纯-应用单克应用单克隆抗体隆抗体标本中含有与靶抗原相标本中含有与靶抗原相似的抗原决定簇似的抗原决定簇-采采用具更特异性抗原决定用具更特异性抗原决定簇的单克隆抗体簇的单克隆抗体异常着色原因及对策异常着色原因及对策S-100第六十四页，本课件共有73页异常着色原因及对策异常着色
37、原因及对策切片制作不切片制作不当当严重变性坏死及炎性病严重变性坏死及炎性病灶处灶处切片裱贴不平切片裱贴不平褶皱处褶皱处组织边缘部组织边缘部第六十五页，本课件共有73页异常着色原因及对策异常着色原因及对策清洗不充分清洗不充分用含盐的缓冲液充分冲用含盐的缓冲液充分冲洗，可利于减低背景着洗，可利于减低背景着色色DAB显色产生显色产生背景着色背景着色未除去未除去DAB的不溶性颗的不溶性颗粒粒DAB保存不妥，其氧化保存不妥，其氧化产物沉淀在组织上产物沉淀在组织上第六十六页，本课件共有73页电荷吸附电荷吸附加二抗动物非免疫加二抗动物非免疫血清血清牛血清也常用牛血清也常用非特异性背景着色原因及对策非特异性背
38、景着色原因及对策第六十七页，本课件共有73页假阴性的原因分析及对策假阴性的原因分析及对策n n抗原的丢失抗原的丢失抗原的丢失抗原的丢失n n标本固定不及时、固定过久，浸蜡时间、温度过高，均可将抗标本固定不及时、固定过久，浸蜡时间、温度过高，均可将抗标本固定不及时、固定过久，浸蜡时间、温度过高，均可将抗标本固定不及时、固定过久，浸蜡时间、温度过高，均可将抗原性破坏原性破坏原性破坏原性破坏n n抗原的遮蔽抗原的遮蔽抗原的遮蔽抗原的遮蔽n n福尔马林固定石蜡包埋后，其抗原性因分子交联而被遮蔽福尔马林固定石蜡包埋后，其抗原性因分子交联而被遮蔽福尔马林固定石蜡包埋后，其抗原性因分子交联而被遮蔽福尔马林固
39、定石蜡包埋后，其抗原性因分子交联而被遮蔽n n修复抗原，包括蛋白酶消化、微波加热处理修复抗原，包括蛋白酶消化、微波加热处理修复抗原，包括蛋白酶消化、微波加热处理修复抗原，包括蛋白酶消化、微波加热处理第六十八页，本课件共有73页无信号片无信号片第六十九页，本课件共有73页Mart-1Mart-1染色染色修复修复未修复未修复第七十页，本课件共有73页假阴性的原因分析及对策假阴性的原因分析及对策假阴性的原因分析及对策假阴性的原因分析及对策n n抗体的因素n n有效性：一抗的特异性、效价、保存时间、保存条件及有无菌类污染n n抗体间的相互匹配：二抗与一抗、三抗与二抗不匹配，三抗必须是一抗同种动物来源的同型抗体第七十一页，本课件共有73页n n操作不当n n掉片n n消化了不该消化的靶抗原n n切片放置不平抗体流失n n遗漏重要操作步骤（如漏加HRP的底物）n n显色时间过短假阴性的原因分析及对策假阴性的原因分析及对策解决方法：严格按操作步骤进行解决方法：严格按操作步骤进行解决方法：严格按操作步骤进行解决方法：严格按操作步骤进行第七十二页，本课件共有73页感感谢谢大大家家观观看看08.12.2022第七十三页，本课件共有73页