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1、专题专题(zhunt)2.2(zhunt)2.2动物细胞工程动物细胞工程第一页，共57页。动物动物(dngw)细细胞培养胞培养动物动物(dngw)细细胞融合胞融合单克隆抗体单克隆抗体(kngt)制备制备细胞核移植细胞核移植动物动物细胞细胞工程工程技术技术动物细胞工程的动物细胞工程的基础基础第二页，共57页。2.2.1动物动物(dngw)细胞培养和核移细胞培养和核移植技术植技术第三页，共57页。第四页，共57页。（一）、概念（一）、概念(ginin)是指从动物机体内取出相关的组织，是指从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些
2、培养基中，让这些(zhxi)(zhxi)细胞生长和细胞生长和增殖。增殖。（二）、原理（二）、原理(yunl)细胞分裂增殖细胞分裂增殖第五页，共57页。（三）、过程（三）、过程(guchng)(guchng)幼龄动物幼龄动物剪碎组织剪碎组织原代细胞培养原代细胞培养取动物器官取动物器官和组织和组织细胞悬浮液细胞悬浮液传代细胞培养传代细胞培养胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理单个细胞单个细胞胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理单个细胞单个细胞第六页，共57页。细胞贴壁细胞贴壁:培养贴附性细胞时培养贴附性细胞时,细胞细胞要能贴附于底物要能贴附于底物(d w)上才能生长上才能生长繁殖繁殖.第七页，共57页。细胞细胞(xbo)
3、接触接触抑制抑制 细胞在贴壁细胞在贴壁生长过程中，随生长过程中，随着细胞分裂，数着细胞分裂，数量不断量不断(bdun)(bdun)增加，最后形成增加，最后形成一个单层，此时一个单层，此时细胞间相互接触，细胞间相互接触，细胞分裂和生长细胞分裂和生长停止，数量不再停止，数量不再增加。增加。第八页，共57页。有关有关(yugun)概念概念v原代培养：从机体原代培养：从机体(jt)取出后立即培养的取出后立即培养的细胞为原代细胞。一般培养的第细胞为原代细胞。一般培养的第1代细胞与代细胞与传传10代以内的细胞称为原代细胞培养。代以内的细胞称为原代细胞培养。v传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配传代培养：
4、将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。培养瓶中继续培养，称为传代培养。第九页，共57页。归纳归纳(gun)过程过程取取 的组织的组织(zzh)(zzh)、器官器官细胞细胞(xbo)悬浮液悬浮液 酶酶 贴满瓶壁的细胞贴满瓶壁的细胞单个细胞单个细胞加入加入 液液动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物胰蛋白胰蛋白培养培养接触抑制接触抑制原代原代 培养培养(分装前分装前)1-10代细胞代细胞第十页，共57页。遗传物质遗传物质 改变改变原代细胞原代细胞培养培养(piyng)加加 液液4050代细胞代细胞(xb
5、o)(细胞细胞(xbo)株株)未未遗传物质遗传物质 改变改变无限无限(wxin)传代传代（细胞系）（细胞系）已已传代传代培养培养胰蛋白胰蛋白 酶酶 第十一页，共57页。有关有关(yugun)概概念念细胞株：原代细胞一般传至细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生代后又出现细胞生长停滞状态，只有长停滞状态，只有(zhyu)部分细胞由于遗传物部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下
6、可以无限制传代，质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。传代培养。第十二页，共57页。思考题：思考题：1 1、为什么选用动物胚胎或幼龄、为什么选用动物胚胎或幼龄(yu ln)(yu ln)个体的个体的器官或组织做动物细胞培养材料？器官或组织做动物细胞培养材料？2 2、为什么培养前要将组织细胞分散、为什么培养前要将组织细胞分散(fnsn)(fnsn)成单成单个细胞？个细胞？因为这些组
7、织或器官，分裂因为这些组织或器官，分裂(fnli)(fnli)能力旺盛，易于培能力旺盛，易于培养。养。成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和增殖，成块组织使细胞靠在一起限制了细胞的生长和增殖，且细胞不能与培养液充分接触，不利于培养。且细胞不能与培养液充分接触，不利于培养。第十三页，共57页。3、胰蛋白酶、胰蛋白酶(y dn bi mi)的作用是什么呢？由的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？此可说明细胞间的物质是什么成份？催化蛋白质水解。细胞间的物质催化蛋白质水解。细胞间的物质(wzh)(wzh)主主要是蛋白质要是蛋白质(胶原蛋白等胶原蛋白等)。4、细胞膜的主要、细胞膜的主要(z
8、hyo)成份是什成份是什么？么？蛋白质和磷脂蛋白质和磷脂5、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？能能第十四页，共57页。6 6、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物(dngw)(dngw)组织分散成单个细胞要注意什么问题呢组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？7 7、能够用胃蛋白酶代替、能够用胃蛋白酶代替(dit)(dit)胰蛋白酶吗？为胰蛋白酶吗？为什么？什么？注意注意(zh y)时间的控制时间的控制 不能，因为两者的最适不能，因为两者的最适PHPH不同，而正常组织细不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适胞的生存环境与胰蛋白酶的最
9、适PHPH较接近较接近第十五页，共57页。1 1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境(hunjng)(hunjng)保证保证(bozhng)细胞顺细胞顺利的生长利的生长增殖增殖 添加添加(tin ji)一定量的抗生素，定期更换培养液一定量的抗生素，定期更换培养液添加：糖（葡萄糖）、氨基酸、促生长因子、无添加：糖（葡萄糖）、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、动物血清等。机盐、微量元素、动物血清等。（四）、动物细胞培养的条件（四）、动物细胞培养的条件2 2、营养、营养第十六页，共57页。3 3、温度、温度(wnd)(wnd)和和PHPH 培养培养(piyng)(piyng)室中控制室中控制,使
10、之达到使之达到36.5 0.5,7.27.436.5 0.5,7.27.4培养箱中提供培养箱中提供(tgng)O2(tgng)O2和和CO2CO2（95%95%空气和空气和5%5%CO2 CO2）4 4、气体环境、气体环境：第十七页，共57页。植物组织培养和动物植物组织培养和动物(dngw)细胞培养细胞培养的比较的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的细胞的 细胞细胞培养基特有培养基特有成分成分 、植物激素、植物激素 葡萄糖、葡萄糖、培养结果培养结果植物体植物体培养目的培养目的快速繁殖、培育无快速繁殖、培育无病毒植株病毒植株获得获得全能性全能性增殖增
11、殖(zngzh)蔗糖蔗糖(zhtng)动物血动物血清清细胞株、细胞系细胞株、细胞系细胞细胞,某些蛋某些蛋白质白质第十八页，共57页。（五）、动物细胞培养技术（五）、动物细胞培养技术(jsh)(jsh)的应用的应用（3）细胞）细胞(xbo)的生理、药理、病理研究的生理、药理、病理研究（1）培养培养(piyng)健康细胞用于烧伤病人健康细胞用于烧伤病人皮肤移植皮肤移植（2）基因工程的受体细胞基因工程的受体细胞第十九页，共57页。资料资料(zlio)一：一：第二十页，共57页。培养的动物细胞可以用于检测有毒物质。许培养的动物细胞可以用于检测有毒物质。许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发多致畸
12、、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。现在动物细胞培养已经成为检测有毒物质的快速现在动物细胞培养已经成为检测有毒物质的快速(kui s)(kui s)而灵敏的有效手段。而灵敏的有效手段。资料资料(zlio)二：二：第二十一页，共57页。人工关节人工关节软骨软骨(rung)再生再生1.1.第一次手术第一次手术:从病人关节软骨中未从病人关节软骨中未 受力的部分，取出一片约为葡萄干大受力的部分，取出一片约为葡萄干大小的健康软骨组织。
13、小的健康软骨组织。2.2.分离分离(fnl)(fnl)软骨细胞并经三星期的软骨细胞并经三星期的体外体外 培养，使细胞数增加约培养，使细胞数增加约10102020倍。倍。3.3.第二次手术第二次手术:清理软骨受损的部分，清理软骨受损的部分，从下方骨头部位取出一片约与伤口大从下方骨头部位取出一片约与伤口大小相同的骨膜，缝在伤口上方，再将小相同的骨膜，缝在伤口上方，再将软骨细胞注射到骨膜下方。软骨细胞注射到骨膜下方。资料资料(zlio)三：三：结果结果:经过复健经过复健一年一年后后即可即可恢复恢复正常的生活。正常的生活。第二十二页，共57页。第二十三页，共57页。（一）、动物细胞核移植（一）、动物细
14、胞核移植(yzh)的概念：的概念：动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经移入一个已经(y jing)去掉细胞核的卵母细胞去掉细胞核的卵母细胞中中.使其重组并发育成一个新的胚胎使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的这个新的胚胎最终发育为动物个体胚胎最终发育为动物个体.克隆动物克隆动物(dngw)：用核移植的方法得到的：用核移植的方法得到的动物动物(dngw)。第二十四页，共57页。动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组使其重组(zhn
15、z)并发育成一个新的胚胎并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发这个新的胚胎最终发育为动物个体育为动物个体第二十五页，共57页。（二）、分类（二）、分类(fn li)：胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植：体细胞核移植体细胞核移植：细胞分化程度细胞分化程度(chngd)低，低，恢复恢复全能性容易全能性容易 细胞分化程度细胞分化程度(chngd)高，恢高，恢复复全能性困难全能性困难克隆动物克隆动物:用核移植方法得到的动物用核移植方法得到的动物.克隆克隆（clone）是指通过无性生殖而产生的遗传）是指通过无性生殖而产生的遗传上均一的上均一的生物生物群，即具有完全相同的遗传组成的一群群，即具有完全相同的遗传
16、组成的一群细胞或者生物的个体。克隆在希腊语中是细胞或者生物的个体。克隆在希腊语中是“小树枝叶小树枝叶”的意思，用以指无性增殖物。的意思，用以指无性增殖物。第二十六页，共57页。第二十七页，共57页。第二十八页，共57页。去核卵去核卵细胞细胞供体供体细胞细胞(xbo)电电刺刺激激使使两两细细胞胞融融合合重组重组(zhn z)细胞细胞重组胚胎重组胚胎新个体新个体代孕母牛代孕母牛C胚胎移植胚胎移植卵细卵细胞培胞培养养无性生殖无性生殖(wxng shngzh)（三三）、体体细细胞胞的的核核移移植植过过程程高高产产奶奶牛牛A供体供体细胞细胞培养培养供供卵卵奶奶牛牛B第二十九页，共57页。（四）、体细胞核
17、移植技术的应用（四）、体细胞核移植技术的应用(yngyng)前景前景 1、在畜牧业中可以加速、在畜牧业中可以加速(ji s)家畜遗传改良的进家畜遗传改良的进程程2、保护濒危、保护濒危(bnwi)物种物种3、生产医用蛋白质、生产医用蛋白质及组织器官的移植的供及组织器官的移植的供体体第三十页，共57页。（五）、体细胞核移植技术（五）、体细胞核移植技术(jsh)(jsh)存在的问题存在的问题 1、克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚、克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚(qng chu)。2、克隆技术效率低，畸形率高、死亡率高、易出、克隆技术效率低，畸形率高、死亡率高、易出 现早衰等问题。现早衰等问
18、题。3、生产克隆动物费用昂贵。、生产克隆动物费用昂贵。第三十一页，共57页。2 2、在动物细胞培养过程、在动物细胞培养过程(guchng)(guchng)中遗传物质发中遗传物质发生改变的细胞是生改变的细胞是 （）A A获得不死性的细胞获得不死性的细胞 B B1010代以内细胞代以内细胞 C C原代细胞原代细胞 D D传代细胞传代细胞1 1、动物细胞工程技术的基础、动物细胞工程技术的基础(jch)(jch)是是 （）A.A.动物细胞融合动物细胞融合 B.B.单克隆抗体单克隆抗体 C.C.胚胎移植胚胎移植 D.D.动物细胞培养动物细胞培养A AD D课堂反馈课堂反馈(fnku)练练习习第三十二页，
19、共57页。3 3、在动物细胞培养的有关叙述中正确的是：（、在动物细胞培养的有关叙述中正确的是：（）A A、动物细胞培养的目的只是为了获得大量的细胞、动物细胞培养的目的只是为了获得大量的细胞 分泌蛋白分泌蛋白B B、动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散、动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散C C、细胞的癌变发生在原代培养向传代、细胞的癌变发生在原代培养向传代(chun di)(chun di)培培养的过渡养的过渡 过程中过程中D D、培养至、培养至5050代后传代代后传代(chun di)(chun di)细胞遗传物质没有细胞遗传物质没有发生改变发生改变B B第三十三页，共57页。4 4、一般说
20、来，动物细胞体外培养需要满足、一般说来，动物细胞体外培养需要满足(mnz)(mnz)以下条件（以下条件（）无毒的环境无毒的环境(hunjng)(hunjng)无菌的环境无菌的环境(hunjng)(hunjng)培养基需要加入血清培养基需要加入血清 温度与动物体温相似温度与动物体温相似 需要需要O2O2，不需要，不需要CO2 CO2CO2 CO2能调节培养液能调节培养液PHPHA A、B B、C C、D D、D D第三十四页，共57页。5 5、动物细胞培养的特点、动物细胞培养的特点(tdin)(tdin)（）细胞贴壁细胞贴壁 有丝分裂有丝分裂 细胞分化细胞分化 接触抑制接触抑制 减减数分裂数分裂
21、 原代培养一般传原代培养一般传1 11010代代A A、B B、C C、D D、A A第三十五页，共57页。6 6、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：（1 1）容器）容器A A中放置的是动物器官或组织。它一般中放置的是动物器官或组织。它一般(ybn)(ybn)取自取自_。（2 2）容器）容器A A中的动物器官或组织首先要进行的处理是中的动物器官或组织首先要进行的处理是 ，然后用，然后用 酶处理，这是为了使细胞分散开来，这酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是样做的目的是 。动物动物(dngw)胚胎或胚胎或幼龄动物幼龄动物(
22、dngw)剪碎剪碎胰蛋白胰蛋白(dnbi)使细胞与培养液充分接触，便于培养使细胞与培养液充分接触，便于培养第三十六页，共57页。（3 3）培养首先在）培养首先在B B瓶中进行，瓶中的培养基成分有瓶中进行，瓶中的培养基成分有 _等。在此瓶中培养一段时间后，等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老有许多细胞衰老(shuilo)(shuilo)死亡，这是培养到第死亡，这是培养到第 代，到这时的培养称为代，到这时的培养称为_ _ 。（4 4）为了把）为了把B B瓶中的细胞分装到瓶中的细胞分装到C C瓶中，用瓶中，用 处理，然后配置成处理，然后配置成 ，再分装。，再分装。动物动物(dngw)血清血清1
23、0原代培养原代培养(piyng)胰蛋白酶胰蛋白酶细胞悬浮液细胞悬浮液第三十七页，共57页。第三十八页，共57页。第三十九页，共57页。动物动物(dngw)细胞细胞融合融合第四十页，共57页。细胞细胞(xbo)A细胞细胞(xbo)B杂种杂种(zzhng)细胞细胞灭活的病毒灭活的病毒物理法物理法化学法化学法第四十一页，共57页。用灭活的病毒诱导用灭活的病毒诱导(yudo)动物细胞融合过动物细胞融合过程程细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核第四十二页，共57页。细胞融合与融合诱导细胞融合与融合诱导(yudo)细胞融细胞融合物质合物质诱导剂：病毒、聚乙二醇诱导剂：病毒、聚乙二醇诱导细胞融合的病毒必
24、须诱导细胞融合的病毒必须(bx)灭活。灭活。思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？需要灭活？第四十三页，共57页。第四十四页，共57页。第四十五页，共57页。第四十六页，共57页。第四十七页，共57页。第四十八页，共57页。第四十九页，共57页。二、单克隆抗体二、单克隆抗体(kngt)什么是抗体？什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有并能与该抗原发生特异性结合的具有(jyu)免疫功能的球蛋白。免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。淋巴细胞产生抗体。第五十页，共57页。单克隆抗体
25、单克隆抗体(kngt)由单个由单个B淋巴细胞淋巴细胞(xbo)经过无性繁殖经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞（克隆），形成基因型相同的细胞(xbo)群，群，这一细胞这一细胞(xbo)群所产生的化学性质单一、群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。特异性强的抗体称为单克隆抗体。特点：特异性强、灵敏度高特点：特异性强、灵敏度高 第五十一页，共57页。单克隆抗体制备单克隆抗体制备(zhbi)过程过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选(shixun)杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生
26、足够数量的、能产生特定抗体特定抗体(kngt)的的细胞群细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体第五十二页，共57页。单克隆抗体单克隆抗体(kngt)的应用的应用与常规与常规(chnggu)抗体相比，单克隆抗体抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高。产量高，特异性强，灵敏度高。应用应用(yngyng)主要有：主要有：1、临床诊断、临床诊断2、作为载体，运载抗癌药物，形成、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹”治疗肿治疗肿瘤瘤第五十三页，共57页。第五十四页，共57页。第五十五页，共57页。第五十六页，共57页。植物体细胞植物体细胞(xbo)杂交和动物细胞杂交和动物细胞(xbo)融合的比较融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合原理细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合的方法细胞融合的方法 去除细胞壁后诱导去除细胞壁后诱导原生质体融合原生质体融合使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合诱导方法诱导方法物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒用途用途获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体第五十七页，共57页。