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1、优质课DNA的粗提取与鉴定 DNA DNA的溶解性的溶解性DNADNA和蛋白质等其他成分和蛋白质等其他成分在不同浓度的在不同浓度的NaClNaCl溶液溶液中溶解度不同中溶解度不同利用这一特点，利用这一特点，选择适当的盐浓度选择适当的盐浓度就能使就能使DNA充分溶解，充分溶解，而使杂质沉淀；而使杂质沉淀；或者让其他成分溶解，或者让其他成分溶解，DNA析出析出3.DNA3.DNA等大分子的理化性质等大分子的理化性质 DNA不溶于酒精溶液不溶于酒精溶液 DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性试剂：试剂：（二）（二）DNADNA的鉴定的鉴定条件：条件：二苯胺二苯胺沸水浴条件下，沸水
2、浴条件下，DNADNA与二苯胺反应呈现与二苯胺反应呈现蓝色蓝色沸水浴沸水浴现象：现象：（一）（一）实验材料的选取实验材料的选取（二）（二）破碎细胞，获取含破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液（三）（三）除去滤液中的杂质除去滤液中的杂质(纯化纯化)（四）（四）DNADNA的析出与鉴定的析出与鉴定二、实验设计二、实验设计（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取从下列材料中选取从下列材料中选取2 23 3种种原则：原则：菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物
3、的红细胞；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌在液体培养基中培养的大肠杆菌在液体培养基中培养的大肠杆菌在液体培养基中培养的大肠杆菌凡是含有凡是含有凡是含有凡是含有DNADNADNADNA的生物材料都可以考虑的生物材料都可以考虑的生物材料都可以考虑的生物材料都可以考虑但是，选用但是，选用但是，选用但是，选用DNADNADNADNA含量相对较高的组织，成功的可能含量相对较高的组织，成功的可能含量相对较高的组织，成功的可能含量相对较高的组织，成功的可能性更大性更大性更大性更大 材料：新鲜的鸡血（注意要
4、加入柠檬酸钠，防止血液凝固）材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）思考题：思考题：能否选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料？为什么？能否选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料？为什么？不能。不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水液中加入一定量的蒸馏水液中加入一定量的
5、蒸馏水液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，同时用玻璃棒搅拌，同时用玻璃棒搅拌，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可过滤后收集滤液即可过滤后收集滤液即可过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液1 1、动物细胞、动物细胞答：答：答：答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再
6、加上搅拌再加上搅拌再加上搅拌再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核细胞膜和核细胞膜和核细胞膜和核膜的破裂膜的破裂膜的破裂膜的破裂)，从而释放出从而释放出从而释放出从而释放出DNADNADNADNA。讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？2 2、植物细胞、植物细胞植植物物细细胞胞需需要要先先用用一一定定的的洗洗涤涤剂剂溶溶解细胞膜解细胞膜实实 例例：提提 取取 洋洋 葱葱DNADNA时时，在在切切碎碎的的洋洋葱葱中中加加入入一一定定的的
7、洗洗涤涤剂剂和和食食盐盐，进进行行充充分分的的搅搅拌拌和和研研磨磨，过过滤滤后收集研磨液后收集研磨液讨论：加入洗涤剂和食讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？盐的作用分别是什么？答：答：洗涤剂是一些离子去洗涤剂是一些离子去污剂，污剂，能溶解细胞膜，有能溶解细胞膜，有利于利于DNADNA的释放的释放；食盐的食盐的主要成分是主要成分是NaClNaCl，有利于，有利于DNADNA的溶解的溶解讨讨论论：如如果果研研磨磨不不充充分分，会会对对实验结果产生怎样的影响？实验结果产生怎样的影响？答：答：答：答：研磨不充分会使细胞核内的研磨不充分会使细胞核内的研磨不充分会使细胞核内的研磨不充分会使细胞核内的D
8、NADNADNADNA释放不完全，释放不完全，释放不完全，释放不完全，提取的提取的提取的提取的DNADNADNADNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝量变少，影响实验结果，导致看不到丝量变少，影响实验结果，导致看不到丝量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物状沉淀物状沉淀物状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等、用二苯胺鉴定不显示蓝色等、用二苯胺鉴定不显示蓝色等、用二苯胺鉴定不显示蓝色等思考：加入蒸馏水的目的是什么？加速了鸡血细胞的破裂加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出，从而释放出DNA思考题：搅拌的目的（注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛，防止打
9、碎DNA）加速了鸡血细胞的破裂加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出，从而释放出DNA思考：这个步骤过滤获得什么？获得含核物质的滤液（获取含DNA的滤液）（注意：此时释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用34层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质）思考：滤液中可能含有哪些细胞成分？思考：滤液中可能含有哪些细胞成分？思考：滤液中可能含有哪些细胞成分？思考：滤液中可能含有哪些细胞成分？可能含有核蛋白、多糖和可能含有核蛋白、多糖和可能含有核蛋白、多糖和可能含有核蛋白、多糖和RNARNARNARNA等杂质（等杂质（等杂质（等杂质（为了纯化提取的为了纯
10、化提取的为了纯化提取的为了纯化提取的DNADNA需要需要需要需要将滤液作进一步处理将滤液作进一步处理将滤液作进一步处理将滤液作进一步处理）1.DNA1.DNA的溶解性的溶解性的溶解性的溶解性（三）除去滤液中的杂质（三）除去滤液中的杂质方案一、在滤液中加入方案一、在滤液中加入NaClNaCl，使，使NaClNaCl溶液浓度为溶液浓度为2mol/L2mol/L，过滤除去，过滤除去不溶的杂质不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节，再加入蒸馏水，调节NaClNaCl溶液浓度为溶液浓度为0.14mol/L0.14mol/L，析出，析出DNADNA，过滤除去，过滤除去溶溶液中的杂质液中的杂质，再用，再用2mol/
11、L2mol/L的的NaClNaCl溶液溶解溶液溶解DNADNA。思考：加入2mol/L的的NaCl溶液，搅拌溶液，搅拌1min，注意应沿一个方向，注意应沿一个方向，目的是？目的是？目的是使DNA充分溶解思考：过滤溶解有DNA的2mol/L的的NaCl溶液，获得什么？溶液，获得什么？含DNA的滤液思考：这一步过滤的目的是？含DNA的滤液，除去不溶的杂质DNA的析出的析出 将溶液中的将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。是实验成败的关键。加加蒸馏水蒸馏水降低降低NaCl溶液浓度，使溶液浓度，使DNA析出。析出。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地实验中
12、应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一沿一个方向个方向不停地均匀搅拌，以利于不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠分子的附着和缠绕。同时绕。同时应注意控制加水量应注意控制加水量，使使NaCl溶液的始终浓度溶液的始终浓度为为0.10.2 mol/L。加水太多、溶液过稀，会使。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。分子又重新溶解。注意：在析出DNA的黏稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中黏稠物不再增加思考：加蒸馏水的目的是？调节调节NaCl溶液物质的量为接近溶液物质的量为接近014mol/L，使，使DNA黏黏稠物最大限度的析出稠物最大限度的析出思考：这一步搅拌的目的是？（轻轻地沿一个方向不
13、停地均与搅拌）稀释稀释NaCl溶液溶液,析出析出DNA黏稠物黏稠物思考：这一步过滤含DNA黏稠物的黏稠物的014mol/L的的NaCl溶液，获得什么？溶液，获得什么？获得DNA黏稠物（黏稠物（纱布上的纱布上的DNA黏稠物）黏稠物）思考：过滤的目的？获得DNA黏稠物。除去溶液中的杂质黏稠物。除去溶液中的杂质为什么反复地溶解与析出为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？，能够去除杂质？1 1、用高盐浓度的溶液溶解、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去，能除去在高盐中不能溶解的杂质在高盐中不能溶解的杂质；2 2、用低盐浓度使、用低盐浓度使DNA析出，能除去析出，能除去溶解溶解在低盐溶液中的杂质。在
14、低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出因此，通过反复溶解与析出DNA，就能，就能够除去与够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。溶解度不同的多种杂质。讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNADNADNADNA 与蛋白质分开；与蛋白质分开；与蛋白质分开；与蛋白质分开；方案三：利用方案三：利用方案三：利用方案三：利用DNADNADNADNA和蛋白质对高温耐受性的不同，和蛋白质对高温耐受性的不同，和蛋
15、白质对高温耐受性的不同，和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性，与使蛋白质变性，与使蛋白质变性，与使蛋白质变性，与DNADNADNADNA分离分离分离分离（四）（四）DNADNA的析出与鉴定的析出与鉴定与滤液与滤液与滤液与滤液体积相等体积相等体积相等体积相等的的的的冷却冷却冷却冷却的的的的酒精溶液酒精溶液酒精溶液酒精溶液(体积分数体积分数体积分数体积分数95959595)，静置静置静置静置2 2 2 23min3min3min3min，溶液中会出现，溶液中会出现，溶液中会出现，溶液中会出现白色丝状物白色丝状物白色丝状物白色丝状物 粗提取粗提取粗提取粗提取DNADNADNADNA用玻璃棒用玻璃
16、棒用玻璃棒用玻璃棒沿一个方向搅拌沿一个方向搅拌沿一个方向搅拌沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水1 1、DNADNA的析出的析出的析出的析出思考：搅拌的目的(玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌)卷起卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的丝状物，获取含杂质较少的DNA2.DNA2.DNA的鉴定的鉴定的鉴定的鉴定 向两支试管中分别加入向两支试管中分别加入向两支试管中分别加入向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl2mol/L NaCl2mol/L NaCl2mol/L NaCl 溶液溶液溶液溶
17、液5ml5ml5ml5ml 其中一支试管中加入其中一支试管中加入其中一支试管中加入其中一支试管中加入DNADNADNADNA丝状物，用玻璃棒搅拌，使丝状物，用玻璃棒搅拌，使丝状物，用玻璃棒搅拌，使丝状物，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解丝状物溶解丝状物溶解丝状物溶解 向两支试管中各加入向两支试管中各加入向两支试管中各加入向两支试管中各加入二苯胺二苯胺二苯胺二苯胺试剂试剂试剂试剂4ml4ml4ml4ml 混匀后，置于沸水浴中加热混匀后，置于沸水浴中加热混匀后，置于沸水浴中加热混匀后，置于沸水浴中加热5min5min5min5min 待试管冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化待试管冷却后，比较两只试管中
18、溶液的颜色变化待试管冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化待试管冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化 观察现象：观察现象：观察现象：观察现象：溶解丝状物的溶液变为溶解丝状物的溶液变为蓝色蓝色1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。三、操作提示过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液 获得含核物质的滤液获得含核物质的滤液
19、 过滤含粘稠物的过滤含粘稠物的0.140.14mol/LNaCl溶液溶液 获取纱布上的获取纱布上的DNADNA粘稠物粘稠物 过滤溶解有过滤溶解有DNA的的2 2mol/LNaCl溶液溶液 得到含得到含DNA的滤液的滤液 本实验中有三次过滤本实验中有三次过滤,获得什么？获得什么？第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液加速了鸡血细胞的破裂加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出，从而释放出DNA第二次搅拌加第二次搅拌加2 2mol/LNaCl溶液的滤液溶液的滤液目的是使DNA充分溶解在2 2mol/LNaCl溶液中溶液中第三次搅拌加蒸馏水至第三
20、次搅拌加蒸馏水至0.140.14mol/LNaCl溶液溶液稀释稀释NaCl溶液溶液,析出析出DNA黏稠物黏稠物第四次搅拌放入第四次搅拌放入2 2mol/LNaCl溶液中纱布上的粘稠物溶液中纱布上的粘稠物使使DNADNA黏稠物充分溶解在黏稠物充分溶解在2 2mol/LNaCl溶液中溶液中第五次搅拌体积分数为第五次搅拌体积分数为95%95%的酒精的酒精实验中有五次用玻璃棒搅拌实验中有五次用玻璃棒搅拌?分别有什么作用分别有什么作用?卷起卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的丝状物，获取含杂质较少的DNA本实验两次用蒸馏水本实验两次用蒸馏水第一次：第一次：加速了鸡血细胞的破裂加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和
21、核膜的破裂细胞膜和核膜的破裂)，从，从而释放出而释放出DNA第二次：第二次：调节调节NaCl溶液物质的量为溶液物质的量为014mol/L，使，使DNA黏稠物最大限度的析出黏稠物最大限度的析出本实验两次析出本实验两次析出DNADNA第一次：用第一次：用0.14 mol0.14 molL L 的的NaCINaCI溶液析出溶液析出DNADNA，过滤，过滤除去溶液中的杂质除去溶液中的杂质第二次：用冷却的第二次：用冷却的9595的酒精，获得含杂质较少的的酒精，获得含杂质较少的DNA丝状物丝状物（利用（利用DNA容易酒精溶液，但是细胞中的容易酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精）某些蛋白质则溶于酒精
22、）实验成功的关键及注意事项1.破碎细胞，释放DNA的过程中，若是血细胞，加水后必须充分搅拌，不应少于5min；若是菜花，则应与研磨液混合，研磨时间不少于10min2.用冷酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的95%的酒精必须经过预冷后才能使用3.在用玻璃棒搅拌时，玻璃棒不能直接插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子4.由于玻璃表面带电荷，DNA中的磷酸基业带电荷而被吸附于玻璃表面，故实验中用塑料杯和试管可减少损失1.材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够实验现象不明显的原因分析2.加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏3.二苯胺配制时间过长，变成浅蓝色，影响鉴定效果4.析出含DNA的黏稠物时，蒸馏水一次快速加入，影响实验结果5.实验中有多次搅拌，但是其目的及操作方法是不同的，操作时不注意区分，影响实验结果（注意：搅拌都沿一个方向进行）结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！28