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1、细胞培养培训 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望常用设备常用设备 l液氮罐、储品柜（存放杂物）、日液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（低温冰箱（-80-80）、空调、二氧化）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。碳缸瓶、边台（书写实验记录）。离心机（收集细胞）、超净工作台、离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、倒置显微镜、CO2CO2孵箱、水浴锅、孵箱、水浴锅、44冰箱冰箱 无
2、菌室的灭菌无菌室的灭菌l1.1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用作台等，然后用33来苏水或者新洁来苏水或者新洁尔灭或者尔灭或者0.50.5过氧乙酸擦拭。过氧乙酸擦拭。l2.CO22.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用孵箱（培养箱）灭菌：先用33新洁尔灭擦拭，然后用新洁尔灭擦拭，然后用7575酒精酒精擦拭或者擦拭或者0.50.5过氧乙酸，再用紫外过氧乙酸，再用紫外灯照射灯照射无菌室的灭菌无菌室的灭菌l3.3.实验前灭菌：打开紫外灯、三实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各氧杀菌机、空气
3、净化器系统各20-3020-30分钟分钟l4.4.实验后灭菌：用实验后灭菌：用7575酒精酒精（33新洁尔灭）擦拭超净台、新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。边台、倒置显微镜的载物台。实验人员的无菌准备实验人员的无菌准备l1.1.肥皂洗手。肥皂洗手。l2.2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩。穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩。l3.3.用用7575酒精棉球擦净双手。酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示无菌操作的演示 l1.1.凡是带入超净工作台内的酒精、凡是带入超净工作台内的酒精、PBSPBS、培养基的瓶子均要用、培养基的瓶子均要用7575酒精擦拭瓶子的外表面酒精擦拭瓶子的外表面l2.2.靠近
4、酒精灯火焰操作。靠近酒精灯火焰操作。l3.3.器皿使用前必须过火灭菌器皿使用前必须过火灭菌无菌操作的演示无菌操作的演示 l4.4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。要放在高处，使用时仍要过火。l5.5.各种操作要靠近酒精灯，动作要各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。碰到废液缸。l6.6.吸取两种以上的使用液时要注意吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。更换吸管，防止交叉污染。细胞培养用液的配制与消毒细胞培养用液的配制与消毒 l细胞培养用水必须非常纯净，不含细胞培养
5、用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水的双蒸水、三蒸水或纯净水 青、青、链链霉素溶液的配制霉素溶液的配制与与消毒消毒 l1.1.所用纯净水（双蒸水）所用纯净水（双蒸水）需要需要1515磅高压磅高压2020分钟灭菌。分钟灭菌。l2.2.具体操作均在超净台内完成。青霉素具体操作均在超净台内完成。青霉素是是8080万单位万单位/瓶，用注射器加瓶，用注射器加4ml4ml灭菌双灭菌双蒸水。链霉素是蒸水。链霉素是100100万单位万单位/瓶，加瓶，加5ml5ml灭灭菌双蒸水，即每毫升各为菌双蒸水，即每毫升各为2020万单位。万单位。l3.
6、3.使用时溶入培养液中，使青链霉使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为素的浓度最终为100100单位单位/ml/ml。1 1单位单位1 1微克？微克？RPMI1640的制备与消毒的制备与消毒l1.1.溶解、调溶解、调PHPH值、定容：先将培养基粉剂值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积加入培养液体积2/32/3的双蒸水中的双蒸水中,并用双蒸并用双蒸水冲洗包装袋水冲洗包装袋2-32-3次次(冲洗液一并加入培养冲洗液一并加入培养基中基中),),充分搅拌至粉剂全部溶解充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包并按照包装说明添加一定的药品装说明添加一定的药品.然后用注射器向培然后用注射器向培养基中加入配制好
7、的青链霉素液各养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为使青链霉素的浓度最终各为100100单位单位/ml/ml。然后用一个当量的盐酸和然后用一个当量的盐酸和NaOHNaOH调调PHPH到到7.27.2左左右。最后定容至右。最后定容至1000ml1000ml，摇匀。，摇匀。RPMI1640的制备与消毒的制备与消毒l2.2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。待消毒。l3.3.抽
8、滤：配制好的培养液通常用滤器过滤抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。滤。l4.4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于置于44冰箱内待用。冰箱内待用。l5.5.使用前要向使用前要向100ml100ml培养液中加入培养液中加入1ml1ml谷氨谷氨酰胺溶液（酰胺溶液（44时两周有效）。时两周有效）。血清的灭活血清的灭活 l细胞培养常用的是小牛血清，新买细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在来的血清要在5656水浴中灭火水浴中灭火3030分分钟后，再经过过滤方可加入培养基钟后，再经过过滤
9、方可加入培养基中使用。中使用。谷氨酰胺谷氨酰胺l合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，44下放置下放置1 1周周可分解可分解5050，故应单独配制，置于，故应单独配制，置于-20-20冰箱中冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培
10、养液保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在在44冰箱中储存冰箱中储存2 2周以上时，应重新加入原来的周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。谷氨酰胺。谷氨酰胺谷氨酰胺l一般培养液中谷氨酰胺的含量为一般培养液中谷氨酰胺的含量为1 14mol/L4mol/L。可以配制。可以配制200mol/L200mol/L谷氨酰胺液谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺谷氨酰胺2.922g2.922g溶于三蒸水加至溶于三蒸水加至100ml100ml即即配成配成200mol/L200mol/L的溶液，充分搅拌溶解后，的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，过滤
11、除菌，分装小瓶，-20-20保存，使用保存，使用时可向时可向100ml100ml培养液中加入培养液中加入1ml1ml谷氨酰胺谷氨酰胺溶液。溶液。细胞传代培养（消化法）细胞传代培养（消化法）l一一.传代前准备：传代前准备：l1.1.预热培养用液：把已经配制好的装有培预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、养液、PBSPBS液和胰蛋白酶的瓶子放入液和胰蛋白酶的瓶子放入3737水水浴锅内预热。浴锅内预热。l2.2.用用7575酒精擦拭经过紫外线照射的超净酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。工作台和双手。l3.3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于
12、操作而且可减少污染。空间，不仅便于操作而且可减少污染。l4.4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。点燃酒精灯：注意火焰不能太小。细胞传代培养（消化法）细胞传代培养（消化法）l 5.5.准备好将要使用的消毒后的空培养准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，瓶，放入微波炉内高火，8 8分钟再次消毒。分钟再次消毒。l6.6.取出预热好的培养用液：取出已经预热取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。放入超净台内。l 7.7.从培养箱内取出细胞：注意取出细从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显
13、微镜胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。的台面，再在镜下观察细胞。l 8.8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。时要在酒精灯上烧口消毒。细胞传代培养（消化法）细胞传代培养（消化法）l吹打分散细胞吹打分散细胞l1.1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。成细胞悬液。l2.2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml10ml离心管中。离心管中。l3.3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以心机中，以10
14、001000转转/分钟离心分钟离心6-86-8分钟。分钟。l4.4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入加入2ml2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。细胞悬液。细胞传代培养（消化法）细胞传代培养（消化法）l继续培养：继续培养：l用酒精棉球擦拭培养瓶，用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入适当旋松瓶盖，放入CO2CO2培养箱中继培养箱中继续培养。传代细胞续培养。传代细胞2 2小时后开始贴附小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积培养瓶底面积2525时为一个，占时为一个，
15、占5050为，占为，占7575时为。时为。细胞传代培养（消化法）细胞传代培养（消化法）l传代细胞培养注意事项：传代细胞培养注意事项：l 1.1.严格的无菌操作严格的无菌操作 l2.2.适度消化：消化的时间适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。终止消化。细胞的复苏细胞的复苏 l细胞复苏的原则快速融化：必须细胞
16、复苏的原则快速融化：必须将冻存在将冻存在-196-196液氮中的细胞快速液氮中的细胞快速融化至融化至3737，使细胞外冻存时的冰，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。损害。细胞的复苏细胞的复苏l一一.实验前准备：实验前准备：l1.1.将水浴锅预热至将水浴锅预热至37 37 l2.2.用用7575酒精擦拭紫外线照射酒精擦拭紫外线照射30min30min的超净工作台台面。的超净工作台台面。l 3.3.在超净工作台中按次序摆放在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶好消过毒的离心
17、管、吸管、培养瓶等等。等等。细胞的复苏细胞的复苏l二取出冻存管：二取出冻存管：l 1.1.根据细胞冻存记录按标签找根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。到所需细胞的编号。l 2.2.从液氮罐中取出细胞盒，取从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编出所需的细胞，同时核对管外的编号。号。细胞的复苏细胞的复苏l三迅速解冻：三迅速解冻：l 1.1.迅速将冻存管投入到已经预迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。的摇动，使管中的液体迅速融化。l 2.2.约约1-2min1-2min后冻存管内液体完后冻存管内液体完
18、全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。管的外壁，再拿入超净台内。l四四.平衡离心：平衡离心：l用架盘天平平衡后，放入用架盘天平平衡后，放入离心机中离心机中3000r/min 3000r/min 离心离心3min3min细胞的复苏细胞的复苏l五五.制备细胞悬液：制备细胞悬液：l1.1.吸弃上清液。吸弃上清液。l2.2.向离心管内加入向离心管内加入10ml10ml培养液，培养液，吹打制成细胞悬液。吹打制成细胞悬液。l六六.培养细胞培养细胞 l 将复合细胞计数要求的细胞悬液分装将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入入培养瓶内，将培养瓶
19、放入3737和和5 5CO2CO2的培养箱内的培养箱内2-42-4小时（或者小时（或者24-4824-48小时）后小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。况而定。初学者易犯错误初学者易犯错误l1 1水浴锅未预热或者未预热到水浴锅未预热或者未预热到3737。l2.2.水浴锅内冻存管太多，导致传热水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。不佳，使融化时间延长。l3.3.离心前忘记平衡，导致离心机损离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。坏和细胞丢失。l4.4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染
20、。头和吸管，导致细胞交叉污染。细胞的冻存细胞的冻存 l1.1.先将冻存管放入先将冻存管放入44冰箱，约冰箱，约40min40min。l2.2.接着置于接着置于-20-20冰箱，约冰箱，约30-60min30-60min。l3.3.置于置于-80-80超低温冰箱中放置过夜。超低温冰箱中放置过夜。l4.4.置于液氮罐中长期保存。置于液氮罐中长期保存。l5 5同时做好冻存记录，在自己的笔记同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。本和冻存记录本上均要记录。细胞的冻存细胞的冻存l注意事项：注意事项：l1.1.使用使用DMSODMSO前，不需要进行高压前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，在常温下，DMSODMSO对人体有害，故对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。在配制时最好戴上手套操作。细胞的冻存细胞的冻存l注意事项：注意事项：l2.2.不宜将冻存细胞放置在不宜将冻存细胞放置在00-6060这一温度范围内过久，低温这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，损伤主要发生在这一温度区内，是是“危险温区危险温区”。l3.3.注意定期检查液氮罐内液氮量，注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。及时添加。