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1、器材准备器材准备自然界中的微生物v已经发现的微生物大约13万5千种，被认为非常危险的有600种，在人间传染的病原微生物380种。这些微生物存在于地球的各个角落，从寒冷的极地到炎热的赤道，从4.2千米地层深处到85千米高空（芽孢）,均有它们的踪迹。v空气、水、土壤、人体的体表以及与外界相通的腔道，均有不同种类和数量的微生物存在。v存在于人体消化道的细菌细菌超过800种，数量可达100万亿（1014），菌体重量11.5公斤。医学微生物学实验综合性实验三(P38)v空气与人体体表细菌学检查空气的细菌学检查P38手指皮肤的细菌学检查P41空气的细菌学检查P38 空气是人类赖以生存的环境之一，也是重要的
2、疾病传播媒介。空气中的病原菌主要来自病人的排泄物和分泌物。这些污物，因风吹，以及人类日常活动，以气溶胶的形式悬浮于空中，使空气受到污染。v环境：不利于微生物生长。v种类：主要是病毒、真菌和细菌。在医院，公共场所致病菌的数量比较多。v作用：可迅速全球传播。v危害：引起培养基、生物制品的污染，病原菌引起呼吸道传染病。v实验方法：自然沉降法是根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面；培养以后，计数菌落形成单位（colony forming unit，CFU），了解空气的污染情况。v实验步骤：每组1块平板，选择采样地点（实验室、宿舍、卫生间、饭堂或任选地点），将平
3、板盖打开，盖朝下放置在平板旁，平板暴露于空气中15分钟，然后盖上盖子，作标记。37温箱培养24小时，观察结果。CFU/m3 50000NAT86N(直径7cm平板）。N：平板上的菌落数。A：平板面积(平方厘米)。T：采样时间(分钟)。空气的细菌学检查空气的细菌学检查组号地点时间(min)菌落形成单位(CFU)1卫生间152食堂153门诊大厅154呼吸科病房155呼吸科ICU156外科病房157外科ICU158外科治疗室159婴儿室1510实验室15手指皮肤的细菌学检查P41 在日常生活中，手的接触范围广，使用频率高，受到污染的机会也最多。一只外观比较“干净”的手，可携带10万个细菌、200多种
4、病毒。因此，经手传播的疾病很多，范围很广，包括肠道传染病、部分呼吸道传染病、皮肤传染病，以及一切可经手间接传播的疾病。v常住菌：常住菌：存在于皮肤表面、毛囊和皮脂腺。种类和数量比较恒定。附着在皮肤上比较牢固，用一般洗手方法，常不易去除。v暂住菌：暂住菌：存在于皮肤表面经常暴露的部位。暂住菌是外来的非正常菌群，种类和数量不定。引起人类致病的通常是暂住菌。v医务人员，经常要与病人接触，不管是直接接触，还是间接接触，都有传播病菌的可能。虽然病菌的直接来源是患者,但是造成病菌扩散的主要途径则是气溶胶和医务人员的手。因此，经常洗手和消毒是控制医院内交叉感染的主要方法。v实际上，预防感染措施中，最简单又十
5、分有效的方法就是洗手。据测定，只用自来水洗手可使暂暂住菌住菌总数减少40%，用肥皂洗手可减少80%以上。v洗手？常规的洗手方法常规的洗手方法（甲和丙操作）v将手充分浸湿，涂抹肥皂或洗涤液。v反复搓揉双手，搓揉时间不应少于 30秒。v用流水冲洗干净，整个洗手过程不少于1分钟。能有效地去除大多数手上的暂住菌。医学微生物学实验室标准洗手方法标准洗手方法（乙和丁操作）v用流动的水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。用流动的水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。v分别搓擦分别搓擦10101515次。次。v保持双手低于肘部，保持双手低于肘部，流水冲洗一分钟以上。流水冲洗一分钟以上。1.1.掌心对掌心搓
6、擦掌心对掌心搓擦 2.2.手指交错掌心对手背搓擦手指交错掌心对手背搓擦 3.3.手指交错掌心对掌心搓擦手指交错掌心对掌心搓擦4.4.两手互握互搓指背两手互握互搓指背 5.5.拇指在掌中转动搓擦拇指在掌中转动搓擦 6.6.指尖在掌心中搓擦指尖在掌心中搓擦1.掌心对掌心搓擦掌心对掌心搓擦 2.手指交错掌心对手背搓擦手指交错掌心对手背搓擦 3.手指交错掌心对掌心搓擦手指交错掌心对掌心搓擦4.两手互握互搓指背两手互握互搓指背 5.拇指在掌中转动搓擦拇指在掌中转动搓擦 6.指尖在掌心中搓擦指尖在掌心中搓擦医务人员洗手指征v接触传染病患者之后。v接触携带多耐药性细菌的病人之后。v接触病人的血液、体液、分泌
7、物和排泄物之后。v接触高危病室两个病人之间、新生儿室两个新生儿之间。v接触旧钱币之后。v上厕所前前后。v进行微生物操作或作血、尿等生化、免疫测定之后。v在施行各种手术前后。v诊断、治疗、护理特别易感染的病人之前。v进食之前。1 3 2 4 1 3 2 4 手指皮肤的细菌学检查第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。2人1块平板上:甲、丙常规洗手下:乙、丁标准洗手甲（丙）乙（丁）丙丁医学微生物学实验综合性实验一(P2)v脓汁和粪便标本中病原菌的检测（二）临床标本的检查程序 细菌的分离与培养P7目的要求：掌握分离、纯化微生物的基本操作技术。常见病原性球菌的检查程序常见病原性
8、球菌的检查程序P47P47：直接涂片、革兰染色、镜检直接涂片、革兰染色、镜检脓汁、痰、咽部分泌物脓汁、痰、咽部分泌物 观察菌落性状、溶血性、色素观察菌落性状、溶血性、色素 血琼脂平板培养血琼脂平板培养 涂片染色镜检涂片染色镜检 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 生化反应生化反应 纯培养纯培养 动物实验动物实验 药敏实验药敏实验血液、穿刺液血液、穿刺液 肉汤增菌培养肉汤增菌培养 培养液涂片染色境检培养液涂片染色境检 常见肠道致病菌的检查程序常见肠道致病菌的检查程序P48P48：粪便粪便 SS SS琼脂、伊红美蓝平板培养琼脂、伊红美蓝平板培养 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 血清学鉴定血清学鉴定 血、骨髓血、骨
9、髓 增菌培养增菌培养 双糖铁培养基双糖铁培养基 染色镜检染色镜检 生化反应生化反应 v平板划线分离法：平板划线分离法：借助于划线，将混杂的多种多种细菌，在固体培养基表面分散成单个单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团。在固体培养基表面或基内，由单个细菌在局部位置不断增值的稠密群体称为单菌落单菌落。在固体培养基表面，由多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物,称为菌苔菌苔。平板分区划线分离法步骤（5区）v接种环烧灼灭菌，以免污染标本。v取标本在平板表面上方密集涂布510mm2。v烧掉接种环上多余的标本（火焰背面烤干烧灼）。v晃动平板，当看到平板表面象镜面有反光的时
10、候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。v接种环与平板呈3040度角，通过密集涂布部分13次，使接种环重新沾上少量标本(细菌)，然后在平板表面，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。v转动平板，接种环通过第一区1次，同样的方法划第二区。如此依次划完35区。v接种环烧灼灭菌（火焰背面烤干烧灼），以免污染环境。v将平板倒置（盖在下，底朝上），37培养1824h。要充分利用平板面积，要充分利用平板面积，5 5区间隔尽量小，不能划破琼脂。区间隔尽量小，不能划破琼脂。510mm2 30条线平板划线不少于150条线平板划线分离法P8v甲脓汁
11、标本普通平板（黄色）v乙脓汁标本普通平板v丙粪便标本伊红美蓝（紫色）v丁粪便标本伊红美蓝实验分组实验分组v俩俩相对4人为一组,组号编在电源插座上。v每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。甲 乙 4丙 丁甲 乙 3丙 丁甲 乙 2丙 丁甲 乙 1丙 丁甲 乙 5丙 丁甲 乙 8丙 丁甲 乙 7丙 丁甲 乙 6丙 丁甲 乙 10丙 丁甲 乙 9丙 丁 讲 台接种环烧灼灭菌v使用前，直接在酒精灯上烧灼灭菌，把环和金属丝烧红即可。v使用后，先在火焰背面将把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。v金属杆快速通过火焰23次，杀灭表面微生物接种环直径3mm环面垂直垂
12、直离开液面：快速3ul,慢速1ul。环面水平水平离开液面：快速6ul,慢速2ul。接种环与平板接触点和划线方法？510mm2 30条线平板划线不少于150条线37培养24小时 37培养24小时 37培养24小时 37培养24小时 安全警告v接种环接种平板一次，可产生几十个微生物气溶胶颗粒。v气溶胶粒径100um沉降很快，50um在0.4s内扩散开，5um通过呼吸道直接到达肺泡。vPike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。v实验时应坐着，在酒精灯半径20厘米范围内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。思考题v为何取链
13、球菌作为空气的卫生指标之一?v为什么金黄色葡萄球菌是医院内感染常见的重要病原菌?v为什么接种环使用前后必须烧灼灭菌？忽略了有什么危害?v做细菌培养时，平板为什么要倒置?v培养细菌的常用方法有哪些?v从临床标本中分离病原菌，应注意哪些事项?实验内容v空气的细菌学检查P38普通平板(1组1块）v手指皮肤的细菌学检查P41普通平板(2人1块 划分8格）v平板划线分离法P8 甲，乙脓汁标本普通平板(黄色，1人1块）丙，丁粪便标本伊红美蓝(紫色，1人1块）常用器材摆放顺序：电源插座常用器材摆放顺序：电源插座试管架试管架酒精灯酒精灯污物盘。污物盘。试管架上器材：按接种针、接种环、油性笔和打火机的顺试管架上器材：按接种针、接种环、油性笔和打火机的顺序，分别放置在试管架中间两行，靠近电源插座一侧。序，分别放置在试管架中间两行，靠近电源插座一侧。器材使用以后，必须放回原处，依次摆整齐。器材使用以后，必须放回原处，依次摆整齐。酒精棉球酒精棉球碘酒棉球碘酒棉球镊子镊子电炉、石棉网电炉、石棉网手套手套微生物学公共器材柜微生物学公共器材柜-2-2 （东侧边台中段）（东侧边台中段）实验室器材实验室器材 整齐有序整齐有序