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1、第十二章第十二章 吸光光度分析法吸光光度分析法Spectrophotometry 本章学习要求本章学习要求1.了解溶液颜色与光吸收的关系了解溶液颜色与光吸收的关系2.了解吸光光度法的基本概念和了解吸光光度法的基本概念和 特点，掌握吸收曲线的特点，特点，掌握吸收曲线的特点，了解其应用了解其应用3.掌握掌握LambertBeer定律的原定律的原 理和应用理和应用,掌握吸光系数掌握吸光系数a和摩和摩 尔吸光系数尔吸光系数,了解了解 Lambert Beer定律的偏离情况定律的偏离情况 4.掌握显色反应的特点掌握显色反应的特点,掌握掌握 显色条件和测量条件的选显色条件和测量条件的选 择择5.掌握吸光光
2、度法的应用掌握吸光光度法的应用,了了 解吸光光度法的仪器，解吸光光度法的仪器，吸收光谱分析吸收光谱分析 Analysis of Absorption Spectroscopy 吸光光度法是以物质对光的吸光光度法是以物质对光的选择性吸收为基础的分析方法选择性吸收为基础的分析方法.本章主要讨论可见光区本章主要讨论可见光区(400-750 nm)的吸光光度法的吸光光度法11.1 11.1 基本概念基本概念1.物质对光的选择吸收物质对光的选择吸收n单色光单色光 具有同一波长的光为单色光具有同一波长的光为单色光.n复合光复合光 由不同波长光组成的混合光由不同波长光组成的混合光 称为复合光。称为复合光。n
3、互补光互补光 透射光与吸收光透射光与吸收光组组成白光，成白光，故称故称为为互互补补色光色光 n物质的颜色物质的颜色 对不同波长的光选择性吸收对不同波长的光选择性吸收n溶液的颜色溶液的颜色 被吸收光色的互补色被吸收光色的互补色n硫酸铜溶液，吸收黄光硫酸铜溶液，吸收黄光 呈现呈现蓝色蓝色.青蓝青蓝白光白光绿绿青青蓝蓝紫紫红红橙橙黄黄光的互补色示意图n高锰酸钾溶液，吸收高锰酸钾溶液，吸收 绿光绿光,呈现呈现紫色紫色。2.吸收曲线吸收曲线 absorption spectrum 照射到溶液的入射光有照射到溶液的入射光有一部分被溶液吸收一部分被溶液吸收,另另一部分透过溶液一部分透过溶液.入射光强度入射光
4、强度 I0透射光强度透射光强度 I吸收光强度吸收光强度 Ia I0=I+IaI0I溶 液透光度透光度 T transmittance T=I/I0吸光度吸光度 A absorbance A=-lg T=lg I0/IAl l作图得作图得 吸收曲线吸收曲线(吸收光谱吸收光谱)溶液溶液对不同波长的光吸收具有选择性，对不同波长的光吸收具有选择性，KMnO4溶液最大吸收波长溶液最大吸收波长 l lmax=525nm。物质的吸收曲线是一种特征曲线。不同物质的吸收曲线是一种特征曲线。不同浓度浓度溶液的溶液的吸收曲线形状相似，最大吸收吸收曲线形状相似，最大吸收波长不变。波长不变。在最大吸收波长附近，吸光度测
5、量的灵在最大吸收波长附近，吸光度测量的灵敏度最高。这一特征可作为定量分析选择敏度最高。这一特征可作为定量分析选择入射光波长的依据。入射光波长的依据。11.2 光吸收定律光吸收定律1.Lambert-Beer定律定律 一束平行单色光通过有色溶液时，一束平行单色光通过有色溶液时，溶液的溶液的吸光度吸光度A与液层与液层厚度厚度b和和溶液溶液浓度浓度c的乘积成正比。的乘积成正比。-Lambert-Beer定律定律 A=KbcK比比例常数例常数,与溶液性质与溶液性质,T,l l有关有关 K值随值随c的单位不同而不同的单位不同而不同,液层厚度以液层厚度以cm为单位为单位.c/gL-1A=abc a 吸光系
6、数吸光系数 absorption coefficient 单位单位:Lg-1 cm-1 c/molL-1 A=e e bce e 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 molar absorptivity 单位单位:Lmol-1 cm-1 e e molar absorptivity e e 表示吸光物质浓度为表示吸光物质浓度为1mol/l,液层厚度液层厚度 为为1 1cm时溶液的吸光度时溶液的吸光度.e e 值越大，溶液的吸光能力越强，值越大，溶液的吸光能力越强，显色反应的灵敏度越高显色反应的灵敏度越高.e e 是吸光物质在特定波长下的特征常数是吸光物质在特定波长下的特征常数 e e 值是选择显色反应的
7、重要依据值是选择显色反应的重要依据.Ex.浓度为浓度为0.51m mg/ml的的Cu2+溶液溶液,用用双环己酮草酰二腙光度法测定双环己酮草酰二腙光度法测定.在在600nm波长处用波长处用2cm比色皿测得比色皿测得A=0.297.求求e e,a.e=aM2.Lambert-Beer定律的偏离定律的偏离按照按照Lambert-Beer定律定律Ac 有线性关系有线性关系:A=e e bc但有时会发生偏离但有时会发生偏离,特别在浓度较大时特别在浓度较大时,偏离更大偏离更大.原因原因:1)非单色光非单色光 2)化学因素化学因素:离解、缔合、异构化等离解、缔合、异构化等 Ac011.3 吸光光度分析的方法
8、和仪器吸光光度分析的方法和仪器1.测定方法测定方法 1).目视比色法目视比色法 2).分光光度法分光光度法 定量方法定量方法n 标准曲线法标准曲线法n 标准比较法标准比较法 As/Ax=Cs/CxAcAxcx0光度分析的标准曲线 2.2.分光光度计分光光度计1.光源光源2.单色器单色器 3.吸收池吸收池 4.检测系统检测系统3.3.分光光度法的优点分光光度法的优点 灵敏度高灵敏度高.10-510-6mol/l 准确度好准确度好.RE=25%简便简便,快速快速,成本低成本低,应用广应用广.例例:用浓度为用浓度为0.100mg Mn/ml的的KMnO4标准溶液标准溶液.以以1cm比色皿在比色皿在5
9、20nm波波长处测得该溶液吸光度长处测得该溶液吸光度A为为0.500,今今取含取含Mn未知液未知液10.00ml,氧化为氧化为MnO4-后后,定容至定容至50.00ml,在相同条件在相同条件下测得下测得A=0.300.求求未知液未知液Mn的浓度的浓度.解解:0.500/0.300=0.100/cxcx=0.0600 mg/mlc未未=0.060050.00/10.00 =0.300 mg/ml 11.4 显色反应和显色条件显色反应和显色条件1.显色反应显色反应 1.灵敏度高灵敏度高.CuNH3 e e 620620=1.210=1.2102 2 Cu双硫腙双硫腙 e e 533533=5.01
10、0=5.0104 4 2.选择性好选择性好 3.显色产物组成恒定显色产物组成恒定,性质稳定性质稳定.4.显色产物与显色剂色差大显色产物与显色剂色差大,显色显色 时颜色变化明显时颜色变化明显.试剂空白值小试剂空白值小.2.显色条件显色条件 1)显色剂的用量显色剂的用量（由实验确定）（由实验确定）M +R =MR (被测组分被测组分)(显色剂显色剂)(有色化合物有色化合物)R过量过量,反应完全反应完全,MR稳定稳定,A值稳定值稳定.AAAC RC RC Raba b000A与C R关系图 2)酸度酸度大多数显色剂是有机弱酸大多数显色剂是有机弱酸(碱碱),显色反应受酸显色反应受酸度影响度影响.M +
11、R MR M(OH)n HROH-H+显色反应最适宜的酸度由实验确定显色反应最适宜的酸度由实验确定 磺基水杨酸与磺基水杨酸与Fe3+在不同条件下形成具在不同条件下形成具有不同组成和颜色的配位化合物有不同组成和颜色的配位化合物:pH 23 Fe(ssal)+pH 47 Fe(ssal)2-pH 810 Fe(ssal)33-pH12 Fe(OH)3黄色橙色紫色沉淀 3)温度、时间温度、时间 适宜的显色时间和温度由实验确定适宜的显色时间和温度由实验确定 At 11.5 吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择 1.入射光波长入射光波长1)通常选择通常选择l lmax2)l lmax处有干扰时处有干
12、扰时,选择干扰最小选择干扰最小,吸光度尽可能大的波长进行测吸光度尽可能大的波长进行测量量.2.参比溶液参比溶液(空白溶液空白溶液)在测定时用空白溶液调节仪器在测定时用空白溶液调节仪器A=0(T=100%),以消除溶液中其它物质的干扰以消除溶液中其它物质的干扰,抵消比色皿抵消比色皿对光反射、吸收对光反射、吸收.1)溶剂空白溶剂空白 试液、试剂、显色剂均无色试液、试剂、显色剂均无色(无吸收无吸收)则可用溶剂如纯水作参比溶液则可用溶剂如纯水作参比溶液.2)试剂空白试剂空白 试液无色试液无色,显色剂或其它试剂有色显色剂或其它试剂有色(有吸有吸收收),则应选试剂空白则应选试剂空白.3)试液空白试液空白
13、试剂、显色剂均无色试剂、显色剂均无色(无吸收无吸收),试液中试液中其它组分有色其它组分有色,则应采用不加显色剂的试则应采用不加显色剂的试液作参比溶液液作参比溶液.n选择参比溶液的总原则是选择参比溶液的总原则是:使试液的吸光使试液的吸光度能真正反映待测组分的浓度度能真正反映待测组分的浓度.3.吸光度读数范围吸光度读数范围n任何型号的分光光度计均有一定的读数任何型号的分光光度计均有一定的读数误差误差,这是由于光源不稳定这是由于光源不稳定,读数不准确等读数不准确等因素造成的因素造成的.n一定型号的分光光度计透光度读数误差一定型号的分光光度计透光度读数误差是一常数是一常数.（0.2%2%）n在不同的透
14、光度读数范围内引起的浓度在不同的透光度读数范围内引起的浓度相对误差是不同的相对误差是不同的.n由由Lambert-Beer定律可推导定律可推导出浓度相对出浓度相对误差公式误差公式.T=36.8%时时,A=0.434,D Dc/c有极小值有极小值T很小或很大时很小或很大时,D Dc/c都较大都较大.T=65%20%,A=0.190.7.D Dc/c2%光度测量时光度测量时,吸光度应控制在合吸光度应控制在合 适的范内适的范内:A=0.20.7 减小浓度测量的相对误差减小浓度测量的相对误差,提高准确度提高准确度4.控制吸光度范围的方法控制吸光度范围的方法1.改变比色皿的厚度改变比色皿的厚度2.改变试
15、液的浓度改变试液的浓度(称样量、稀称样量、稀释倍数等释倍数等)3.示差法示差法 例例1:Fe(phen)32+溶液的溶液的e e=1.1104Lmol-1 cm-1,在在l lmax处处,用用2cm比色皿测得溶液吸光度比色皿测得溶液吸光度A=2.若若D DT=0.5%,1)求求D Dc/c.2)怎样才能使怎样才能使A=0.20.7?解解:2)溶液浓度不变溶液浓度不变,改变比色皿厚度改变比色皿厚度:选选0.5cm比色皿比色皿,则则A=0.5.或比色皿厚度不变或比色皿厚度不变,改变溶液浓度改变溶液浓度:稀释稀释310倍倍.(称量减少到称量减少到 m/3 m/10)A=0.70.2 例例2.若上题中
16、比色皿厚度为若上题中比色皿厚度为0.5cm,欲欲使测量误差最小使测量误差最小,溶液的浓度应为溶液的浓度应为多少多少?11.6 吸光光度法的应用吸光光度法的应用 1.单一组分的测定单一组分的测定 1).钼蓝法测磷钼蓝法测磷n土壤营养诊断测磷土壤营养诊断测磷n肥料、谷物种子、果品中磷的测定肥料、谷物种子、果品中磷的测定n血清中磷的测定血清中磷的测定n水体中磷的测定水体中磷的测定 PO43-+12MoO42-+27H+=H7 P(Mo2O7)6+12H2O钼蓝法钼蓝法反应灵敏度高反应灵敏度高,显色快显色快,但稳定性差但稳定性差.钼锑抗法钼锑抗法稳定性好稳定性好.灵敏度高灵敏度高,Vc溶液须溶液须新鲜
17、配制新鲜配制.SnCl2钼蓝C H+=0.40.8mol/l,室温室温,10min 2)邻菲罗林法邻菲罗林法测测Fe2+Fe2+3phen=Fe(phen)32+lgK=21.3 盐酸羟胺还原盐酸羟胺还原Fe3+,可测全可测全Fe 4Fe3+2NH2OH =4Fe2+N2O+H2O+4H+3)双硫腙法测金属离子双硫腙法测金属离子Cu2+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+pH=45 测测Zn2+pH=89 测测Pb2+2.示差法测高含量组分示差法测高含量组分 原理原理 示差法采用比试液浓度示差法采用比试液浓度cx梢低梢低的标准溶液的标准溶液 cs作参比溶液作参比溶液,(cs cx).调节仪
18、器调节仪器A=0(T=100%),然后测试液的然后测试液的吸光度吸光度.该吸光度为试液与参比溶液吸该吸光度为试液与参比溶液吸光度之差光度之差D DA.称为相对吸光度称为相对吸光度Ar.Ar=D DA=e e b(cx-cs)=e e bD Dc定量方法定量方法:标准曲线法标准曲线法 标准比较法标准比较法示差法可提高测定的准确度示差法可提高测定的准确度0100010050Tx=5%Ts=10%示差光度法标尺扩展原理示差光度法标尺扩展原理 3.多组分分析多组分分析1.吸收曲线不重叠吸收曲线不重叠,可分别测定。可分别测定。2.吸收曲线相互重叠吸收曲线相互重叠：4.光度滴定光度滴定 spectroph
19、otometric titration 光度滴定法是根据滴定光度滴定法是根据滴定过中溶液的吸光度的变化过中溶液的吸光度的变化来确定终点的滴定分析法来确定终点的滴定分析法.例例:在在745nm处测处测EDTA滴滴Bi3+,Cu2+混合液的吸光度值混合液的吸光度值.Bi3+,Cu2+EDTA BiY,Cu2+EDTA CuYCu终点Bi终点AV/ml 在在745nm时时Bi3+,Cu2+,EDTA,BiY均均无吸无吸 收收.到第一计量点前到第一计量点前A不变不变.第一计量点后第一计量点后,随随EDTA加入加入,形成形成CuY在此波长处在此波长处CuY有吸收有吸收,A值不断值不断增大增大.到终点后再加到终点后再加EDTA,A不变不变.由由滴定曲线得到两滴定曲线得到两 个确定的终点个确定的终点.灵敏度高灵敏度高,准确度好准确度好,对于平衡常对于平衡常数小的反应也可以测定数小的反应也可以测定.