医用分子遗传学DNA复制.ppt

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1、第三章第三章 DNA 复制复制(Replication of DNA)DNA DNA 复制一般特征复制一般特征参与参与DNADNA复制的酶类复制的酶类DNADNA复制基本过程复制基本过程DNADNA复制的调控复制的调控DNADNA损伤与修复损伤与修复第一节第一节 DNA复制的一般特征复制的一般特征一、一、DNA的生物学功能的生物学功能1、储存遗传信息、储存遗传信息2、复制遗传信息、复制遗传信息3、表达遗传信息、表达遗传信息4、遗传变异、遗传变异1962,Nobel PrizeWatson(Nature,1953):Watson(Nature,1953):我们假设的特异的（碱基）配对方式我们假设

2、的特异的（碱基）配对方式我们假设的特异的（碱基）配对方式我们假设的特异的（碱基）配对方式提示了遗传物质可能的复制机制：每一条链均可作为合成提示了遗传物质可能的复制机制：每一条链均可作为合成提示了遗传物质可能的复制机制：每一条链均可作为合成提示了遗传物质可能的复制机制：每一条链均可作为合成一条新链的模板，就使子代双螺旋与母本完全一致。一条新链的模板，就使子代双螺旋与母本完全一致。一条新链的模板，就使子代双螺旋与母本完全一致。一条新链的模板，就使子代双螺旋与母本完全一致。二、二、DNA复制方式复制方式全保留全保留半保留半保留分散式分散式DNA如何进行复制？如何进行复制？15NP0P1P2P3P4P

3、0P2P0P414N 15N/14N 15NMeselson-Stahl experiment1958,PNAS根据实验结果：根据实验结果：根据实验结果：根据实验结果：第一代第一代第一代第一代DNADNA仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能仅有一条带否定了全保留复制的可能DNA的半保留复制的半保留复制 Semiconservative Replication DNA双链解开，以单链做模板，碱基互补双链解开，以单链做模板，碱基互补原则，各自合成一条链。在新合成的原则，各自合成一条链。在新合成的DNA双链分子中，双链分子中，一条是原来的老

4、链，一条是原来的老链，一条是新链一条是新链。第二代出现两条带，一条完全轻带一条中带第二代出现两条带，一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能，证明否定了分散式复制的可能，证明DNA只能是只能是半保留方式进行复制半保留方式进行复制2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性复制时复制时DNA链延伸可能有三种方式：链延伸可能有三种方式：12 3 1967年，日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生年，日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生1001000bp的短片段的短片段没有从没有从3 5 延长延长DNA链的聚合酶链的聚合酶2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性一一条条链链连连续续合合成成，称称

5、主主导导链链，Leading Leading Strand Strand 另另 一一 条条 链链 分分 段段 合合 成成，称称 随随 从从 链链Lagging StrandLagging Strand 。原原因因：DNADNA双双螺螺旋旋分分子子两两条条链链方方向向相相反反，新新链链合成的方向只能合成的方向只能5 533一个方向合成。一个方向合成。3 DNA复制的双向性复制的双向性 在两个方向同时进行，形成两个复制叉在两个方向同时进行，形成两个复制叉(Replication Fork).概括：概括：半保留半保留半不连续性半不连续性双向性双向性第三节第三节 参与参与DNA复制的酶类复制的酶类参与

6、参与DNA复制的酶或蛋白因子：复制的酶或蛋白因子：1 DNA聚合酶聚合酶 催化催化DNA的合成的合成2 引物酶引物酶 起始起始RNA的合成的合成3 连接酶连接酶 连接冈崎片段连接冈崎片段4 DNA解链，解旋酶解链，解旋酶5 DNA结合蛋白结合蛋白一一 DNA聚合酶聚合酶(Polymerase)1956年，大肠杆菌年，大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 1959，Nobel Prize（一）（一）作用机制作用机制 以以DNA做模板，碱基互补配对，做模板，碱基互补配对，催化催化4种种dNTP之间形成磷酸二酯之间形成磷酸二酯键，从而延长键，从而延长DNA链。链。Mg2+在在模板模板链上进行链上进行 不能从头

7、合成，在不能从头合成，在引物引物的的3 3OHOH端上延端上延长长新链延长方向为新链延长方向为5 533延长延长 （二）（二）原核生物原核生物DNA聚合酶聚合酶 有有3 3种：种：DNADNA聚合酶聚合酶 I I，IIII，IIIIII。多功能酶多功能酶：合成合成DNADNA的活性的活性 聚合酶作用聚合酶作用,延长延长DNADNA链。链。水解水解DNADNA的活性的活性 外切核酸酶活性外切核酸酶活性,切除不配对切除不配对碱基，起校读作用碱基，起校读作用1、DNA聚合酶聚合酶 I大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I：单链多肽蛋白质单链多肽蛋白质,分子量为分子量为109KD.109KD.

8、性质：多功能酶性质：多功能酶大亚基：大亚基：5 533聚合酶活性聚合酶活性 3 355外切酶活性外切酶活性小亚基：小亚基：5 533外切酶活性。外切酶活性。1000nt/min1000nt/min35外切酶活性外切酶活性 从游离从游离3OH端切割端切割,识别和消除不识别和消除不配对的核苷酸，保证了配对的核苷酸，保证了DNA复制的忠实复制的忠实性。性。53外切酶活性外切酶活性 DNA聚合酶聚合酶I中的小亚基带有中的小亚基带有5外切酶外切酶活性，从双链活性，从双链DNA的的5端降解释放出单端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸。核苷酸或寡聚核苷酸。35外切活性示意图外切活性示意图DNA聚合酶特有活性聚合

9、酶特有活性 DNA聚合酶聚合酶I 在在DNA复制中所起的作用复制中所起的作用不是不是主要的复制酶主要的复制酶RNARNA引物的切除引物的切除DNADNA损伤的修复：紫外线作用形成的损伤的修复：紫外线作用形成的TTTT二二 聚体的切除聚体的切除链置换：链置换：可能参与遗传重组可能参与遗传重组切口平移（切口平移（nick translationnick translation）探针标记探针标记2 DNA聚合酶聚合酶II不是复制酶，主要在不是复制酶，主要在DNADNA修复中起作用，无修复中起作用，无5 533外切酶活性。外切酶活性。5%DNA5%DNA聚合酶聚合酶I I的活性的活性3 DNA聚合酶聚

10、合酶 III 1972 1972年发现年发现催化效率高，主要复制酶。由催化效率高，主要复制酶。由1010种种亚基组成亚基组成：（1 1）核心聚合酶：）核心聚合酶：5 53 3DNADNA聚合酶活聚合酶活性性 ：3 3-5-5外切酶活性，外切酶活性，控制控制 复制忠实性复制忠实性 ：核心酶的组建：核心酶的组建 （2 2）二聚体：二聚体：构成滑动钳，将全酶构成滑动钳，将全酶固定在固定在DNADNA模板上，提高合成速率（模板上，提高合成速率（20/20/秒秒-750/-750/秒。秒。（3 3）复合物复合物 ：2 2 协助协助 二聚体结合到二聚体结合到 DNADNA E.coli DNA 聚合酶聚合

11、酶不对称二聚体不对称二聚体 DNA聚合酶聚合酶 III形成不对称的二聚体，与形成不对称的二聚体，与DNADNA双链结合，后随双链结合，后随链折叠链折叠1801800 0，使后随链的物理方向，使后随链的物理方向与主导链与主导链一一致，同时催化两条链的复制。致，同时催化两条链的复制。3 5 3 5 3535解链方向解链方向领头链领头链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)35DNA 聚合酶聚合酶 pol pol pol 亚基数目亚基数目 1 7 105 3 聚合聚合酶酶活性活性 +3 5 外切酶活性外切酶活性 +5 3 外切酶活性外切酶活性 +-聚合速度聚合速

12、度(核苷酸核苷酸/分分)1 000-1 200 2 400 15 000-60 000 持续合成能力持续合成能力 3-200 1 500 500 000功能功能 切除引物切除引物,修复修复 修复修复 复制复制大肠杆菌大肠杆菌3种种DNA聚合酶性质比较聚合酶性质比较（三）（三）真核生物真核生物DNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 的作用的作用DNADNA聚合酶聚合酶 :多亚基、多功能酶。多亚基、多功能酶。大亚基：大亚基：DNADNA聚合酶活性。聚合酶活性。100nt/100nt/次次小亚基：引物酶活性，小亚基：引物酶活性，合成合成RNARNA。起始起始DNADNA的合成：合成的合成：合成

13、RNARNA引物和在引物和在RNA3RNA3羟基端合成一段羟基端合成一段DNADNA。DNADNA聚合酶聚合酶 的作用的作用DNADNA聚合酶聚合酶 的的结构结构多亚基组成：多亚基组成：P125 P125 大亚基，催化亚基，含聚合酶和大亚基，催化亚基，含聚合酶和 外切酶活性外切酶活性P50 P50 与增殖细胞核抗原与增殖细胞核抗原(PCNA)(PCNA)结合相关结合相关P66P66P12P12DNA聚合酶聚合酶 的的功能功能主要主要DNADNA复制酶：复制酶：DNADNA聚合酶活性，延伸聚合酶活性，延伸DNADNA链。链。与与RFCRFC和和PCNAPCNA形成形成“全酶全酶”，在，在RFCR

14、FC和和PCNAPCNA等的协同下，促使等的协同下，促使DNADNA聚合酶聚合酶 的解离的解离，DNADNA聚聚合酶合酶 接替接替DNADNA聚合酶聚合酶 继续继续DNADNA链的合成链的合成-DNADNA聚合酶聚合酶 向向DNADNA聚合酶聚合酶 的转换。的转换。复制校正功能：复制校正功能：3 3-5-5外切核酸酶活性外切核酸酶活性DNADNA聚合酶聚合酶 、主要功能：主要功能：DNADNA修复。修复。DNADNA聚合酶聚合酶：线粒体：线粒体DNADNA复制复制 二、真核生物DNA聚合酶附属蛋白 1 1、PCNA：增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nucle

15、ar Proliferating Cell Nuclear Antigen)Antigen)，DNADNA聚合酶的附属蛋白，参聚合酶的附属蛋白，参与与DNADNA的合成，类似的合成，类似 二聚体。二聚体。2 2、RFC：复制因子：复制因子C(Replication C(Replication Factor C)Factor C)。多亚基复合物，。多亚基复合物，DNADNA聚合酶聚合酶的附属蛋白，的附属蛋白，识别引物末端识别引物末端,参与链的延参与链的延长。类似长。类似 复合物。复合物。3、PRP1和和PRP2 Primer Recognition Protein 增加增加DNA聚合酶聚合酶 与

16、模板引物末端的亲和力，与模板引物末端的亲和力，增加增加DNA聚合酶聚合酶 的活性。的活性。PCR 与Taq DNA 聚合酶Taq DNA聚合酶特性聚合酶特性（Taq DNA polymerase）最初由从热泉中的细菌中出来最初由从热泉中的细菌中出来 性质性质具有具有53聚合酶活性以及依赖于聚合作用的聚合酶活性以及依赖于聚合作用的外切酶活性外切酶活性 耐热性耐热性此酶是一种耐热的依赖于此酶是一种耐热的依赖于DNA的的DNA聚合酶聚合酶最适反应温度为最适反应温度为7280 应用应用能以高温变性的靶能以高温变性的靶DNA分离出来的单链分离出来的单链DNA为模板，进行为模板，进行DNA的体外扩增的体外

17、扩增PCR反应。反应。三 引物酶 primase DNA聚合酶不能引发聚合酶不能引发DNA新生链的合成，只能新生链的合成，只能在在已存在的已存在的DNA链链或或RNA链上延长链上延长DNA。引引物酶催化引物物酶催化引物RNA的合成。的合成。四 连接酶 ligase 19671967年发现年发现催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成，二个片段催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成，二个片段必须都与完整的模板链结合。必须都与完整的模板链结合。大肠杆菌的连接酶需大肠杆菌的连接酶需NAD+NAD+，真核细胞的连接酶真核细胞的连接酶需要需要ATPATP。可可连连接接双双链链DNADNA中中的的单单链链切切口口，RNA-

18、DNARNA-DNA杂杂交交体体双双链链单单链链切切口口，不不能能连连接接双双链链RNARNA中中的的单单链链切切口。口。五 与DNA解链和解旋有关的酶五 与DNA解链和解旋有关的酶（一）（一）DNADNA螺旋酶（螺旋酶（HelicaseHelicase）催化双螺旋解旋和解链催化双螺旋解旋和解链需消耗需消耗ATPATP（二）拓扑异构酶（二）拓扑异构酶（Topoisomerase)Topoisomerase)DNA DNA 回旋酶（回旋酶（GyraseGyrase）促进促进DNADNA双链的解开双链的解开,需消耗需消耗ATPATP。兼有内切酶和连接酶活性兼有内切酶和连接酶活性,可迅速使可迅速使D

19、NADNA两条链断开又接上两条链断开又接上,消除解链酶产生的消除解链酶产生的拓扑张力。拓扑张力。当引入负超螺旋当引入负超螺旋时需要由时需要由ATPATP提供能量提供能量,同复制有关。同复制有关。（三）单链结合蛋白（三）单链结合蛋白DNA单链结合蛋白（单链结合蛋白（Single Strand Binding protein，SSB）复制因子复制因子A主要功能：主要功能：与单链亲和力大，稳定单与单链亲和力大，稳定单链结构，保护单链免受核酸酶水解和链结构，保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成，有利复制进行。阻止双链形成，有利复制进行。第二节第二节 DNA 复制的基本过程复制的基本过程复制子复制子 R

20、epliconRepliconReplicon Replicon 基因组中能独立进行复制的基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子结构单位称复制子,或者说单个复制起或者说单个复制起始点控制的始点控制的DNA,DNA,包含从起始位点到终止包含从起始位点到终止位点的全部位点的全部DNADNA。复制的起始位点复制的起始位点 控制并起始复制的控制并起始复制的特定位点。特定位点。终止位点终止位点 终止复制的位点终止复制的位点每个细胞周期启动复制一次。每个细胞周期启动复制一次。复制在复制在特定部位特定部位起始。起始。原核生物仅有原核生物仅有一个一个起始部位。起始部位。真核生物有真核生物有多个多个起始部位。

21、起始部位。复制起始点、复制子与复制叉复制起始点、复制子与复制叉半保留复制，必须解决解开双螺旋的问题。半保留复制，必须解决解开双螺旋的问题。250Mb的的1号染色体，需要旋转号染色体，需要旋转250万次。万次。DNA拓扑异构酶解决了解开拓扑异构酶解决了解开DNA双螺双螺旋的问题旋的问题一一 复制的起始复制的起始（一）起始部位起始部位的序列特征的序列特征 同位素标记显示复制起始在特定部位开始同位素标记显示复制起始在特定部位开始 复制起始点复制起始点:origin,ori:origin,ori DNA复制过程：复制过程：1 1、M M1313噬菌体的起始部位顺序特征噬菌体的起始部位顺序特征 5959

22、bpbp的发夹结构的发夹结构 2 2、大肠杆菌大肠杆菌(OriC)(OriC)的起始部位顺序特征的起始部位顺序特征 240bp240bp的唯一起始部位的唯一起始部位 2 2个区域：个区域：起始蛋白识别结合区起始蛋白识别结合区：4 4个个9 9bpbp重复顺序重复顺序 邻近的邻近的ATAT富含区富含区3 3个个1313bpbp重复顺序重复顺序。大肠杆菌基因组复制起始部位大肠杆菌基因组复制起始部位3 3 3 3、酿酒酵母、酿酒酵母、酿酒酵母、酿酒酵母起始部位顺序特征起始部位顺序特征起始部位顺序特征起始部位顺序特征A:含含ARS一致序列（一致序列（ACS），复制起始识别复合物结合），复制起始识别复合

23、物结合B：增加复制起始位点的效率：增加复制起始位点的效率100200bp4 4 4 4、SV40SV40SV40SV40起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒猴空泡病毒猴空泡病毒猴空泡病毒5211 5220 5230 5240 1 10 20 30CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC T

24、CTGCATAAAT AAAAAAATTAGTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT 反转重复序列反转重复序列 大大T抗原结合部位抗原结合部位 II A/T 富含区富含区 图图3-7 SV40 复制起始部位结构复制起始部位结构复制起始位点特征：独特重复序列独特重复序列起始结合蛋白识别起始结合蛋白识别ATAT富含序列，有利于富含序列，有利于DNADNA双链解旋双链解旋5 5 5 5、起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征起始部位的顺序特征（高等真核生物）（高等真核生物）（高等真核生物）（

25、高等真核生物）多个复制起始点，有人发现任何大于多个复制起始点，有人发现任何大于15kb15kb的的DNADNA就能自主复制。就能自主复制。起始不是随机的，但未发现起始位点的特征序起始不是随机的，但未发现起始位点的特征序列。列。特征：结合复制相关蛋白特征：结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异不同细胞复制起始位点的应用存在差异 （二）（二）起始需要多种蛋白因子参与起始需要多种蛋白因子参与1 噬菌体噬菌体（X174X174）priA priA 识别起始位点，识别起始位点，ATPATP酶活性酶活性priB priB 起始引发起始引发priC p

26、riC 起始引发起始引发DnaT DnaT 起始引发起始引发DnaB DnaB 起始引发起始引发DnaC DnaC 起始引发起始引发,与与DnaBDnaB一起作用一起作用DnaG DnaG RNARNA引物合成引物合成 2 2 大肠杆菌大肠杆菌 DnaA DnaA 识识别别并并结结合合于于oriCoriC区区，有有ATPATP酶酶活活性性，使使ATAT富含区富含区解解链，促进链，促进DnaBDnaB结合形成起始复合物。结合形成起始复合物。DnaB DNADnaB DNA螺旋酶，有解旋和解链作用。螺旋酶，有解旋和解链作用。DnaC DnaC 运输运输DnaBDnaB，形成起始复合物。形成起始复合

27、物。DnaG DNADnaG DNA复制引发酶，合成引物。复制引发酶，合成引物。Hu Hu 促进复制复合物的形成。促进复制复合物的形成。回旋酶回旋酶 松弛正超螺旋，促进单链松弛正超螺旋，促进单链DNADNA产生。产生。单链结合蛋白单链结合蛋白 促进促进DNADNA解链，稳定单链解链，稳定单链DNADNA。3 3 3 3、真核细胞（真核细胞（真核细胞（真核细胞（SV40SV40）真核细胞（真核细胞（SV40）的）的DNA复制至少需要复制至少需要6个蛋白因子参与。个蛋白因子参与。T抗原抗原：N N端为端为DNADNA结合区，识别起始位点，结合区，识别起始位点，C C端具有螺旋端具有螺旋 酶活性，在

28、酶活性，在RFARFA的协助下解开双链。的协助下解开双链。SV40 SV40 编码编码RFA：人单链结合蛋白：人单链结合蛋白拓补异构酶拓补异构酶I或或II：解开超螺旋。：解开超螺旋。复制因子复制因子C（replication facter C,RFC）：形成起始复合物）：形成起始复合物DNA聚合酶聚合酶-引物酶复合物：合成引物，起始引物酶复合物：合成引物，起始DNADNA合成。合成。4 4、真核细胞（真核细胞（真核细胞（真核细胞（YeastYeast）（1）ORC（Origin Recognition Complex）6个亚基组成个亚基组成 在真核生物中相当保守在真核生物中相当保守特异识别特异

29、识别ARS（Autonomously replicating sequence）ORC1p，ORC2p，ORC4p 与与A 元件结合，元件结合，ORC5p与与B元件结合元件结合结合过程需要结合过程需要ATP（2）Cdc6/Cdc18（3）微染色体支持蛋白（）微染色体支持蛋白（Minichromosome maintenance proteins，MCMp）与与DNA发生周期性的作用，与复制叉运动发生周期性的作用，与复制叉运动有关。有关。（4）Cdc45 与与DNA复制起始位点相互作用。复制起始位点相互作用。（三）复制的起始引发（三）复制的起始引发（Priming）合成合成RNA引物的过程引物的

30、过程 单链结合蛋白单链结合蛋白SSB与与M13噬菌体单链噬菌体单链DNA结合，在发夹结构前结合，在发夹结构前6 bp处，处，RNA聚合酶合成聚合酶合成 2030个碱基的个碱基的RNA.破坏发夹结构；破坏发夹结构；SSB结合；结合；DNA聚合酶聚合酶III在在3OH延长延长DNA链。链。DNA聚合酶聚合酶I水解水解RNA，并并补补平缺口，连接酶连接平缺口，连接酶连接。1、M13噬菌体噬菌体priA,priB,priC识别起始点识别起始点在在DnaT帮助下帮助下DnaB,DnaC复合物结复合物结合形成前引发体合形成前引发体引发体引发体引发体可沿着引发体可沿着DNA链移动，在链移动，在合适的位点起始

31、合适的位点起始引物引物RNA的合成的合成引发体的装配只能在起始点，引发体的装配只能在起始点，引物合成可在多处。引物合成可在多处。引发体移动的方向与引发体移动的方向与DNADNA链链延长的方向相反。延长的方向相反。类似冈崎片段的合成类似冈崎片段的合成2、X174DNAPAS：primosome assembly site 3、大肠杆菌大肠杆菌Hu因子促进复合物形成因子促进复合物形成DnaA结合结合OriC富含富含AT区解链区解链2DnaB-DnaC复合物复合物DnaB解链解链4 SV404 SV40T抗原识别起始点和解链抗原识别起始点和解链RFA结合到单链结合到单链DNA拓扑异构酶参与下形成前引发体拓扑异构酶参与下形成前引发体DNApol -引物酶结合形成引发体引物酶结合形成引发体SV40 DNA复制的起始复制的起始