《STAT3在对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤后肝细胞再生中的作用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《STAT3在对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤后肝细胞再生中的作用.pdf（6页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、?在对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤后肝细胞再生中的作用余旺，章 礼 久，路燕，宋 莎 莎安 徽 医 科 大 学 第 二 附 属 医 院 消 化 内 科，合 肥摘 要：目 的 探讨 在对乙酰氨基酚（）致小鼠肝细胞损伤后肝细胞增殖中的作用。方 法 体外培养小鼠正常肝细胞，（、）刺激、或，等体积 作为对照组。筛选出最佳刺激浓度和作用时间后，（、）作用。法检测 细胞活力。检测 中、的 表达水平。法检测、及、表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 检验。结 果 作用 及 后，与对照组比较，各浓度组 细胞活力均降低（值均 ）；浓度为 时，细胞活力分别为 、，与对照组比较差异均有统计
2、学意义（值均 ），能够满足后续实验条件。与对照组比较，（）组、及 的表达均降低（值均 ）；与 组比较，（）组、及 的表达均升高（），因此选择 、刺激时间 来模拟体外损伤 细胞后肝细胞再生的模型。加入，与对照组比较，、组细胞活力变化无统计学意义，余各组细胞活力均降低（值均 ）；与 组比较，（）组和（）组细胞活力降低（值均 ），因此选择 作为后续实验处理浓度。与对照组比较，组 的蛋白水平升高（），而 组、组降低（值均 ）；与 组比较，组、蛋白水平及、表达均降低（值均 ）。结 论 参与 诱导小鼠肝细胞损伤后的细胞增殖，而 作为 抑制剂通过抑制 磷酸化从而抑制 肝损伤后肝细胞增殖。关 键 词：化学性与
3、药物性肝损伤；转录因子；醋氨酚；肝再生中 图 分 类 号：文 献 标 志 码：文 章 编 号：（）：收 稿 日 期：；修 回 日 期：基 金 项 目：国 家 自 然 科 学 基 金 青 年 科 学 基 金 项 目（）作 者 简 介：余 旺（），男，主 要 从 事 肝 胆 胰 疾 病 研 究通 信 作 者：章 礼 久，；路 燕，（，）：（）（，），（，）；，（），（），（），（）；，（），（）；，余 旺，等 在 对 乙 酰 氨 基 酚 所 致 小 鼠 肝 损 伤 后 肝 细 胞 再 生 中 的 作 用 （）；，（）（）（）；，（），（）；，（），：；药 物 性 肝 损 伤 是 严 重 且 致 命
4、 的 药 物 不 良 反 应，对 乙 酰氨 基 酚（）引 起 的 肝 损 伤 占 药 物 性 肝 损 伤 病 例 总 数以 上。是 一 种 临 床 常 用 的 解 热 镇 痛 药 物，当 人 体 过 量 服 用 时，代 谢 产 物 乙 酰 对 苯 醌 亚 胺与 肝 细 胞 蛋 白 结 合，进 而 引 起 肝 损 伤。引 起 肝 损伤 的 机 制 包 括 线 粒 体 损 伤、氧 化 应 激、炎 症 损 伤 以 及 免 疫 相关 机 制 等。肝 再 生 对 于 药 物 性 肝 损 伤 后 肝 衰 竭 患 者的 生 存 至 关 重 要。信 号 传 导 及 转 录 活 化 因 子（）不 仅 是 肝 损
5、 伤 时 介 导 炎 症 的 分 子，同 时 也 是 肝 再 生 过 程 中的 关 键 信 号 分 子。有 文 献 报 道，信 号 分 子 在小 鼠 部 分 肝 切 除 术 后 肝 再 生 中 有 一 定 的 作 用。等及等研 究 表 明信 号 分 子 在诱 导 的 大鼠 肝 损 伤 模 型 中 参 与 肝 细 胞 的 增 殖。而是 否 在诱 导 的 肝 损 伤 后 肝 细 胞 再 生 中 发 挥 作 用 尚 不 清 楚。本 研 究 旨 在 通 过 体 外 实 验 探 究在致 急 性 肝损 伤 后 肝 细 胞 增 殖 过 程 中 的 作 用，为所 致 急 性 肝 损伤 后 的 再 生 修 复
6、提 供 可 能 的 治 疗 依 据。材 料 与 方 法 细 胞 株 与 主 要 试 剂小 鼠 正 常 肝 细 胞 来 源 的细 胞 系 购 自 美 国细 胞 库；培 养基、购 自 美 国公 司；购 自 中 国公 司；、购自 美 国公 司；试 剂 盒 购 自 中 国公 司；、抗 体 购 自 美 国 公 司；、增 殖 细 胞 核 抗 原（）抗 体 购 自 美国公 司；、和特 异 性 引 物 由上 海 生 工 生 物 公 司 合 成。实 验 方 法 细 胞 培 养 和 分 组使 用 培 养 基 将小 鼠 肝 细 胞 株于、培 养 箱 中 进 行 孵育，换 液次。取 对 数 生 长 期细 胞，加 入不
7、 同 浓 度（、）作 用、或，等 体 积作 为 对 照 组，采 用、实 验 检测对细 胞 增 殖 的 影 响，筛 选 出 最 适 作 用 时 间和 浓 度。取 对 数 生 长 期细 胞，（、）作 用 后，加 入继 续 作 用，采 用、法 检 测对细胞 增 殖 的 影 响。实 验 检 测细 胞 的 活 力细胞 常 规 复 苏、传 代、培 养，待 细 胞 生 长 至 对 数 生 长 期 时，胰酶 消 化 后 用 培 养 基 重 悬 细 胞，密 度 。采 用 移 液 器 按 每 孔 将 以 上 细 胞 悬 液 加 至孔 板 中。接 种 后 细 胞 贴 壁 完 全，弃 去 细 胞 上 层 培养 液。实
8、 验 孔 分 别 加 入 预 先 配 制 好 含 不 同 浓 度的 细 胞 培 养 液，的 浓 度 梯 度 设 置 如 下：、。对 照 孔 及 空 白 对 照 孔 均 加 入 等 体 积 培 养 基。每 组 设 置个 复 孔。培 养 箱 中 孵育、后 加 入试 剂，继 续 培 养 后放 至 酶 标 仪 上，在 波 长 下 测 定 各 孔 吸 光 度（，）值。重 复次 实 验。细 胞 活 力 的 计 算 公 式：细 胞活 力（）（实 验 组 空 白 对 照 组）（对 照 组 空 白 对 照 组）。不 同浓 度（、）对细 胞 活 力 的 影 响方 法 同 上。法 检 测 增 殖 相 关 基 因的
9、水 平取 对 数 生 长 期细 胞，胰 酶 消 化 后 制 备 成（）重 悬 液 移 至 培 养 瓶 中，培 养 箱 培 养 后 更 换 培 养 液。分 别 加 入 刺 激，于、后 收 取 细 胞。先 用将 瓶 中 细 胞冲 洗遍 弃 去 上 清，再 加 入 裂 解 液 提 取 细胞 总，随 后 用 罗 氏 法 完 成 细 胞的 逆 转 录，合 成，放 至 冰 箱 保 存。扩 增 用 仪（，），按 预 变 性，变 性，退 火，延 伸 三 步 法 循环 扩 增次，循 环 结 束 后 通 过 溶 解 曲 线 检 测扩 增 产物 特 异 性，以作 为扩 增 实 验 的 内 对 照，按 法 计 算 目
10、 标 基 因 相 对 比 值。检 测对损 伤 的细 胞 增 殖 相 关 基 因的 水平 方 法 同 上。实 验 中 扩 增 所 用 引 物 序 列 具 体 见 表。检 测细 胞 中及 增 殖相 关 蛋 白 的 表 达取 对 数 生 长 期细 胞，胰 酶 消 化后 制 备 成（）重 悬 液 移 至 培 养 皿临 床 肝 胆 病 杂 志 第卷 第期年月 ，中，培 养 箱 培 养 后 更 换 培 养 液。作 用 后，加 入继 续 作 用，处 理 结 束 时细 胞 弃 去培 养 液 后，先 用冲 洗 细 胞次 后 弃 去 上 清，再 加 入裂 解 液 提 取 细 胞 的 总 蛋 白，使 用试 剂 盒
11、及 酶 标仪 进 行 蛋 白 定 量。灌 胶，垂 直 电 泳（浓 缩 胶，；分 离 胶，）和 水 平 电 泳（，）后 蛋 白即 可 转 到膜 上，牛 奶 封 闭 过 夜，接 着 用 一 抗 室温 孵 育 （、），结束 后 用洗 涤次，每 次。用 二 抗 兔 抗 小 鼠（）在 摇 床 上 室 温 孵 育 洗 涤 好 的膜 左 右。用化 学 发 光 显 影 仪 检 测 各 种 蛋 白表 达 水 平，在 电 子 成 像 系 统 中 拍 摄 图 片，整 理 后 采 用软件 分 析 各 目 的 蛋 白 条 带 的 光 密 度 值，标 化 后 进 行 定 量 分 析。伦 理 学 审 查本 研 究 方 案
12、经 由 安 徽 医 科 大 学 实 验动 物 伦 理 委 员 会 审 批，批 号：，符 合 实 验 室 动 物管 理 与 使 用 准 则。统 计 学 方 法采 用 统 计 软 件 进 行 数 据分 析。计 量 资 料 采 用 表 示，多 组 间 比 较 采 用 方 差分 析，进 一 步 两 两 比 较 采 用 检 验。为差 异 有 统 计 学 意 义。结 果不 同 浓 度对细 胞 活 力 的 影 响作 用 及 后，与 对 照 组 比 较，各 浓 度组细 胞 活 力 均 降 低（值 均 ）（表）。浓 度 为 时，细 胞 活 力 分 别 为 、，与 对 照 组 比 较 差 异 均 有 统 计 学
13、意 义（值 均），能 够 满 足 后 续 实 验 条 件。对细 胞 增 殖 相 关 基 因水 平 的影 响取 对 数 生 长 期 细 胞，设 置 对 照 组、（）组，分 别 作 用 和，采 用 法 检测 肝 细 胞 增 殖 相 关 基 因水 平 的 变 化。结 果 显 示，与 对 照 组 比 较，组、及的 水 平 均 降 低（值 均）；组的 水 平 升 高（）。与 组 比 较，组、及 的 水 平 均 升高（值 均 ）（表）。因 此，本 研 究 采 用 、刺 激 时 间 来 模 拟 体 外 损 伤细 胞后 肝 细 胞 再 生 的 模 型。对细 胞 活 力 的 影 响取 对 数 生 长 期细 胞，
14、分 别 加 入（对 照 组）和、，作 用 后 加 入 继 续 作 用，采 用表 引 物 序 列引 物 名 称上 游 引 物（）下 游 引 物（）表 检 测对细 胞 活 力 的 影 响组 别 对 照 组 组 ）组 ）组 ）组 ）组 ）值 值 注：与 同 一 时 间 对 照 组 比 较，）。表 对细 胞 增 殖 相 关相 对 表 达 水 平 的 定 量 分 析 结 果组 别对 照 组 组 ）组 ）值 值 注：与 对 照 组 相 比，）；与 组 比 较，）。余 旺，等 在 对 乙 酰 氨 基 酚 所 致 小 鼠 肝 损 伤 后 肝 细 胞 再 生 中 的 作 用法 检 测对细 胞 及损 伤 后 的细
15、 胞 活 力 的 影 响。结 果 显 示，与 对 照 组 比 较，、组 细 胞 活 力 变 化 无 统 计 学 意 义（值 均），余 各 组 细 胞 活 力 均 降 低（值 均）；与 组 比 较，组 和 组 细 胞 活 力 降 低（值 均）（表）。因 此 选 择 作为 后 续 实 验 处 理 浓 度。表 对细 胞 及损 伤 后 的细 胞 活 力 的 影 响组 别细 胞 活 力对 照 组 组 组 组 ）组 ）组 ）组 ）组 ）值 值 注：与 对 照 组 相 比，）；与 组 比 较，）。检 测细 胞 中、及 增 殖 相 关 蛋 白 的 表 达为 进 一 步 探 讨对诱 导细 胞 损 伤 后 增 殖
16、 降 低 的 可 能 作 用 通 路，采 用 法 检 测、蛋 白 表 达 情 况。结果 显 示，与 对 照 组 比 较，组 的 蛋 白 表 达上 升，组、组 的 蛋 白 表 达下 降（值 均）；与组 比 较，组 的 蛋 白 表 达 下 降（）（图，表）。法 检 测 增 殖 相 关 蛋 白、的 表达 情 况，结 果 显 示，与组 比 较，组 中、蛋 白 表 达 均 降 低（值 均）（图，表）。检 测对损 伤 的细 胞中 增 殖 相 关 基 因的 水 平从水 平 探 究对诱 导细 胞 损 伤 后 增 殖 降 低 的 原因，采 用 法 检 测 肝 细 胞 增 殖 相 关 基 因水平 的 变 化。结
17、果 显 示，与组 比 较，组、及 的 水 平 均 降 低（值 均）（表）。图 法 检 测细 胞 中、蛋 白 表 达 情 况图 法 检 测对损 伤 的细 胞、蛋 白 表 达 的 影 响表 检 测细 胞 中及 增 殖 相 关 蛋 白 表 达 情 况 的 定 量 分 析 结 果组 别 对 照 组 组 ）组 ）组 ）值 值 注：与 对 照 组 相 比，）；与组 比 较，）。表 法 检 测对损 伤 的细 胞 中 增 殖 相 关 基 因的 相 对 表 达 水 平组 别对 照 组 组 组 ）值 值 注：与组 相 比，）。临 床 肝 胆 病 杂 志 第卷 第期年月 ，讨 论是 一 种 重 要 并 且 广 泛
18、表 达 的 蛋 白 质，与 肝 细胞 损 伤、炎 症 及 肝 细 胞 癌 的 发 展 关 系 紧 密。激活 后，通 过 与 胞 质 内个 磷 酸 基 团 结 合 后，接 着 进 入 细 胞核 内 进 行 信 号 传 导，启 动 细 胞复 制 等 生 理 过 程，从而 参 与 细 胞 增 殖。激 活 的可 通 过 调 节 蛋 白 表 达 促 进 细 胞 有 丝 分 裂，使 肝 细 胞 对 生 长 因 子 产 生足 够 的 反 应。肝 毒 性 诱 导 的 肝 再 生 涉 及 多 种 信号 传 导 介 质（包 括 细 胞 因 子、生 长 因 子、血 管 生 成 因 子 及其 他 促 有 丝 分 裂
19、途 径），而 不 同 介 质 之 间 在 不 同 时 期 具 有复 杂 的 相 互 依 赖 作 用。是 一 种 酪 氨 酸 激 酶 抑制 剂，其 能 抑 制信 号 传 导。本 研 究 旨 在 确 定是 否 在引 起 肝 细 胞 损 伤 后 再 生 过 程 中 发 挥作 用，通 过 体 外 实 验 用对 小 鼠 正 常 肝 细 胞造 成 损 伤，加 入抑 制通 路，观 察 对 肝 细 胞增 殖 的 影 响。本 研 究 首 先 通 过实 验 选 择 作 为的 处 理 浓 度，与 组 比 较，组 细胞 活 力 升 高，说 明细 胞 在 浓 度处 理 时 可 能 出 现 损 伤 后 再 生 现 象。检
20、 测细 胞 中水 平 发 现，组 增 殖 相 关基 因表 达 水 平 较 对 照 组 均 降 低，组 增殖 相 关 基 因表 达 水 平 较 组 均 升 高，说明损 伤细 胞 后 细 胞 的 增 殖 较 明显，因 此 本 研 究 采 用 、刺 激 时 间 来模 拟 体 外 损 伤细 胞 后 肝 细 胞 再 生 的 模 型。文献报 道，的能 明 显 下 调磷 酸化 水 平，抑 制 血 管 平 滑 肌 细 胞 增 殖。此 外，有 研 究表明 的能 够 抑 制 宫 颈 鳞 癌细 胞 的增 殖。故 本 实 验 加 入 不 同 浓 度，结 果 提 示 对 细 胞 自 身 活 力 无 明 显 影 响，但（
21、）组 细 胞 活 力 较组 降低，因 此 结 合结 果 及 文 献 最 终 选 择 作 为 后 续 实 验 处 理 浓 度。是 存 在 于 真 核 细胞 核 中 的 一 种 多 功 能 蛋 白，它 作 为复 制 以 及修 复 系 统 的 组 成 部 分 发 挥 着 重 要 作 用。属 于 细胞 核 抗 原，与 细 胞 分 裂 周 期 密 切 相 关，参 与 细 胞 增 殖。作 为 细 胞 周 期 进 程 的 积 极 调 节 者，过 表 达 可 能会 加 速 进 程，促 进 细 胞 增 殖。因 此 本 研 究 选 用、以 及作 为 检 测细 胞 增 殖 的重 要 指 标，同 时 进 一 步 探
22、讨对诱 导 的细 胞 损 伤 后 增 殖 降 低 的 可 能 作 用 通 路。通 过 表得 出，与 对 照 组 比 较，组 蛋 白 水 平 上 升；与组 比 较，组 蛋 白 水 平 下降，提 示可 能 参 与损 伤 肝 细 胞 后 的 增 殖 过 程，而通 过 抑 制磷 酸 化 阻 断 此 过 程。最 后 通 过 及 方 法 检 测 发 现，加 入后，损 伤 后 的细 胞 增 殖 相 关 基 因水 平 及 蛋白 表 达 均 降 低（值 均），证 实参 与损伤 肝 细 胞 后 的 增 殖 过 程。综 上 所 述，诱 导细 胞 损 伤 后 细 胞出 现 明 显 增 殖，参 与诱 导 的 小 鼠 肝
23、 细 胞 损伤 后 的 细 胞 增 殖，而作 为抑 制 剂 通 过 抑 制磷 酸 化 进 一 步 抑 制 肝 细 胞 增 殖 相 关 基 因及蛋 白 水 平 的 表 达，从 而 抑 制肝 损 伤 后 肝 细 胞 增 殖。本 实 验 为致 急 性 肝 损 伤 后 的 治 疗 提 供 理 论 基 础，同 时 为 药 物 性 肝 损 伤 的 治 疗 提 供 新 思 路。利 益 冲 突 声 明：本 研 究 不 存 在 研 究 者、伦 理 委 员 会 成 员、受 试 者 监 护 人 以 及 与 公 开 研 究 成 果 有 关 的 利 益 冲 突。作 者 贡 献 声 明：余 旺 参 与 课 题 设 计，完
24、 成 实 验，论 文 写 作；章 礼 久、路 燕 负 责 课 题 设 计，指 导 撰 写 文 章，修 改 论 文 并最 后 定 稿；宋 莎 莎 负 责 数 据 分 析 及 修 改 论 文。?：，（），（）：，（）：（）许丽娜，李月，彭金咏 与药物性肝损伤 中国临床药理学与治疗学，（）：，：，（），（）：，：，：，（）：（）余朋飞，吴桥，段钟平，等 对乙酰氨基酚致药物性肝损伤的机制研究进展 临床肝胆病杂志，（）：，（）：余 旺，等 在 对 乙 酰 氨 基 酚 所 致 小 鼠 肝 损 伤 后 肝 细 胞 再 生 中 的 作 用 ，：，（）：，（）：，（）：?，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：
25、，（），（）：（）邓颖，史伟浩，童进东，等 对血小板源性生长因子 诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响 复旦学报（医学版），（）：，（）：（）黄进，刘福蓉，温婷，等 红景天苷通过 通路影响宫颈鳞癌 细胞的增殖、侵袭和凋亡 中国肿瘤生物治疗杂志，（）：，（）：，（）：引证本文：，（）：（）余旺，章礼久，路燕，等 在对乙酰氨基酚所致小鼠肝损伤后肝细胞再生中的作用 临床肝胆病杂志，（）：（本 文 编 辑：林姣）国 外 期 刊 精 品 文 章 简 介 通 过 监 测 乙 型 肝 炎 患 者 耐 药 突 变 株 比 例 的 变 化 推 测的 快 速 更 新 周 期【据 年月 报 道】题：通 过 监
26、测 乙 型 肝 炎 患 者 耐 药 突 变 株 比 例 的 变 化 推 测的 快 速 更 新 周期（作 者 等）来 自 南 方 医 科 大 学 南 方 医 院 的 孙 剑 教 授 课 题 组 利 用 两 项 已 结 束 的 随 机 对 照 临 床 研 究 样 本，以 拉 米 夫 定 耐 药（）突 变 位 点 作 为 标 记，以 耐 药 株 相 对 于 野 毒 株 的 比 例 变 化，推 测池 的 更 新 周期。首 先，从 患 者 肝 组 织 中 特 异 性 地 提 取 和 扩 增、和，从 对 应 时 间 点 的 血 清 中 提 取 和 扩增 和 并 进 行 测 序 分 析。在 配 对 的 肝
27、脏 和 血 清 样 本 中，的构 成 比 例 与 血 清 和 肝 内 的构 成 比 例 有 很 强 的 相 关 性（值 分 别 为 和），这 表 明 当 无 法 实 施 肝 活 检 时，血 清可 以 作 为 替 代的 指 标。进 一 步 的 研 究 发 现，在 接 受 替 比 夫 定 治 疗 且 发 生 病 毒 学 突 破 的 患 者 中，血 清 突 变 比 例 从增 加 至 所 需 要 的 时 间 为 周。类 似 地，患 者 转 换 到治 疗后，血 清 突 变 的 比 例 从全 部 恢 复 为 野 生 型 的 时 间 为 周。总 之，本 研 究 通 过 监 测 血 清 突 变 比 例 的 变 化，推 测 出的 更 新 周 期 仅 需 数 月，颠 覆 了 过 去一 直 认 为更 新 周 期 需 要 数 年 的 观 念。这 将 极 大 的 增 强 了 临 床 对 于 乙 型 肝 炎 治 愈 的 信 心，未 来 通 过 多 靶 点 联合 治 疗 的 策 略，彻 底 阻 断的 补 充，原 有池 有 望 在 数 月 内 被 清 除，从 而 实 现 有 限 疗 程 治 愈 乙 型 肝 炎。摘 译 自，（）：（南 方 医 科 大 学 南 方 医 院 感 染 内 科 陆 星 宇 周 彬 孙 剑 报 道）临 床 肝 胆 病 杂 志 第卷 第期年月 ，