《钙粘蛋白在乳腺癌中的表达及意义研究 (1).doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《钙粘蛋白在乳腺癌中的表达及意义研究 (1).doc（45页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、江苏大学硕士学位论文分类号 密级 UDC 编号 JIANGSU UNIVERSITY硕士学位论文MASTERS DISSERTATION论文题目： ZEB1和E-钙粘蛋白在乳腺癌中的 表达及意义研究 学科专业： 外 科 学 作者姓名： 指导教师： 答辩日期： 独 创 性 声 明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法
2、律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 年 月 日学位论文版权授予书本学位论文作者同意学校保留该学位论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保 密 ，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密 。学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期：2013年 月 日 签字日期：2013年 月 日XLV摘 要目的 研究E-钙粘蛋白（E-cadherin）以及转录因子ZEB1在乳腺癌和癌旁组织中的表达情况。对比研究E-钙粘蛋白以及转录因子
3、ZEB1在乳腺癌中的表达情况与相关病理学因素临床病理学因素（年龄、肿块直径、病理组织学分类、组织学分级、TNM分期、淋巴结转移）之间的相互关系。探讨E-钙粘蛋白以及转录因子ZEB1在乳腺癌中的表达与ER、PR、HER-2及Ki-67表达之间的关系。并分析E-钙粘蛋白与ZEB1在乳腺癌表达的相互关联性。进一步探索E-钙粘蛋白与ZEB1在乳腺癌发生发展的细胞分子生物学机制，为临床诊断和治疗乳腺癌提供一定的借鉴作用。方法 采用免疫组织化学技术（超敏型S-P法）检测320例乳腺癌组织和80例乳腺癌旁组织中讨E-钙粘蛋白以及ZEB1的表达情况，对检测到的结果进行统计学分析，确定表达情况的差异是否具有统计
4、学意义。并运用统计学方法对E-钙粘蛋白以及ZEB1的表达情况与患者年龄、肿块直径、病理组织学分类、组织学分级、TNM分期、淋巴结转移、ER、PR、HER-2及Ki-67表达进行分析。并分析E-钙粘蛋白与ZEB1表达之间的关联性。结果 1. E-钙粘蛋白在80例乳腺癌旁组织中仅有2例呈阴性表达，阳性率为97.5%。320例乳腺癌组织中E-cadherin阳性表达的有206例，阳性率为64.4%。E-钙粘蛋白在乳腺癌组织中的表达较之乳腺癌来说相对较低，这些不同的差异从统计学来说具有重要的作用。E-cadherin在乳腺癌中的表达与年龄、肿块直径、病理组织学分类、TNM分期、淋巴结转移显著相关（P0
5、.05）。乳腺癌中E-cadherin表达阳性率与ER表达阳性率之间呈正相关（r=0.215，P0.05）。2. ZEB1在80例乳腺癌旁组织中仅有1例呈阳性表达，阳性率为1.2%。320例乳腺癌组织中ZEB1阳性表达的有79例，阳性率达24.7%。在组织中表达上来看，ZEB1在乳腺癌旁组织很显然低于在乳腺癌组织，两者存在较大的差异，而且对统计学来说具有极大的作用。除此之外，ZEB1在乳腺癌中的表达与病理组织学分类、组织学分级、淋巴结转移显著相关（P0.05）。在乳腺癌中ZEB1表达阳性率与HER-2表达阳性率之间呈正相关（r=0.115，P0.05），与Ki-67表达阳性率之间呈正相关（r=
6、0.141，P0.05）。3. 在乳腺癌中E-cadherin表达阳性率与ZEB1表达阳性率之间的关联性为呈负相关（r=-0.255，P0.05）。结论 E-钙粘蛋白在乳腺癌旁组织中广泛表达，但在乳腺癌组织中表达下调。E-钙粘蛋白的表达伴随着乳腺癌肿块直径越大、TNM分期越高、淋巴结转移越多而降低，并与ER表达阳性率呈正相关。提示在乳腺癌的发生和发展过程中，可能存在上皮-间质化，E-钙粘蛋白在乳腺癌的发生和发展过程中可能起到重要作用。可以推断E-钙粘蛋白是关于乳腺癌非常有意义的生物学指标，通过检测E-钙粘蛋白的表达可为乳腺癌的临床诊断和预后判断提供借鉴参考。1. ZEB1在乳腺癌旁组织中呈现低
7、表达，而在乳腺癌组织中表达明显上调。乳腺癌组织学分级越高、淋巴结转移越多，则ZEB1表达的阳性率越高，且ZEB1表达阳性率与HER-2、Ki-67表达阳性率之间呈正相关。提示ZEB1的表达可能在乳腺癌的侵袭和转移的过程中发挥着重要作用。可以推断在临床中检测ZEB1这项生物学指标，可以为诊断与治疗乳腺癌提供参考。2. E-钙粘蛋白与ZEB1在乳腺癌中的表达具有关联性，E-钙粘蛋白表达阳性率与ZEB1表达阳性率之间呈负相关。提示ZEB1可能参与上皮-间质化过程，ZEB1可能可以对乳腺癌中的E-钙粘蛋白表达进行调节。本研究为乳腺癌的治疗提供了了新的思路，ZEB1可能成为乳腺癌治疗的新靶点。关键词：乳
8、腺癌，E-钙粘蛋白，ZEB1，免疫组织化学33ABSTRACTObjective To observe the expression of E-cadherin and transcription factor ZEB1 in breast cancer and the adjacent noncancerous tissues. To investigate the potential correlation between the expression of E-cadherin and ZEB1 in breast cancer with the clinicopathological
9、features such as age, tumor size, histopathological classification, histological grade, TNM stage and lymph node metastasis. To explore the relationship between the expression of E-cadherin, ZEB1, ER, PR, HER-2 and Ki-67 in breast cancer. To further explore the possible molecular biological mechanis
10、m of E-cadherin and ZEB1 in the development of breast cancer, and to provide some reference in the clinical diagnosis and treatment of breast cancer.Methods Immunohistochemistry test was performed to detect the expression of E-cadherin and ZEB1 in 320 cases of breast cancer and 80 adjacent noncancer
11、ous tissues. The results were analyzed to determine whether the differences was statistically significant. The association was analyzed on the expression between E-cadherin as well as ZEB1 with clinicopathological features such as age, tumor size, histopathological classification, histological grade
12、, TNM stage, lymph node metastasis, ER, PR, HER-2 and Ki-67. We also analyzed the relationship between the expression of E-cadherin and ZEB1 in breast cancer.Results 1. In 80 cases of adjacent noncancerous tissues, only 2 cases were negatively expressed in E-cadherin, the positive rate was 97.5%. In
13、 320 cases of breast cancer tissues, 206 cases were positively expressed in E-cadherin, the positive rate was 64.4%. The expression of E-cadherin in breast cancer was significantly lower than that in adjacent noncancerous tissues (P0.001). The expression of E-cadherin in breast cancer was significan
14、tly correlated with age, tumor size, histological classification, TNM stage and lymph node metastasis (P0.05). There was a positive correlation between the expression of E-cadherin with ER (r=0.215, P0.05).2. In 80 cases of adjacent noncancerous tissues, only 1 cases were positively expressed in ZEB
15、1, the positive rate was 1.2%. In 320 cases of breast cancer tissues, 79 cases were positively expressed in ZEB1, the positive rate was 24.7%. The expression of ZEB1 in breast cancer was significantly higher than that in adjacent noncancerous tissues (P0.001). The expression of ZEB1 in breast cancer
16、 was significantly correlated with histological classification, histological grade and lymph node metastasis (P0.05). There was a positive correlation between the expression of ZEB1 with HER-2 (r=0.115, P0.05) and Ki-67 (r=0.141, P0.05).3. There was a negative correlation between the expression of E
17、-cadherin and ZEB1 in breast cancer (r=-0.255, P50岁178例；肿块直径2cm者133例，2cm且5cm者94例，5cm者93例；浸润性导管癌206例，浸润性小叶癌71例，导管内癌43例；组织学分级，I级97例，II级135例，III级88例；临床TNM分期，I期68例，II期172例，III期53例，IV期27例；淋巴结转移，N0145例，N191例，N256例，N328例。2.1.2主要试剂及配置免疫组织化学试剂，除了个别试剂的保存方式另作说明之外，均保存于4oC冰箱。（1）抗体从北京中杉金桥生物技术有限公司购买的兔抗人E-cadherin单
18、克隆抗体工作液。兔抗人多克隆抗体ZEB1：购自北京Bioss公司。从北京中杉金桥生物技术有限公司购买的鼠抗人单克隆抗体ER、PR、HER-2、Ki-67工作液。（2）试剂盒免疫组化超敏通用型PV6000二步法检测试剂盒，包括3%H2O2去离子水和辣根酶标记通用型二抗（IgG抗体-HRP多聚体），购自北京中杉金桥生物技术有限公司。DAB显色试剂盒，包括浓缩DAB溶液和DAB底物液，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。（3）相关试剂从福州迈新生物技术开发公司购买的PBS磷酸盐缓冲液。从福州迈新生物技术开发公司购买的Citrate梓萌酸盐缓冲液。2.1.3主要仪器设备表2-1 实验的主要仪器设备项目备
19、注光学显微镜日本Olympus石蜡切片机德国Leica图像采集系统日本Olympus超净工作台苏州净化设备仪器厂生物医学专用微波炉Galanz金刚系列-80oC冰箱 SNAY0公司温箱美国Forma Scientific2.2实验方法2.2.1组织芯片的制备（1）在对存档的石蜡组织标本进行选取的时候，需要进行切片，切片的依据是苏木素-伊红(HE)染色的乳腺癌组织及癌旁组织。将切片用HE染色，放在显微镜下面定位观察，选择位点总共400个，包括乳腺癌组织和癌旁组织，需要具有典型性（其中包括320个癌组织癌旁80个)。（2）为了保证组织芯片蜡块标本可以顺利的完成，需要使用半径为0.75毫米的样针，取
20、点时保证各个点位之间的距离了0.5毫米，组织芯片构建仪也必不可少。之后，设定切片的厚度时4m，同时对这一标本进行连续不断的切片。将做好的切片贴附于载玻片上，需要提前用1%多聚赖氨酸对载玻片进行处理。（3）组织芯片一旦完成之后，需要自己留一张以防不时之需，便于日后的观察。同时，需要额外选取几张应用免疫组化S-P法染色。2.2.2免疫组化S-P法检测E-cadherin和ZEB1的表达情况（1）石蜡切片脱蜡第一天，在恒温条件下，把石蜡切片放在56摄氏度的烘箱下经过一整夜之后，第二天，将组织切片烘干，然后浸在二甲苯溶液中10min3，无水乙醇10min1,95%乙醇10min2,75%乙醇10min
21、2。（2）自来水洗去酒精2次，每次3min，蒸馏水洗2min。（3）抗原修复在297毫升的蒸馏水中，将3ml pH6.0的柠檬酸盐修复液加进去，配成抗原修复液，其比例为一比一百，在微波炉中微波四分钟，温度达到100摄氏度时加入石蜡切片，再微波相同的时间，在抗原修复液中浸入石蜡切片，在常温下进行冷却。（4）抗原封闭切片取出来之后，为了去除PBS液，需要进行冲洗3min3, 置入保湿盒之中，每一张切片都组要加一滴试剂，大概50l过氧化物酶阻断剂（A），在常温下放10分钟，保证其活性的消失。之后，同样的过程，同样的步骤，为了去除PBS液，需要进行冲洗3min3, 置入保湿盒之中，每一张切片都组要加一
22、滴试剂，大概50l过氧化物酶阻断剂（B），在常温下放10分钟。（5）一抗封闭将血清甩去，不要洗掉，同时，加上第一抗体，和100l相融合，之后放在冰箱的保湿处经过一整晚的时间。（6）二抗封闭为了去除PBS液，需要进行冲洗3min3, 每一张切片都组要加一滴试剂，大概50l通用型第二抗体，室温下孵育10min。PBS冲洗，3min3，为了去除PBS液，需要进行冲洗3min3, 置入保湿盒之中，每一张切片都组要加一滴试剂，大概50l过氧化物酶阻断剂（D）（7）DAB显色为了去除PBS液，需要加入DAB溶液，至少两滴，在显微镜下进行观察，保证时间至少三分钟，最多十分钟，显色之后将其放在PBS中。（8）
23、复染、水化、脱脂、封片将切片放于自来水中最少1分钟，最多2分钟，用苏木素进行染色，大概五分钟左右，之后再用自来水进行清晰，五分钟到十分钟左右，将水滴甩掉，之后再用PBS进行冲洗。将切片置入烤箱中，盖上盖玻片，置于显微镜下进行观察。2.2.3结果判定（1）E-cadherin染色结果判定：用一抗来代替PBS，作为对照组。这个实验主要是使用阳性细胞百分率结合染色强度来判断蛋白免疫组织化学的结果。随机选取5个高倍镜视野，以棕黄色或者黄色的细胞膜作为阳性细胞，在这一条件之下，在显微镜下显示细胞总数所占的百分比：其中0分的是百分比小于5%，而1分的是百分比在6%到25%之间，2分的是百分比在26%到50
24、%之间，3分的是百分比在51%到75%之间，75% 100%为4分；同时，按照染色强度进行如下计分：显微镜下观察在良好的组织结构及清晰的背景上细胞内出现浅黄色、棕黄色、黄褐色颗粒为阳性，无染色为0分，浅黄色为1分、棕黄色为2分、黄褐色为3分，其中是这样表达E-cadherin异位：一旦在细胞质出现颗粒，主要是黄色的或者棕黄色的。上述两项评分结果相乘，总分6者为阳性表达，总分4分为阳性。（3）ER、PR、HER-2、Ki-67染色结果判定：ER和PR为细胞核里面出现的蓝色，其中阳性细胞的主要表现是细胞核内出现了包括各种颜色的颗粒包括淡黄色等。在显微镜观察下，阳性细胞在总的细胞数量中所占的比例，其
25、中呈现阳性的是比例大于10%，而阴性的比例正好达到10%；同时可以根据细胞核中的染色程度对其进行相应的积分：0分的是没有染色的、1分的是染为浅黄色的、2分的是染成棕黄色的、3分的是染成黄褐色的。除此之外，在显微镜条件下，根据阳性细胞在细胞总数中所占的比例计分：4分为阳性。细胞膜主要用HER-2进行着色，同时分析和判断细胞膜中的细胞所占比例，同时利用“0-3+”积分系统进行分析（详情请见表2-2）。表2-2 对BI-RADS MRI进行评分的重要作用积分评估染色模式0阴性阴性的染色结果可以充分观察到，另外其染色的程度只是表现在一些肿瘤的细胞膜之中1阳性在一些染色强度大于10%的一些肿瘤细胞，可以
26、显示出一些淡颜色，但是只是极小的部分呈现颜色2不确定肿瘤细胞细胞膜在染色强度主要在10%到30%之间3强阳性肿瘤细胞细胞膜的染色强度大于30%2.2.4实验数据处理和统计分析本研究采用SPSS17.0统计软件进行2检验和Pearson相关分析，认为但凡的差异小于0.05，那么在统计学上有很大的作用。2.3 实验结果2.3.1 E-cadherin在乳腺癌中的表达（1）E-cadherin在乳腺癌和癌旁组织中的表达：乳腺癌旁组织上皮细胞中E-cadherin主要表达于细胞膜和/或细胞质，以细胞膜为主（图2-1）。如表2-3所示，E-cadherin在乳腺癌旁组织中广泛表达，80例乳腺癌旁组织中仅
27、有2例呈阴性表达，阳性率为97.5%。乳腺癌细胞中E-cadherin阳性中主要表现为细胞质中，或者是细胞质或细胞膜，见图2。320例乳腺癌组织中E-cadherin阳性表达的有206例，阳性率为64.4%。统计学分析显示，E-cadherin在乳腺癌在组织之中的表达显然比在乳腺癌旁组织要低，这个差异在统计学方面具有极大的意义（P0.001）。图2-1 乳腺癌旁组织上皮细胞中E-cadherin阳性表达（x400）图2-2 乳腺癌组织中E-cadherin阳性表达（x400）表2-3 E-cadherin在乳腺癌和癌旁组织中的表达名称数量E-cadherin表达c2P值阳性（%）阴性（%）乳腺
28、癌组织320206（64.4%）114（35.6%）34.1060.000乳腺癌旁组织8078（97.5%）2（2.5%）（2）E-cadherin在乳腺癌中的表达中和临床病理学的相关数据之间的关系：为了研究和分析相关数据对E-cadherin表达的影响，本研究收集了乳腺癌各个患者之间的各个参数，例如年龄、淋巴结转移等，我们将这些参数与以及其表达的关系从统计学方面进行一定的分析。最终的结果表明，E-cadherin在乳腺癌中的表达和各个因子包括年龄等显著相关（P0.05）（表2-4）。本研究结果显示，乳腺癌患者年龄越小、肿块直径越大、TNM分期越高、淋巴结转移越多，则E-cadherin表达的阳性率越低。而在浸润性小叶癌中E-cadherin表达的阳性率仅有39.4%，远远低于在