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1、病理解剖技术 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望序：病理学的理论和技术被视为一辆车的两个车轮，病理学的理论和技术被视为一辆车的两个车轮，缺一不可，互为依存，互相促进，两者的结合决缺一不可，互为依存，互相促进，两者的结合决定病理学的发展。定病理学的发展。病理学的技术主要体现在几个结合上病理学的技术主要体现在几个结合上1.传统病理学技术与现代生物新技术相结合传统病理学技术与现代生物新技术相结合2.宏观、脏器、组织、细胞、超微与分子基因不同层次技术宏观、脏器
2、、组织、细胞、超微与分子基因不同层次技术相结合相结合3.形态、机能与代谢变化相结合形态、机能与代谢变化相结合4.定性、定位与定量观测相结合定性、定位与定量观测相结合5.实验研究技术与临床应用技术相结合实验研究技术与临床应用技术相结合6.技术的基本原理与具体方法相结合技术的基本原理与具体方法相结合7.基本技术知识与作者实践经验相结合基本技术知识与作者实践经验相结合病理学的发展与使用的工具病理学的发展与使用的工具和方法的更新密切相关和方法的更新密切相关1.用解剖刀剪等进行尸体检查，开展了器官病理学用解剖刀剪等进行尸体检查，开展了器官病理学2.显微镜发明百年之后，建立了细胞病理学显微镜发明百年之后，
3、建立了细胞病理学3.电子显微镜的问世，发展了超微病理学电子显微镜的问世，发展了超微病理学4.免疫组织化学促进了免疫病理学的发展免疫组织化学促进了免疫病理学的发展5.分子生物学带动了分子病理学的兴起分子生物学带动了分子病理学的兴起6.计算机及其网络的应用，将病理学走向信息病理学时代计算机及其网络的应用，将病理学走向信息病理学时代传统病理学技术：传统病理学技术：传统的传统的Formalin固定，石蜡切片和固定，石蜡切片和HE染色技染色技术仍是病理学的基本技术，大量应用与基础和临术仍是病理学的基本技术，大量应用与基础和临床病理学日常工作中，保证和提高常规质量和现床病理学日常工作中，保证和提高常规质量
4、和现代设备水平十分重要。代设备水平十分重要。第一章：病理解剖技术第一章：病理解剖技术一、病理解剖的意义一、病理解剖的意义病理解剖技术是病理学的基础之一，是病理学不可病理解剖技术是病理学的基础之一，是病理学不可分割的一部分。分割的一部分。通过病理解剖收集病理教学及科研资料是其中一个通过病理解剖收集病理教学及科研资料是其中一个途径，大量病理资料的积累促进了医学的发展与进步。途径，大量病理资料的积累促进了医学的发展与进步。病理解剖是通过解剖尸体观察和发现死者器官、组病理解剖是通过解剖尸体观察和发现死者器官、组织的病理变化，找出主要病变，分析判断直接死亡的一织的病理变化，找出主要病变，分析判断直接死亡
5、的一个重要方法。个重要方法。二、病理解剖室的设备和器械二、病理解剖室的设备和器械1.设备：设备：1解剖室的设计要求解剖室的设计要求最好位于太平间；最好位于太平间；室内面积要大，必须有两个门；室内面积要大，必须有两个门；地面用水磨石，四周有排水沟或地漏；地面用水磨石，四周有排水沟或地漏；室内通风好；室内通风好；有消毒室，男女更衣室，浴室等。有消毒室，男女更衣室，浴室等。2解剖台的设计解剖台的设计高低和大小要合适高低和大小要合适台面可用水磨石或不锈钢台面可用水磨石或不锈钢有条件可购置能够升降的解剖台有条件可购置能够升降的解剖台解剖台可带有抽气的功能等解剖台可带有抽气的功能等水磨石台面的解剖台水磨石
6、台面的解剖台水磨石台面的解剖台水磨石台面的解剖台不锈钢台面的解剖台不锈钢台面的解剖台病理解剖器械2.器械：3.清洁、消毒和个人保护清洁、消毒和个人保护1病理解剖室的清洁和消毒病理解剖室的清洁和消毒2病理解剖器械的清洁和消毒病理解剖器械的清洁和消毒3个人保护等个人保护等三、病理解剖的方法和步骤三、病理解剖的方法和步骤1.病理解剖前的准备病理解剖前的准备主要办理一切手续，非常重要。主要办理一切手续，非常重要。2.体表检查体表检查体表检查体表检查尸斑，尸僵尸斑，尸僵3.胸腹腔检查胸腹腔检查1切口切口2腹腔检查腹腔检查3胸腔检查胸腔检查腹腔有渗出液腹腔有渗出液心包积液（血液气管周围血液液体称量4.内脏
7、器官的取出及检查内脏器官的取出及检查一般有两种方法：一般有两种方法：1各脏器分别取出法各脏器分别取出法是病理解剖最常用的方法是病理解剖最常用的方法2多脏器联合取出法多脏器联合取出法此法比较简单，可保持各器官的完整性。此法比较简单，可保持各器官的完整性。心脏表面充血绒毛心双肺和支气管肝脏表面有结节胰腺，出血改变肠管，出血脑脑干出血第二章第二章病理大体标本的制作病理大体标本的制作一、大体标本的收集、取材、固定和保存一、大体标本的收集、取材、固定和保存1.大体标本的收集大体标本的收集通过尸体解剖和活体组织（包括外科手术切通过尸体解剖和活体组织（包括外科手术切除标本和活体组织穿刺标本除标本和活体组织穿
8、刺标本检查时发现并收检查时发现并收集。集。2.大体标本的取材大体标本的取材取材室条件：取材室条件：通风要好，必须有排风通风要好，必须有排风设备；设备；固定的组织取材前要用固定的组织取材前要用流水充分冲洗；流水充分冲洗；排水要远离住宅区等排水要远离住宅区等不同器官的取材和固定不同：不同器官的取材和固定不同：1实质性的器官：如肝、脾等实质性的器官：如肝、脾等要注意，实质器官不容易被固定液所穿透。要注意，实质器官不容易被固定液所穿透。肝癌肝癌肝癌肝癌肝癌肝癌肝癌2空腔器官：如胃、肠等空腔器官：如胃、肠等取材时要看全层，保持粘膜、肌层和浆膜全取材时要看全层，保持粘膜、肌层和浆膜全层的组织。层的组织。胃
9、癌，呈菜花状胃癌，呈菜花状切面的形状切面的形状胃癌，溃疡型胃癌，溃疡型切面的形状切面的形状切面的形状，切面的形状，浸润性至浆膜浸润性至浆膜溃疡型胃癌溃疡型胃癌溃疡型胃癌溃疡型胃癌切面的形状，浸润切面的形状，浸润性至浆膜性至浆膜3肺肺肺组织比较疏松，固定液容易渗透。肺组织比较疏松，固定液容易渗透。肺组织的取材要清楚的了解各叶肺组织所伴随肺组织的取材要清楚的了解各叶肺组织所伴随的支气管。的支气管。A：主支气管B：叶支气管肺肺和和气气管管周周围围的的淋淋巴巴结结肺癌肺癌肺门型肺门型肺癌肺癌肺门与周肺门与周围之间围之间肺癌肺癌周围型周围型肺癌肺癌空洞型空洞型4）其它类型外科手术标本常见：乳腺癌子宫颈癌
10、肠癌卵巢肿瘤等乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌乳腺癌子宫颈癌子宫颈癌子宫颈癌子宫颈癌子宫颈癌，切面3.大体标本的固定大体标本的固定1固定的目的：固定的目的：将受检组织尽快地侵入固定液内，使组织和细胞将受检组织尽快地侵入固定液内，使组织和细胞的固有成分迅速凝固，防治自溶和腐败，使其保持与的固有成分迅速凝固，防治自溶和腐败，使其保持与生活状态有相似的结构，以利于切片和观察。生活状态有相似的结构，以利于切片和观察。2固定液的选择：固定液的选择：A.甲醛（甲醛（Fomaldehyde，又称福尔马林，其浓度在，又称福尔马林，其浓度在4，它是一种还原剂，极易挥发，散发出强烈的刺，它是一种还原剂，极易挥
11、发，散发出强烈的刺激性气体，使人流鼻涕、流眼泪，呼吸道有异物感。激性气体，使人流鼻涕、流眼泪，呼吸道有异物感。B.95酒精（乙醇酒精（乙醇，除具有固定组织的作用外，尚，除具有固定组织的作用外，尚有脱水作用。有脱水作用。3固定液的特性固定液的特性甲醛固定液渗透力强，固定均匀，对组织收甲醛固定液渗透力强，固定均匀，对组织收缩较小，并能增加组织韧性的优点，而且可以保缩较小，并能增加组织韧性的优点，而且可以保存组织内的脂类物质，对组织的主要作用为硬化存组织内的脂类物质，对组织的主要作用为硬化和防腐。和防腐。酒精可以保存组织内的糖类物质及尿酸结晶，酒精可以保存组织内的糖类物质及尿酸结晶，不过，它常使组织
12、明显收缩，且使脂类物质溶解。不过，它常使组织明显收缩，且使脂类物质溶解。4.大体标本的脱水、包埋和切片大体标本的脱水、包埋和切片为能制成满意的切片，固定后的组织还要经过为能制成满意的切片，固定后的组织还要经过脱水、透明、浸蜡及包埋等一系列程序。脱水、透明、浸蜡及包埋等一系列程序。1脱水：目的是将固定了的组织内水分除去。以脱水：目的是将固定了的组织内水分除去。以便使切片时的支撑物（石蜡便使切片时的支撑物（石蜡充分进入组织内。常充分进入组织内。常用的是酒精。用的是酒精。2透明：目的是使能与石蜡结合溶解的媒介剂进透明：目的是使能与石蜡结合溶解的媒介剂进入组织，进而将不能与石蜡结合的脱水剂置换出来，入
13、组织，进而将不能与石蜡结合的脱水剂置换出来，并使组织透明。常用的是二甲苯。并使组织透明。常用的是二甲苯。3浸透和包埋：可使组织具有一定的硬度和韧度，浸透和包埋：可使组织具有一定的硬度和韧度，便于切成薄的切片。常用的石蜡溶点为便于切成薄的切片。常用的石蜡溶点为6062，有时为保存更多的抗原成分。可采用低溶点石蜡有时为保存更多的抗原成分。可采用低溶点石蜡（4850。4切片切片切片机类型：切片机类型：旋转式切片机旋转式切片机滑动式切片机滑动式切片机旋转式切片机旋转式切片机5.HE（HematoxinEosin,HE染色染色1苏木素染色配方：苏木素染色配方：苏木素苏木素1g纯酒精纯酒精10ml钾明矾钾
14、明矾20g蒸馏水蒸馏水200ml氯化汞氯化汞0.5g2伊红染色配方：伊红染色配方：伊红伊红0.5-1g蒸馏水蒸馏水99mlHE染色法：染色法：1苏木素染色苏木素染色57分钟；分钟；2自来水冲洗多余的染液；自来水冲洗多余的染液；31盐酸酒精分化数秒钟，使细胞核呈紫蓝色盐酸酒精分化数秒钟，使细胞核呈紫蓝色4自来水中充分洗涤；自来水中充分洗涤；51氨水中数秒，至返蓝；氨水中数秒，至返蓝；6自来水中至蒸馏水冲洗；自来水中至蒸馏水冲洗；71的伊红染色，的伊红染色，3分钟左右；分钟左右；结果：细胞核呈紫蓝色，细胞浆呈粉红色，基结果：细胞核呈紫蓝色，细胞浆呈粉红色，基底膜，胶原纤维及肌纤维呈粉红色。底膜，胶
15、原纤维及肌纤维呈粉红色。HE切片切片第三章第三章特殊染色特殊染色HE染色虽是一种快速、经济、且易掌握的染色虽是一种快速、经济、且易掌握的方法，但它不能回答病因学、方法，但它不能回答病因学、Z组织发生及发病组织发生及发病机制等方面的许多问题。而特殊染色可以协助机制等方面的许多问题。而特殊染色可以协助解决病理诊断问题。解决病理诊断问题。目前市场上有配制好的特殊染色试剂目前市场上有配制好的特殊染色试剂介绍常用的几种特殊染色介绍常用的几种特殊染色1.脂肪染色脂肪染色主要用于心、肝、肾的脂肪变性，动脉粥样硬化，主要用于心、肝、肾的脂肪变性，动脉粥样硬化，以及因脂肪栓塞导致的死亡病例鉴定等。以及因脂肪栓塞
16、导致的死亡病例鉴定等。1试剂配制：苏丹染液试剂配制：苏丹染液苏丹苏丹III或苏丹或苏丹IV0.5g，70%乙醇乙醇250ml，丙酮，丙酮250ml。2染色方法：染色方法：（1标本常规甲醛固定后流水冲洗标本常规甲醛固定后流水冲洗12h；（2用滤纸吸干标本表面的水分，把标本放入苏丹用滤纸吸干标本表面的水分，把标本放入苏丹III染液中染液中浸泡浸泡30min；（3用用70乙醇分化，以脂肪组织呈橙黄色，其它组织不着色乙醇分化，以脂肪组织呈橙黄色，其它组织不着色为佳；为佳；（4水洗后浸存在水洗后浸存在5甲醛液中，为了防腐可加入适量的防腐甲醛液中，为了防腐可加入适量的防腐剂。剂。肝脂肪变苏丹III染色2.
17、过碘酸过碘酸(periodicacid)-schiff染色，即染色，即PAS染色染色此技术主要显示糖原（在淀粉酶消化对照下此技术主要显示糖原（在淀粉酶消化对照下、中性粘液物质、基底膜、霉菌和寄生虫等。中性粘液物质、基底膜、霉菌和寄生虫等。1schiff氏试剂的配方：氏试剂的配方：（1将将200ml蒸馏水煮沸；蒸馏水煮沸；（2冷却至冷却至90时，慢慢加入碱性复红时，慢慢加入碱性复红1g;（3搅拌并煮沸搅拌并煮沸5分钟使其全溶；分钟使其全溶；（4冷却至冷却至50时过滤，并加入时过滤，并加入1N盐酸盐酸20ml；（5冷却至冷却至25时，再加入无水亚硝酸钠时，再加入无水亚硝酸钠1g并搅拌匀。并搅拌匀。
18、（6置入遮光瓶内并放入在置入遮光瓶内并放入在4冰箱内保存备用。冰箱内保存备用。2PAS染色方法：染色方法：（11过碘酸水溶液染过碘酸水溶液染10分钟，使含有乙二醇的化合物氧分钟，使含有乙二醇的化合物氧化形成醛基；化形成醛基；（2蒸馏水洗去过碘酸；蒸馏水洗去过碘酸；（3schiff氏试剂反应氏试剂反应15分钟，使醛基和分钟，使醛基和schiff氏试剂结合，氏试剂结合，形成紫红色产物；形成紫红色产物；（40.5%亚硝酸钠亚硝酸钠(NaHSO3)处理三次，每次处理三次，每次2分钟；分钟；（5流水冲洗流水冲洗510分钟；分钟；（6用苏木素染色液复染细胞核；用苏木素染色液复染细胞核；7水洗或水洗或1盐酸
19、酒精分化。盐酸酒精分化。3结果：结果：细胞核呈蓝色，基底膜呈红色，胶原纤维、肌纤细胞核呈蓝色，基底膜呈红色，胶原纤维、肌纤维及细胞浆呈红色。维及细胞浆呈红色。过碘酸Schiff反应：糖元及其他PAS反应阳性物质呈红色，细胞核呈蓝色PAS念珠菌（念珠菌（PASPAS染色）染色）附：附：AB/PAS法（阿尔辛蓝过碘酸雪夫染色法法（阿尔辛蓝过碘酸雪夫染色法结果：中性粘液物质呈红色，酸性粘液物质呈蓝结果：中性粘液物质呈红色，酸性粘液物质呈蓝色，中性和酸性粘液的混合物质呈紫色。色，中性和酸性粘液的混合物质呈紫色。阿尔辛蓝阿尔辛黄法：常用于黏液上皮肿瘤的鉴别诊断阿尔辛蓝阿尔辛黄法：常用于黏液上皮肿瘤的鉴别
20、诊断阿尔辛蓝过碘酸雪夫反应：是显示中性和酸性黏液物质的有效方法阿尔辛蓝过碘酸雪夫反应：是显示中性和酸性黏液物质的有效方法HID/AB:高铁二胺奥新蓝法高铁二胺奥新蓝法AB/PAS3.六胺银（六胺银（PASM染色染色在肾脏活体组织检查和一些真菌感染的组织在肾脏活体组织检查和一些真菌感染的组织选用此方法。选用此方法。1PASM染液的配方：染液的配方：2硝酸银水溶液硝酸银水溶液3ml；3六次甲基四胺液六次甲基四胺液25ml；5硼砂硼砂2ml。注：注：2硝酸银配制胺溶液，染色时间硝酸银配制胺溶液，染色时间40分钟，温度分钟，温度5560，随时镜下观察便于控制。，随时镜下观察便于控制。2PASM染色法染
21、色法：（11过碘酸水溶液内染过碘酸水溶液内染10分钟；分钟；（2自来水冲洗，蒸馏水冲洗；自来水冲洗，蒸馏水冲洗；（3入入5铬酸水溶液铬酸水溶液40分钟，出此溶液后用分钟，出此溶液后用1亚硫酸钠除亚硫酸钠除掉铬酸；掉铬酸；（4自来水洗数次，蒸馏水洗自来水洗数次，蒸馏水洗34次；次；（5入六胺银染液（入六胺银染液（506040分钟，分钟，20分钟后，每分钟后，每5分钟分钟镜下观察一次，蒸馏水洗四次；镜下观察一次，蒸馏水洗四次；（6入入0.2%氯化金水溶液氯化金水溶液12分钟，蒸馏水洗三次；分钟，蒸馏水洗三次；（7入入5硫代硫酸钠水溶液硫代硫酸钠水溶液12分钟，蒸馏水洗数次；分钟，蒸馏水洗数次；（8
22、复染复染HE，脱水、透明、封片，脱水、透明、封片结果：结果：底膜呈黑色，网状纤维呈黑色，细胞核呈蓝色，底膜呈黑色，网状纤维呈黑色，细胞核呈蓝色，背景呈粉红色。背景呈粉红色。PASM染色染色PASM染色染色PASMPASM附：附：PASM对真菌的染色对真菌的染色真菌（真菌（fungus，又称霉菌，其种类较多。，又称霉菌，其种类较多。真菌的基本结构成分是含有较多的粘多糖和蛋白质。真菌的基本结构成分是含有较多的粘多糖和蛋白质。1试剂的配制：试剂的配制：（1六次甲基四胺、硝酸银原液（简称六胺银原液六次甲基四胺、硝酸银原液（简称六胺银原液。3六六次甲基四胺水溶液次甲基四胺水溶液100ml，5硝酸银水溶液
23、硝酸银水溶液5ml；（2六胺银硼砂染色液。六胺银原液六胺银硼砂染色液。六胺银原液25ml，蒸馏水，蒸馏水25ml，5硼砂水溶液硼砂水溶液2ml；（3核固红染液。核固红核固红染液。核固红0.1g，硫酸铝，硫酸铝5g，蒸馏水，蒸馏水100ml；（4亮绿染色液。亮绿亮绿染色液。亮绿0.2g，蒸馏水，蒸馏水100ml，冰醋酸，冰醋酸0.2ml。2染色步骤：染色步骤：（15铬酸水溶液氧化铬酸水溶液氧化1小时，流水洗小时，流水洗2分钟，蒸馏水洗分钟，蒸馏水洗2次；次；（2浸入浸入1亚硫酸钠水溶液除掉铬酸亚硫酸钠水溶液除掉铬酸1分钟，流水洗分钟，流水洗5分钟，分钟，蒸馏水洗蒸馏水洗3次；次；（3浸入六胺银硼
24、砂液染色浸入六胺银硼砂液染色11.5小时（小时（4050温箱内温箱内，至切片呈浅棕色，蒸馏水至切片呈浅棕色，蒸馏水3次；次；（4用用0.2%氯化金水溶液调色氯化金水溶液调色3分钟，蒸馏水稍洗；分钟，蒸馏水稍洗；（5核固红染色细胞核核固红染色细胞核10分钟，流水洗，蒸馏水洗；分钟，流水洗，蒸馏水洗；（6亮绿染色液亮绿染色液30秒，用蒸馏水快速稍洗；秒，用蒸馏水快速稍洗；（7无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：结果：真菌均呈黑色，菌丝和孢子呈黑褐色，细胞核真菌均呈黑色，菌丝和孢子呈黑褐色，细胞核呈红色，背景呈淡绿色。呈红色，背景呈淡绿色。念珠菌（假
25、菌丝）念珠菌（假菌丝）新生隐球菌性脑膜炎新生隐球菌性脑膜炎4.淀粉样物质染色（介绍刚果红染色）淀粉样物质染色（介绍刚果红染色）淀粉样物质是一种嗜伊红性物质，性质属于糖蛋淀粉样物质是一种嗜伊红性物质，性质属于糖蛋白成分。组织出现此物质称为淀粉样变性。白成分。组织出现此物质称为淀粉样变性。1试剂配制：试剂配制：（1刚果红染色液。刚果红刚果红染色液。刚果红1g，蒸馏水，蒸馏水100ml；（2Harris苏木素染色液。苏木素染色液。2染色步骤：染色步骤：（1苏木素染色液浸染苏木素染色液浸染2分钟；分钟；（20.5%盐酸乙醇分化数秒钟；盐酸乙醇分化数秒钟；（3流水洗，蒸馏水洗流水洗，蒸馏水洗2次；次；（
26、4刚果红染色液中刚果红染色液中25分钟；分钟；（5无水乙醇迅速脱水无水乙醇迅速脱水2次；次；（6二甲苯透明，中性树胶封固。二甲苯透明，中性树胶封固。结果：结果：淀粉样物质呈红色，细胞核呈蓝色。淀粉样物质呈红色，细胞核呈蓝色。刚果红染色刚果红染色5.Mallory三色染色法（属于结缔组织复合染色法三色染色法（属于结缔组织复合染色法1试剂配制：试剂配制：（1重铬酸钾液。重铬酸钾重铬酸钾液。重铬酸钾2.5g，醋酸，醋酸5ml，蒸馏水，蒸馏水95ml；（2苯胺蓝橘黄苯胺蓝橘黄G液。苯胺蓝液。苯胺蓝0.5g，橘黄，橘黄2g，磷钨酸，磷钨酸1g，蒸馏水蒸馏水100ml；（3酸性复红液。酸性复红酸性复红液。
27、酸性复红0.5g，蒸馏水，蒸馏水100ml。2染色步骤：染色步骤：（1重铬酸钾液重铬酸钾液10分钟；分钟；（2流水洗流水洗2分钟，蒸馏水洗分钟，蒸馏水洗2次；次；（3酸性复红液酸性复红液2分钟，蒸馏水稍洗；分钟，蒸馏水稍洗；（4苯胺蓝液苯胺蓝液20分钟，分钟，95乙醇快速分化；乙醇快速分化；（5直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：结果：胶原和网状纤维呈蓝色，软骨、粘液、淀粉胶原和网状纤维呈蓝色，软骨、粘液、淀粉样变性物质呈淡蓝色，神经胶质纤维、肌纤维和酸样变性物质呈淡蓝色，神经胶质纤维、肌纤维和酸性颗粒呈红色，髓鞘和红细胞呈橘红色。
28、性颗粒呈红色，髓鞘和红细胞呈橘红色。特点：利用酸性复红、苯胺蓝、橘黄特点：利用酸性复红、苯胺蓝、橘黄G这三种染料对结缔组织和这三种染料对结缔组织和非结缔组织进行着色。非结缔组织进行着色。Mallory6.Masson三色染色法三色染色法1试剂配制试剂配制（1Masson复合染色液。碱性复红复合染色液。碱性复红1g，丽春红，丽春红2g，橘黄，橘黄G2g，0.25%醋酸醋酸300ml；（2）亮绿染色液。亮绿）亮绿染色液。亮绿SF0.1g，0.2%醋酸醋酸100ml。2染色步骤染色步骤（1Masson复合染色液复合染色液5分钟；分钟；（20.2%醋酸水溶液稍洗；醋酸水溶液稍洗；（35磷钨酸磷钨酸51
29、0分钟；分钟；（40.2%醋酸水溶液浸洗醋酸水溶液浸洗2次；次；（5亮绿染色液亮绿染色液5分钟；分钟；（60.2%醋酸水洗醋酸水洗2次；次；（7无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结果：结果：细胞核呈红色，基底膜、胶原纤维呈蓝绿细胞核呈红色，基底膜、胶原纤维呈蓝绿色，免疫复合物呈红色。色，免疫复合物呈红色。适用于脑垂体、上皮、甲状腺、神经的正常和肿瘤组织适用于脑垂体、上皮、甲状腺、神经的正常和肿瘤组织Masson肾小球肾小球左：左：HE染色染色右：右：Masson染色，胶原组织呈蓝色，弹力纤维棕色，肌纤维、染色，胶原组织呈蓝色，弹力纤维棕色，肌纤维、
30、纤维素、红细胞呈红色，胞核呈黑蓝色。纤维素、红细胞呈红色，胞核呈黑蓝色。7.弹力纤维染色法弹力纤维染色法病理诊断应用弹力纤维染色，目的是观察组织内弹力病理诊断应用弹力纤维染色，目的是观察组织内弹力纤维是否增生或破坏、断裂和崩解，从而帮助诊断。纤维是否增生或破坏、断裂和崩解，从而帮助诊断。试剂配制：试剂配制：地衣红酒精液地衣红酒精液1g70%酒精酒精100ml浓盐酸浓盐酸1ml结果：结果：Taner-Unna法，弹力纤维呈深棕红色。法，弹力纤维呈深棕红色。Verhoeff铁苏木素染色法，弹力纤维呈黑色。铁苏木素染色法，弹力纤维呈黑色。Verhoeff铁苏木素染色法：弹力纤维黑色或黑蓝色，胞核黑色
31、，胶原纤维呈红色Verhoeff铁苏木铁苏木素染色素染色法法Lendrum纤维纤维素染色法素染色法显示肾小球毛显示肾小球毛细血管腔内血细血管腔内血栓形成栓形成第四章：第四章：免疫组织化学（免疫组织化学（Immunohistochemistry）一定义：一定义：应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位、或定量研本中的某些化学成分进行原位的定性、定位、或定量研究，这种技术称免疫组织化学究，这种技术称免疫组织化学（immunohistochemistry）或免疫细胞化学或免疫细胞化学（immunocytochemi
32、stry），简称免疫组化。免疫组化），简称免疫组化。免疫组化技术是技术是1941年年Coons等学者首创的，随着其理论及技术等学者首创的，随着其理论及技术的发展，目前已发生了日新月异的变化。的发展，目前已发生了日新月异的变化。1免疫组化的方法：免疫组化的方法：1）直接法）直接法2）间接法：）间接法：SPA、PAP、ABC、LAB法等，间接法法等，间接法的灵敏度高于直接法。的灵敏度高于直接法。2标记的物质：荧光染料、放射性同位素，酶（辣根过氧标记的物质：荧光染料、放射性同位素，酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）铁蛋白、胶体金等。化物酶、碱性磷酸酶等）铁蛋白、胶体金等。3根据标记物区分：免疫荧光法
33、、放射免疫法、酶标法和根据标记物区分：免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法。其中免疫荧光法和酶标法应用免疫金银法。其中免疫荧光法和酶标法应用广泛。广泛。反差二免疫组化的基本知识二免疫组化的基本知识1原理原理：抗体与抗原间的结合具有高度的特异性，免疫纽织：抗体与抗原间的结合具有高度的特异性，免疫纽织化学正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某种化学物质化学正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫后获得特异性抗提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫后获得特异性抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的抗原物质。由于抗原与体，再以此抗体去探测组织或
34、细胞中的抗原物质。由于抗原与抗体结合后形成的免疫复合物是无色的，因此还必须借助于组抗体结合后形成的免疫复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来，以期达到对组化或织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来，以期达到对组化或细胞中的未知抗原进行定性、定位甚至定量的研究。组织或细细胞中的未知抗原进行定性、定位甚至定量的研究。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、氨基酸、多糖、胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等，都可以用相应的特磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等，都可以用相应的特异性抗体进行检测。异性抗体进
35、行检测。2.抗原性的保存：上述谈到的抗原或半抗原物质，防止在组抗原性的保存：上述谈到的抗原或半抗原物质，防止在组织或细胞内丢失是非常重要的。在组织处理过程中，如固定、织或细胞内丢失是非常重要的。在组织处理过程中，如固定、包埋、薄切、反应，必须保持其抗原性，特别是选择的固定包埋、薄切、反应，必须保持其抗原性，特别是选择的固定液及包埋方法要十分注意。液及包埋方法要十分注意。3.抗体：抗体是机体受抗原刺激后，由抗体：抗体是机体受抗原刺激后，由B淋巴细胞、特别是淋巴细胞、特别是浆细胞分泌产生的一种与相应抗原发生反应的一种球蛋白，浆细胞分泌产生的一种与相应抗原发生反应的一种球蛋白，即免疫球蛋白（即免疫球
36、蛋白（Immunoglobulin,Ig)，共有五类：，共有五类：IgG,IgA,IgM,IgD,和和IgE，主要分布在血清或外分泌物中，以，主要分布在血清或外分泌物中，以IgG为为主，约占主，约占7080。1抗体的制备方法：抗体的制备方法：A多克隆抗体多克隆抗体（血清抗体（血清抗体：指机体接受抗原主动免疫或被动：指机体接受抗原主动免疫或被动免疫后从血清中分离提纯的抗体。免疫后从血清中分离提纯的抗体。B单克隆抗体单克隆抗体：是：是1975年由年由KohlenhMilstein发明的一种新技发明的一种新技术。其原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫的脾细胞相融合，术。其原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫
37、的脾细胞相融合，产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化，能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化，成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，即单克隆成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，即单克隆抗体（抗体（monoclonalantibody,McAb)2)单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较特性特性多克隆多克隆单克隆单克隆组成组成多种类抗体的混合物多种类抗体的混合物单一种类的抗体单一种类的抗体特异性特异性低针对多个抗原决
38、定族低针对多个抗原决定族高针对单一的抗原决定族高针对单一的抗原决定族亲和力亲和力平均亲和力较高平均亲和力较高不定，较低不定，较低交叉反应交叉反应高高低低4抗原与抗体的特异性结合抗原与抗体的特异性结合抗原与抗体的结合具有高度的特异性。在抗体的轻链和重抗原与抗体的结合具有高度的特异性。在抗体的轻链和重链的可变区中有链的可变区中有3个特殊的易变部位，即在第个特殊的易变部位，即在第30位、位、50一一60位和位和第第100位氨基酸残基附近，这些部位称为超变区。超变区直接参位氨基酸残基附近，这些部位称为超变区。超变区直接参与抗原接合部位的组成，形成的接合部位是一个浅平穴槽，槽与抗原接合部位的组成，形成的
39、接合部位是一个浅平穴槽，槽大小约大小约I.5nm0.6nm0.6nm抗原决定族在空间呈互补性地嵌入抗原决定族在空间呈互补性地嵌入槽内，借分子间的范德华力、疏水作用静电引力以及氢键而相槽内，借分子间的范德华力、疏水作用静电引力以及氢键而相互结合。抗原与抗体分子的结合不受两者数量比例的限制，但互结合。抗原与抗体分子的结合不受两者数量比例的限制，但如要出现肉眼可见的反应，如要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需有一定的适当则抗原与抗体的量需有一定的适当的比例，否则在抗原与抗体过量的情况下，不能聚合成大颗粒，的比例，否则在抗原与抗体过量的情况下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可见的反应。因此不能
40、出现肉眼可见的反应。三免疫组织化学的基本技术（一取材1实验动物：麻醉（处死，锋利刀片切成大小适中，厚度3mm4mm;小型实验动物：灌注（流）固定（生理盐水和4多聚甲醛取材2人体材料：活检组织、手术标本、细胞和组织（二二）固固定定：原原则则是是保保持持组组织织形形态态良良好好和和被被检检测测抗抗原原的的前前提提下下，应应采采用用浓浓度度最最低低的的固固定定剂剂和和最最短短的的固固定定时时间间，固固定定时时间间一一般般为为112h。1常用的固定剂：常用的固定剂：1）甲甲醛醛缓缓冲冲液液：广广泛泛应应用用于于病病理理标标本本的的固固定定，甲甲醛醛在在很很好好地地保保护护组组织织形形态态结结构构完完整
41、整的的同同时时也也有有效效地地保保存存某某些些抗抗原原。由由于于甲甲醛醛的的交交联联作作用用会会影影响响被被固固定定细细胞胞膜膜的的通通透透性性不不利利于于染染色色时时抗抗体体的的渗渗透透，因因此此染染色色前前常常用用酶酶进进行行消消化化以以使使抗抗原原决决定定簇簇充充分分暴暴露露，固定时间不直超过固定时间不直超过24h。2）4多聚甲醛磷酸缓冲液：广泛应用于光镜细胞化学研究。多聚甲醛磷酸缓冲液：广泛应用于光镜细胞化学研究。3）戊戊二二醛醛多多聚聚甲甲醛醛缓缓冲冲液液：适适用用于于光光镜镜、电电镜镜免免疫疫组组织织化化学学研究。研究。4）其其它它：如如PLP液液（过过碘碘酸酸赖赖AA多多聚聚甲甲
42、醛醛固固定定液液）、丙丙酮酮及醇类、锇酸等。及醇类、锇酸等。2固定注意事项：固定注意事项：1）固定液的选择标准：）固定液的选择标准：A.组织形态结构保存良好；组织形态结构保存良好；B.最大限度最大限度保存抗保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是应用最广的固定剂。原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是应用最广的固定剂。2）组织块的大小：）组织块的大小：1.5cm1.5cm0.5cm为宜。为宜。3）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。反比。4）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时可放
43、置在可放置在4冰箱。冰箱。5固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。（三）包埋：（三）包埋：1.石蜡包埋；石蜡包埋；2.冷冻包埋；冷冻包埋；3.环氧树脂包理。环氧树脂包理。（四）切片：（四）切片：1.载玻片的处理：载玻片的处理：1）清洗）清洗；2）涂胶（防止脱片）涂胶（防止脱片）常用粘附剂：常用粘附剂：明胶：铬矾明胶和甲醛明胶；明胶：铬矾明胶和甲醛明胶；树脂胶：树脂胶：也称白胶；也称白胶；多聚赖氨酸（多聚赖氨酸（PLL）；）；商品化粘附剂。商品化粘附剂。2.切片类型：切片类型：l）石蜡切片：厚约）石蜡切片：厚约35m放置放置37温箱烘烤过夜，温箱烘烤过夜，以
44、减少脱片。以减少脱片。2）冷冻切片：）冷冻切片：2m。3）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要用胶水粘在）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要用胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作电镜包埋。载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作电镜包埋。神经组织应用神经组织应用较多。较多。四免疫组化染色过程中的基本技术四免疫组化染色过程中的基本技术（一）蛋白酶消化技术（一）蛋白酶消化技术进进行行固固定定时时，抗抗原原决决定定簇簇有有可可能能被被固固定定剂剂所所封封闭闭，因因此此在在抗抗原原抗抗体体反反应应前前，常常用用蛋蛋白白酶酶处处理理组组织织切切片片，使使抗抗原原决决定定簇簇
45、充充分分暴暴露露出出来来，并并使使组组织织的的通通透透性性增增高高，以以利利抗抗原原抗抗体体最大限度地结合增强特异性染色。最大限度地结合增强特异性染色。1常用的消化酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶常用的消化酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶2消消化化时时间间：因因组组织织而而异异，一一般般为为530分分钟钟，消消化化时时间间不不宜宜太太长长，以以免免损损伤伤组组织织形形态态，破破坏坏抗抗原原决决定定族族。消消化化结结束束后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。后要充分洗涤，以除去残留的蛋白酶。1）非特异染色的控制）非特异染色的控制非非特特异异染染色色或或背背景景染染色色是是指指在在免免疫疫组组化化染染色色过过程程中中凡凡
46、不不属属于特异性抗原抗体反应所出现的染色。于特异性抗原抗体反应所出现的染色。1原因分析：原因分析：组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶、内源性生物素等；性磷酸酶、内源性生物素等；试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。2消除方法：消除方法：A.加加1抗前加正常血清抗前加正常血清1030分，以封闭组织中带电荷的基分，以封闭组织中带电荷的基因，避免与因，避免与1抗的非特异性结合。抗的非特异性结合。B.减少非特异性染色：减少非特异性染色：a免疫酶组化染色时，
47、在加免疫酶组化染色时，在加1抗前，用抗前，用0.3的的H2O2甲醇溶甲醇溶液将组织切片处理液将组织切片处理30分（若是分（若是3的的H2O2甲醇溶液处甲醇溶液处理理510分）。分）。b免疫荧光染色时，可用免疫荧光染色时，可用0.010.05伊文思蓝稀释荧光伊文思蓝稀释荧光抗抗体。体。（二）对照实验（二）对照实验阳性对照片：用已知抗原为阳性的标本作对照。阳性对照片：用已知抗原为阳性的标本作对照。阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照。阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照。（三）抗体的分装、稀释、滴加及保存（三）抗体的分装、稀释、滴加及保存1抗体的分装：不能用完的抗体分装在小的抗体的分装：不
48、能用完的抗体分装在小的EP管内，保存在管内，保存在-20-40的低温冰箱中持用可保持数年有效。的低温冰箱中持用可保持数年有效。2抗体稀释：常用抗体稀释：常用0.01MPBS（磷酸缓冲溶液）或（磷酸缓冲溶液）或BSA（牛血清白蛋白）（牛血清白蛋白）3滴滴加加：滴滴加加的的抗抗体体要要充充分分覆覆盖盖组组织织切切片片，一一般般加加3050l，最最好好在在滴滴加加前前，用用蜡蜡笔笔或或特特制制的的组组化化笔笔在在组组织织周周围围画画一一圈圈，以以防防溶液的扩散。溶液的扩散。4保保存存：未未用用完完的的抗抗体体可可在在低低温温冰冰箱箱或或冻冻干干保保存存，已已稀稀释释未未用完的抗体最好在一周内用完，不
49、宜长期保存。用完的抗体最好在一周内用完，不宜长期保存。（四）免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术（四）免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术1免疫酶染色原理：免疫酶染色原理：用酶作为标记物，可分为直接法、间接法、补体法、免疫用酶作为标记物，可分为直接法、间接法、补体法、免疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAP法）和双法）和双PAP法等。法等。1）直接法原理：用酶直接标记在特异性）直接法原理：用酶直接标记在特异性1抗上，与标本中的抗上，与标本中的抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗原抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗
50、原抗体反应部位，即可在镜下对标本的抗原进行检测。抗体反应部位，即可在镜下对标本的抗原进行检测。优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。2）间接法原理：先用标记的特异性）间接法原理：先用标记的特异性1抗与标本中相应抗原结抗与标本中相应抗原结合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（2抗）孵育，然后再加抗）孵育，然后再加酶的底物，显示抗原抗体抗原抗体复合物存在的部酶的底物，显示抗原抗体抗原抗体复合物存在的部位，以对抗原进行检测。位，以对抗原进行检测。如：如：1抗是由免产生的多克隆抗体：抗是由免产生的多克隆抗体：则则2抗常用羊抗兔抗常