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1、第三章植物脱毒技术现在学习的是第1页，共47页第一种类型为曾经或正在大面积或高比率发生，第一种类型为曾经或正在大面积或高比率发生，并造成严重为害的植原体病害，主要包括枣疯病和泡桐丛枝病。第二类型为局部或零星发生病害类型，第二类型为局部或零星发生病害类型，山楂丛枝病严重地区约占20%左右。桃树黄化病和红叶病的发生面积较大，第三种类型为国内外引种或国内苗木调运而传入病害类第三种类型为国内外引种或国内苗木调运而传入病害类型，型，比较典型的为从以色列引进的樱桃扁枝病和黄化病。1995年北京中以示范农场从以色列引进一年生的经嫁接的6个欧洲樱桃品系的苗木3500株，栽植当年即发现患带化病苗木，199519
2、96年度的发病率为3%。在从国内其它地区引入的樱桃、枣树、泡桐等新品种苗木上也都发现带病苗木。第一节第一节 植物脱毒的意义一、病毒病危害一、病毒病危害现在学习的是第2页，共47页二、植物脱毒的意义 “脱毒苗”或“无病毒苗”，是指不含有该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现为阴性反应的苗木。通过植物组织培养方法生产无病毒种苗可以同时除去真菌、细菌和线虫的寄生，因此产量大幅度增加，最高可增产300，平均增产也在30以上。枣疯病枣疯病辣椒病毒病辣椒病毒病 番茄病毒病番茄病毒病现在学习的是第3页，共47页第二节植物脱毒方法一、茎尖分生组织培养脱毒 二、热处理脱毒三、热处理结合茎尖
3、脱毒四、其它脱毒方法现在学习的是第4页，共47页一、茎尖分生组织脱毒一、茎尖分生组织脱毒(一）通过茎尖培养脱毒的原理一）通过茎尖培养脱毒的原理1、病毒在植物体内的分布茎尖和根尖分生组织不含病毒粒子或病毒浓度很低，是因为病毒在寄主植物体内随着维管系统转移，在根尖与茎尖分生组织中没有维管束系统，病毒运动很困难。病毒在寄主茎尖分生组织中的转移速度落后于茎尖的生长速度，导致顶端分生组织附近病毒浓度低，甚至不带病毒，通过茎尖（根尖）离体培养便可获得无病毒再生植株。2、茎尖大小与脱毒效果用于脱毒的茎尖外植体可以是顶端分生组织即生长点，最大直径0.1mm，也可以是带13个叶原基的茎尖。茎尖外植体的大小与脱毒
4、效果成反比。外植体过小，存活困难，生长缓慢，操作难度大。但茎尖外植体过大，脱毒效果差。通常以带13个幼叶原基的茎尖作外植体较合适。现在学习的是第5页，共47页现在学习的是第6页，共47页现在学习的是第7页，共47页现在学习的是第8页，共47页现在学习的是第9页，共47页（二）茎尖脱毒的方法（二）茎尖脱毒的方法1、取样与消毒取病害相对较轻的植株，可以从选定的植株上取顶芽梢段进行消毒接种。也可从室内培养12个月并进行热处理的盆栽扦插苗上，采顶芽与侧芽消毒接种，消毒方法：取顶芽梢段35cm，剥去大叶片，自来水冲洗，75酒精浸泡30秒左右，用0.1升汞消毒10分钟，最后用无菌水冲洗45次。现在学习的是
5、第10页，共47页2、拨取茎尖与接种在超净工作台上，用解剖刀将仔细剥离幼叶，在超净工作台上，用解剖刀将仔细剥离幼叶，至出现裸露的生长点，用刀尖切下带至出现裸露的生长点，用刀尖切下带12个叶原基的生长点，将切下的茎尖转移至培个叶原基的生长点，将切下的茎尖转移至培养基上，每管接养基上，每管接12个茎尖。个茎尖。现在学习的是第11页，共47页现在学习的是第12页，共47页现在学习的是第13页，共47页现在学习的是第14页，共47页3、培养、培养接种后的材料在接种后的材料在252，每天光照，每天光照1016h条件下培条件下培养。培养养。培养2个月左右，在茎尖再生出小绿芽，小的茎个月左右，在茎尖再生出小
6、绿芽，小的茎尖则需尖则需3个月以上，有的甚至更长时间才发生绿芽。个月以上，有的甚至更长时间才发生绿芽。其间应更换新鲜培养基。其间应更换新鲜培养基。4、生根诱导、生根诱导一些植物茎尖培养形成绿芽后，基部很快发生不一些植物茎尖培养形成绿芽后，基部很快发生不定根，而另一些植物不产生不定根，必须将无根定根，而另一些植物不产生不定根，必须将无根绿苗再诱导，才能生根成为完整植株。方法：将绿苗再诱导，才能生根成为完整植株。方法：将23cm高的无根苗转入生根培养基，继续培养高的无根苗转入生根培养基，继续培养12个月即可形成根。个月即可形成根。现在学习的是第15页，共47页茎尖培养脱毒过程图 现在学习的是第16
7、页，共47页 茎尖剥离（1）现在学习的是第17页，共47页 茎尖剥离（2）现在学习的是第18页，共47页现在学习的是第19页，共47页（三）影响茎尖脱毒培养的因素（1）茎尖大小：茎尖大小与脱除病毒的效果成反相关，即剥取茎尖越小，脱毒效果越好。但茎尖大小与茎尖的成活率成正相关，即茎尖越小培养难度越大，成活率越低。考虑到脱毒效果及提高成活率，一般切取0.20.5 mm带12个叶原基的茎尖为培养材料。（2）培养条件：在茎尖培养中，光下培养的效果通常比暗培养效果好。（3）外植体的生理状态：茎尖最好从活跃生长的芽上切取，一般地培养顶芽茎尖比培养腋芽茎尖效果好。现在学习的是第20页，共47页二、热处理脱毒
8、1.1.原理原理 利用病毒耐热性差的特点，将植物组织置于高于正常温度的环境中，组织内部的病毒受热以后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。现在学习的是第21页，共47页2.热处理的方法(1)(1)温汤浸渍处理温汤浸渍处理 适用于休眠器官、剪下的接穗或种植材料的脱毒处理。方法是将材料放在5055的温水中浸渍数分钟至数小时。此方法简便易行，但易造成材料受伤。(2)(2)热空气处理热空气处理 适用于生长期植物材料的脱毒处理。设备可采用有照明、通风、调温、给水动能的培养箱。方法是将待处理植株先进行盆栽，成活后移入3540的培养箱中处理几十分钟至几个月。现在学习的是第22页，共47页3.热
9、处理脱毒的优点与局限性(1)(1)优点：优点：对设备要求不高，技术简单，短时间可除去病毒。(2)(2)局限性：局限性：热处理不能脱除所有病毒，此法只对那些球形病毒和线形病毒有效。而对杆状病毒不起作用。同时同样的处理效果也不一样（具有不确定性）。对植株有伤害，只有部分植株成活。对寄主植物进行较长时间的高温处理有可能钝化植物组织中的阻抗因子，使寄主植物中抗病毒因子难于活化，从而增加无效植株的发生率。现在学习的是第23页，共47页三、热处理结合茎尖脱毒1 把切取的草莓芽洗净后把切取的草莓芽洗净后2 先经过高温短时间热处理，杀死部分病毒；先经过高温短时间热处理，杀死部分病毒；3 然后在无菌条件下对经过
10、处理的材料，在解剖镜下解剖，然后在无菌条件下对经过处理的材料，在解剖镜下解剖，4 切取分生组织尖端切取分生组织尖端0.2-0.3mm生长点，生长点，5 迅速接种到最佳启动培养基上，在迅速接种到最佳启动培养基上，在25下暗培养。下暗培养。6 待长出愈伤组织后转入光培养，待长出愈伤组织后转入光培养，7 接种到另一种丛芽培养基上，即产生丛生芽及绿苗。接种到另一种丛芽培养基上，即产生丛生芽及绿苗。8 将绿苗接种在生根培养基上，将绿苗接种在生根培养基上，9 20天后待根长天后待根长2-5cm时即可炼苗移栽，成活率达到时即可炼苗移栽，成活率达到95%以上以上。现在学习的是第24页，共47页四、其它组织培养
11、脱毒方法四、其它组织培养脱毒方法（一）愈伤组织培养脱毒（一）愈伤组织培养脱毒将感染病毒的组织离体培养获得愈伤组织，再诱导愈伤将感染病毒的组织离体培养获得愈伤组织，再诱导愈伤组织分化成苗，从而获得无病毒植株的方法组织分化成苗，从而获得无病毒植株的方法（二）珠心胚培养脱毒（二）珠心胚培养脱毒柑橘类种子多为多胚种子，除具有合子胚外，还有柑橘类种子多为多胚种子，除具有合子胚外，还有多个珠心胚。珠心胚由珠心组织细胞即体细胞分化多个珠心胚。珠心胚由珠心组织细胞即体细胞分化形成，具有和母体相同的遗传特性。病毒一般不通形成，具有和母体相同的遗传特性。病毒一般不通过种子传播，因而通过珠心胚培养获得的再生植株过种
12、子传播，因而通过珠心胚培养获得的再生植株是无毒的，同时保存了母株的遗传特性。是无毒的，同时保存了母株的遗传特性。现在学习的是第25页，共47页（三）茎尖微体嫁接（三）茎尖微体嫁接现在学习的是第26页，共47页试管内嫁接法试管内嫁接法接穗砧木培养基无毒苗无毒苗微枝茎尖现在学习的是第27页，共47页（四）花药培养脱毒草莓花药培养可产生无病毒植株。草莓花药培养脱毒率高于茎尖脱毒苗率，一般可达80以上，有些报道可达100 现在学习的是第28页，共47页（五）低温处理（五）低温处理 低温处理又称冷疗法。适当增加低温处理时间可提高脱毒效果。菊花植株在5下，经47.5个月处理后，切取茎尖进行离体培养，可以有
13、效去除菊花矮化病毒与菊花褪绿斑驳病毒，仅茎尖培养则无此效果，目前低温脱毒的报道尚少，但不失为一种脱毒的方法。现在学习的是第29页，共47页（六）化学处理许多化学药品（包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等）在植物体内和植物叶片内，进行其抑制病毒的增殖或使之不活化的测定，在某种程度上抑制了病毒的增值或不活化。整株植物用化学疗法不能除去病毒，但离体培养和原质体培养效果明显。现在学习的是第30页，共47页第三节 脱毒苗的鉴定 （一）指示植物检测法 （二）抗血清检测法 （三）酶联免疫吸附检测法 （四）其它鉴定方法 现在学习的是第31页，共47页（一）指示植物检测法 指示植物检测是利用病毒在植物体上产生
14、指示植物检测是利用病毒在植物体上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的依据，也叫枯斑测的枯斑作为鉴别病毒种类的依据，也叫枯斑测定法。这种专门用以产生局部病斑的寄主称为定法。这种专门用以产生局部病斑的寄主称为指示植物，又称鉴别寄主。指示植物，又称鉴别寄主。现在学习的是第32页，共47页1.汁液涂抹法：汁液涂抹法：待鉴待鉴试管苗试管苗取幼叶取幼叶1-3g加水和磷酸加水和磷酸缓冲液研磨缓冲液研磨纱布纱布过滤过滤指示植物上涂指示植物上涂一薄层金刚砂一薄层金刚砂手指蘸滤手指蘸滤液摩擦液摩擦5min后冲去叶面后冲去叶面汁液和金刚砂汁液和金刚砂至于至于温室中温室中2-6天天观察观察没有出现没有出现 不含病毒不含病毒出
15、现枯斑出现枯斑 有病毒有病毒现在学习的是第33页，共47页2.嫁接鉴定法：嫁接鉴定法：适用于木本多年生果树和草莓、甘薯等无性繁殖的草本植物，采用汁液接种法比较困难，通常采用嫁接接种的方法，以指示植物作砧木，被检测植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接。现在学习的是第34页，共47页对指示植物的要求应根据不同的病毒选择适合的指示植物。所选指示植物一年四季都容易栽培。能够在较长时期内保持对病毒的敏感性。容易接种。较广的范围内具有同样的反映。指示植物一般有两种类型：一种是接种后产生系统性症状，其出现在病毒扩展到的植物非接种部位，通常没有局部病斑明显；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环斑
16、构成。现在学习的是第35页，共47页指示植物检测法的优缺点 (1)优点：条件简单，操作方便，是一种经济有效的检测方法，所以大多数植物检测用指示植物检测法。(2)缺点：不能测出病毒总的核蛋白浓度，而只能测出病毒的相对感染力。现在学习的是第36页，共47页（二）抗血清检测法 抗体是动物在外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白，抗体主要存在于血清中，含有抗体的血清即称为抗血清。不同病毒产生的抗血清都有各自的特异性，因此抗血清在病毒的检测中成为一种高度专化性的试剂，其特异性高，检测速度快，一般几小时甚至几分钟可以完成。现在学习的是第37页，共47页1.检测方法抗原的制备：病毒的接种繁殖病叶的研磨病毒的提
17、纯。抗血清的制备：动物的选择和饲养抗原的注射抗血清的采集（采血）抗血清的分离抗血清的保藏。抗血清检测（免疫反应）：有叶绿体凝聚法、块茎沉淀法、环形接口法、酶联免疫法等方法。现在学习的是第38页，共47页2.抗血清检测法的优缺点 (1)优点：特异性强，灵敏度高；操作简便、安全、快速；无需特殊仪器设备，结果容易判断；可同时检测大量的样品。(2)缺点：抗血清来源困难，成本高，常规检测应用较少。现在学习的是第39页，共47页（三）酶联免疫吸附检测法 现在学习的是第40页，共47页现在学习的是第41页，共47页（四）其它鉴定方法 病毒颗粒一般小于0.1um的微粒，人的眼睛观察不到，光学显微镜仅观察200
18、nm的微粒，而电子显微镜则将分辨能力增大至0.5nm。通过电子显微镜在病毒的薄样品或部分纯化的病毒悬浮液中容易观察到。采用电子显微镜法鉴定病毒，直接观察有无病毒颗粒存在，并观察有关病毒颗粒大小、形状和结构，由于这些特征稳定，对病毒鉴定有很大的作用。这种检测方法，需要一定的设备，常规检测应用较少。1、电镜检测法现在学习的是第42页，共47页2、分子生物学检测法、分子生物学检测法 待测脱毒植物病毒总待测脱毒植物病毒总DNA序列序列 ACGGGTTATCGGTCGAATAACACGGGCAATTTTACGATTAGACTAACGGGGAGAC TGCCCAATAGCCA 引物引物 TGCCC 随机引
19、物随机引物 ACGGGTTATCGGTCGAATAACACGGGCAATTTTACGATTAGACTAACGGGGAGAC TGCCC AATAGCCAGCTTATTGTGGCCCTTAAAATGCTAAT TGCCC TGCCCACGGGTTATCGGTCGAATAACACGGGCAATTTTACGATTAGACTAACGGGGAGACTGCCC AATAGCCAGCTTATTGTGCCCGTTAAAATGCTAATCTGATT GCCC CTCTGTGCCC TGCCC TGCCC（1）PCR检测法检测法现在学习的是第43页，共47页病毒标准谱带 待测植物谱带 A随机引物 B已知引物1kb
20、300025001500800400100病毒标准谱带 待测植物谱带 1 2 3 4 5 6 7 8待测植物无谱带琼琼脂脂凝凝电电泳泳板板 琼脂凝电泳板+-现在学习的是第44页，共47页（2）核酸杂交技术）核酸杂交技术(NAH)NAH技术是根据单链可以相互结合的原理，将一段病毒特异的核酸序列加以标记制成探针，再与待测样品的核酸杂交，杂交信号能指示病毒的存在。核酸杂交技术适用于DNA、RNA病毒及类病毒的检测，具有灵敏度高、特异性强、通量高的特点。目前根据病毒检测的需要，可以制备用于检测单一病毒的单特异性探针和用于检测多种病毒的复合探针。包括核酸斑点杂交技术、核酸狭缝印迹杂交技术、Norther
21、n印迹等技术被广泛应用于植物病毒的检测。（3）双链）双链RNA(dsRNA)电泳技术电泳技术 在受RNA病毒侵染的植物体内,有相应复制形式的双链RNA存在,而在健康植株中未发现病毒的dsRNA,如果检测到植物体内有dsRNA存在，它只能是病毒和类病毒以单链RNA（ssRNA）为模板合成的，因此，dsRNA可作为病毒检测的标志。病毒在植物体内增殖，通过核酸互补而形成一种健康植物没有的碱基配对dsRNA，dsRNA经提纯、电泳、染色后，在凝胶上所显示的谱带可以反映每种病毒组群的特异性，并且有些单个病毒的dsRNA在电泳图谱上也显示一定的特征。因此，利用病毒dsRNA的电泳图谱可以确定有无dsRNA
22、。dsRNA检测法具有快速、敏感、简便等优点，既可有效地检测已知和未知的病毒，又不受寄主和组织的影响，同样可以检测类病毒。现在学习的是第45页，共47页第四节 无病毒苗的保存与繁殖（一）隔离保存 将无病毒原原种苗种植于防虫网室中，以300目的网纱为好，可防止介体昆虫进入。有条件的地方可以找适宜的高寒冷山地，气候凉爽、虫害少，有利于无病毒材料的繁殖。对隔离保存的无病毒原种应定期检测有无病毒感染，及时将再感植株淘汰。（二）离体保存 将无病毒原原种的器官或幼小植株接种于培养基上，在试管内进行繁殖或置于19低温下离体保存。一、无病毒苗的保存现在学习的是第46页，共47页二、无病毒苗的繁殖（一）建立无病毒原种保存圃、母本园和苗圃（二）建立无病毒苗繁育生产体系 现在学习的是第47页，共47页