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1、第五章核磁共振方法解析蛋白质结构第一页，本课件共有72页核磁共振是解析蛋白质结构的一种重要方法核磁共振是解析蛋白质结构的一种重要方法优点：不需结晶；可研究动力学。优点：不需结晶；可研究动力学。缺点：受分子量限制，需要标记。缺点：受分子量限制，需要标记。第二页，本课件共有72页Malate synthase G(82kDa)第三页，本课件共有72页Richard Robert Ernst Ernst was awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1991 for his contributions towards the development of F
2、ourier Transform nuclear magnetic resonance spectroscopy and the subsequent development of multi-dimensional NMR techniques.第四页，本课件共有72页Kurt Wthrich He was awarded half of the Nobel Prize in Chemistry in 2002 for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-di
3、mensional structure of biological macromolecules in solution.第五页，本课件共有72页核磁共振的原理核磁共振的原理自旋量子数（自旋量子数（I）原子序数和原子质量都为偶数：原子序数和原子质量都为偶数：I=0I=0(1212C,C,1616O)O)原子序数为奇数，原子质量为偶数：原子序数为奇数，原子质量为偶数：I=整数整数(1414N,N,2 2H,H,1010B)B)原子质量为奇数：原子质量为奇数：I=半整数半整数(1 1H,H,1313C,C,1515N,N,3131P)P)第六页，本课件共有72页自旋状态（自旋状态（M）M M=I,
4、(I-1),(I-2),-I=I,(I-1),(I-2),-I 对于对于1 1H H,1313C,C,1515N,N,3131P P 来说来说:M M=1/2,-1/2=1/2,-1/2第七页，本课件共有72页凡自旋不为零的原子核，在外加静磁场中发生凡自旋不为零的原子核，在外加静磁场中发生能级能级裂分裂分，共振吸收一特定频率的射频电磁场能量的，共振吸收一特定频率的射频电磁场能量的现象，即为核磁共振。现象，即为核磁共振。Bo=0Bo 0E=h Bo/2=h a ab b为磁旋比，由核的性质所决定。为磁旋比，由核的性质所决定。第八页，本课件共有72页核磁共振的灵敏度核磁共振的灵敏度 N-N N/N
5、=e E/kT E=h Bo/2 对于在 400 MHz(BoBo=9.5 T)磁场下的1H：N/N=1.000064第九页，本课件共有72页磁场越强，灵敏度越高磁场越强，灵敏度越高磁旋比越大，灵敏度越高磁旋比越大，灵敏度越高 1H=26.75 rad/G；13C=6.73 rad/G；15N=-2.71rad/G核的丰度越高，灵敏度越高核的丰度越高，灵敏度越高第十页，本课件共有72页第十一页，本课件共有72页1H谱谱 天然丰度高；灵敏度高。13C谱谱 天然丰度低；灵敏度低；化学位移拓展宽、分辨率好15N谱谱 天然丰度低；灵敏度低；化学位移拓展宽、分辨率好第十二页，本课件共有72页核磁共振的频
6、率核磁共振的频率 E=h Bo/2 =Bo/2 E=h 在常用磁体（2.35-18.6 T）下，1H 的共振频率在100-800MHz范围，13C为它的1/4，15N为它的1/10。10-1010-8 10-6 10-4 10-2 100 102 wavelength(cm)g-rays x-rays UV VIS IR m-wave radio第十三页，本课件共有72页进动进动(larmor)频率频率 =2 0=B0第十四页，本课件共有72页第十五页，本课件共有72页第十六页，本课件共有72页第十七页，本课件共有72页核磁共振的主要参数核磁共振的主要参数化学位移化学位移耦合常数耦合常数峰强峰
7、强核欧佛豪斯效应（核欧佛豪斯效应（NOENOE）横向驰豫时间横向驰豫时间纵向驰豫时间纵向驰豫时间线宽线宽第十八页，本课件共有72页化学位移化学位移 不同的原子处于不同的化学环境，即处于不同的电磁环境,因此表现出不同的共振频率：=（BoBoB B）/2/2 =2=2=(BoBoB B)第十九页，本课件共有72页逆磁屏蔽逆磁屏蔽第二十页，本课件共有72页微磁环境微磁环境第二十一页，本课件共有72页B Beffeff=B=B0 0-B-Blocloc-B-Beffeff=B=B0 0(1-(1-)第二十二页，本课件共有72页化学位移的表示方法化学位移的表示方法H3CSiCH3CH3CH3第二十三页，
8、本课件共有72页AromaticIminesAmidesHCb b,g g,d d,.HCa awater10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0第二十四页，本课件共有72页影响化学位移的效应：影响化学位移的效应：1.环流位移效应 环状分子的大电子云产生的附加磁场对核的影响2.顺磁离子效应 金属离子对周围核的影响3.pH滴定效应 不同pH下各基团解离情况的不同对化学位移的影响第二十五页，本课件共有72页耦合常数耦合常数自旋耦合自旋耦合 共价键（1-4个键）相连核之间的特性张量的相互作用13C1H1H1Hone-bondthree-bond第二十六页，本课件共有72页自旋裂分自旋裂分 由于被
9、测核与相邻核自旋耦合引起的谱线裂分，裂分的大小称为耦合常数耦合常数aaabbabbI SSSIIJ(Hz)第二十七页，本课件共有72页第二十八页，本课件共有72页耦合常数不随磁场的变化而变化耦合常数不随磁场的变化而变化两核耦合引起对方谱线裂分的大小相等两核耦合引起对方谱线裂分的大小相等相距越远、所隔键数越多，耦合越弱相距越远、所隔键数越多，耦合越弱重原子比轻原子耦合强重原子比轻原子耦合强耦合常数的大小与耦合核的二面角有关耦合常数的大小与耦合核的二面角有关第二十九页，本课件共有72页第三十页，本课件共有72页峰强、驰豫和线宽峰强、驰豫和线宽峰强与共振粒子数成正比。峰强与共振粒子数成正比。纵向驰豫
10、是高能原子核将其多余能量交给周围介质而纵向驰豫是高能原子核将其多余能量交给周围介质而返回低能态的过程。返回低能态的过程。横向驰豫是由于磁场不均等因素引起的磁化矢量的相移。横向驰豫是由于磁场不均等因素引起的磁化矢量的相移。由于磁场的不均一，会导致谱线增宽。线宽为横向驰豫由于磁场的不均一，会导致谱线增宽。线宽为横向驰豫时间的倒数。分子翻滚速率、溶液粘度和分子内部运动时间的倒数。分子翻滚速率、溶液粘度和分子内部运动性等影响线宽。性等影响线宽。第三十一页，本课件共有72页纵向驰豫（纵向驰豫（T1T1）第三十二页，本课件共有72页横向驰豫（横向驰豫（T2T2）第三十三页，本课件共有72页NOENOE不同
11、核之间通过空间的偶极相互作用，其强度与核间距不同核之间通过空间的偶极相互作用，其强度与核间距的六次方成反比。的六次方成反比。若用射频照射核若用射频照射核A A，其谱峰被抑制，与其空间靠近的另，其谱峰被抑制，与其空间靠近的另一核一核B B的谱峰会略有增强，其增强的程度，即为的谱峰会略有增强，其增强的程度，即为NOENOE强弱的度量。强弱的度量。因因NOENOE的强度与核间距有关，所以是分子结构中的最重的强度与核间距有关，所以是分子结构中的最重要参数。要参数。第三十四页，本课件共有72页一维谱一维谱共振峰强度随频率（化学位移）变化共振峰强度随频率（化学位移）变化第三十五页，本课件共有72页第三十六
12、页，本课件共有72页二维谱二维谱吸收峰强度对两个频率变量作图第三十七页，本课件共有72页COSYCOSY第三十八页，本课件共有72页TOCSYTOCSY第三十九页，本课件共有72页NOESYNOESY第四十页，本课件共有72页1H1H共振的分布共振的分布第四十一页，本课件共有72页异核二维谱异核二维谱第四十二页，本课件共有72页多维谱多维谱第四十三页，本课件共有72页多维多维NMRNMR解析蛋白质结构解析蛋白质结构第四十四页，本课件共有72页谱峰认证谱峰认证第四十五页，本课件共有72页自旋体系认证自旋体系认证第四十六页，本课件共有72页第四十七页，本课件共有72页序列认证序列认证第四十八页，本
13、课件共有72页第四十九页，本课件共有72页第五十页，本课件共有72页NOENOE认证认证TOCSY NOESYLeuAlaAsnGlyNHHCLeuAlaAsnGlyNHHC第五十一页，本课件共有72页用于用于NMRNMR结构计算的约束结构计算的约束NOE5NOE5化学位移化学位移二级结构二级结构偶极常数偶极常数二面角二面角氢氘交换氢氘交换氢键氢键顺磁驰豫增强顺磁驰豫增强(PRE)(PRE)远距离（远距离（3030）残余偶极耦合残余偶极耦合(RDC)(RDC)空间定向空间定向第五十二页，本课件共有72页特征特征NOENOE与二级结构与二级结构第五十三页，本课件共有72页化学位移与二级结构化学位
14、移与二级结构第五十四页，本课件共有72页偶极耦合与二面角偶极耦合与二面角第五十五页，本课件共有72页氢氘交换与结构和氢键氢氘交换与结构和氢键第五十六页，本课件共有72页4.04.0(Has)4.08.0(NHs)7.0t=0-No D2OAdd D2Ot=t1t=t2第五十七页，本课件共有72页第五十八页，本课件共有72页由核磁数据构建蛋白质溶液三维结构由核磁数据构建蛋白质溶液三维结构第五十九页，本课件共有72页Strong NOE1.8-2.7 Medium NOE1.8-3.3 Weak NOE1.8-5.0 3JNa a 5 Hz -80 f f 8 Hz -160 f f -80第六十
15、页，本课件共有72页第六十一页，本课件共有72页核磁共振谱仪的组成核磁共振谱仪的组成MagnetProbeConsoleComputer第六十二页，本课件共有72页对对磁体磁体的要求的要求高磁场强度高磁场强度高稳定性高稳定性高均匀性高均匀性第六十三页，本课件共有72页高磁场强度：高分辨率高灵敏度高磁场强度：高分辨率高灵敏度第六十四页，本课件共有72页信噪比的完全方程信噪比的完全方程第六十五页，本课件共有72页第六十六页，本课件共有72页第六十七页，本课件共有72页第六十八页，本课件共有72页样品的准备样品的准备溶剂的选择溶剂的选择 1.样品在其中有高溶解度；2.在我们所感兴趣的波谱范围内没有溶
16、剂峰；3.在做变温实验的温度范围内保持液体状态。通常使用一些氘代溶剂通常使用一些氘代溶剂 减少溶剂峰的干扰 采用氘核内锁稳定磁场，起锁场的作用 H2O 是生物分子最适宜的溶剂(90%H2O,10%D2O)第六十九页，本课件共有72页蛋白质蛋白质NMRNMR研究的溶液条件研究的溶液条件pH不要大于7。缓冲体系要保证蛋白质的稳定及高溶解度。蛋白质的浓度通常要求有数mM。避免缓冲液中其他成份对蛋白质谱图的干扰。无机盐浓度不宜大于数百mM。在样品溶液中不能有重金属离子污染。通常加入1mM左右NaN3以避免样品长霉菌。第七十页，本课件共有72页第七十一页，本课件共有72页思考题思考题一个原子在500MHz谱上的化学位移是8ppm，它在800MHz的谱上的化学位移是多少Hz?一个共振峰在500MHz谱上的耦合常数是10Hz，它在800MHz谱上的耦合常数是多少ppm？样品浓度增加一倍，场强增加一倍，信噪比各增加多少？为什么？第七十二页，本课件共有72页