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1、第四章单克隆抗体和抗体工程第一页，本课件共有87页第四章第四章 抗体制药抗体制药第一节第一节 概述概述第二节第二节 单克隆抗体单克隆抗体第三节第三节 鼠源性单克隆抗体的改造鼠源性单克隆抗体的改造第四节第四节 基因工程抗体和抗体工程基因工程抗体和抗体工程第五节第五节 抗体诊断试剂抗体诊断试剂第六节第六节 抗体治疗药物抗体治疗药物第二页，本课件共有87页第一节第一节 概述概述一、单克隆抗体一、单克隆抗体1890年：年：Behring和北里柴三郎等发现了和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。制药之先河。1937年：年：Tiselius
2、等人用电泳法将血清蛋等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（白分为白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种）球蛋白、乙种（）球蛋白和丙种（）球蛋白和丙种（）球蛋白，并证）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。20世纪世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单年代初期：抗原决定簇，精制单价血清。价血清。第三页，本课件共有87页1975年：年：Khler和和Milstein等，单克隆等，单克隆抗体，其具有高度特异性、均一性，以抗体，其具有高度特异性、均一性，以及来源稳定可大量生产等特点。及来源稳定可大量生产等特点。1984年：人年：人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体1984年至今
3、：单克隆抗体的鼠源性及分年至今：单克隆抗体的鼠源性及分子过大的问题得以解决，可仅作为与抗子过大的问题得以解决，可仅作为与抗原特异性结合试剂。原特异性结合试剂。第四页，本课件共有87页第五页，本课件共有87页第六页，本课件共有87页第七页，本课件共有87页第八页，本课件共有87页第九页，本课件共有87页第十页，本课件共有87页第十一页，本课件共有87页第十二页，本课件共有87页第十三页，本课件共有87页单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用n用于疾病的诊断和治疗：用于疾病的诊断和治疗：利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，辅助临床诊断，用放射性核
4、素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，进用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。行免疫鉴定。用于临床治疗用于临床治疗-如针对如针对T T淋巴细胞共有的分化抗原淋巴细胞共有的分化抗原CD3CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。n单克隆抗体还可作为载体药物可对肿瘤进行定向治单克隆抗体还可作为载体药物可对肿瘤进行定向治疗。疗。第十四页，本课件共有87页免疫导向疗法成功障碍：免疫导向疗法成功障碍：（1 1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2 2）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的
5、治疗浓度。实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。第十五页，本课件共有87页基因工程技术基因工程技术制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分子的相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/801/31/3，鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性介导的细
6、胞毒作用等，只保留同抗原特异性结合的活性。结合的活性。第十六页，本课件共有87页n抗体（抗体（antibody）：由）：由B细胞产生的免疫蛋白，细胞产生的免疫蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。抗体分子由两个它能识别抗原的某一特定位点。抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链组完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链组成。成。nB细胞（细胞（B cell）：由骨髓细胞分化而来的能产）：由骨髓细胞分化而来的能产生抗体的淋巴细胞。生抗体的淋巴细胞。n单克隆抗体单克隆抗体:是将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融是将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为合，通过有限稀
7、释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而生产的。纯一的单克隆细胞系而生产的。第二节第二节 单克隆抗体及其制备单克隆抗体及其制备第十七页，本课件共有87页一、抗体的结构与功能一、抗体的结构与功能nLight and heavy Chain，n 可变区（可变区（variable region），），简称简称V区，区，n 3个互补决定区个互补决定区（complementaruty-determining region,CDR）n 重链分子上有重链分子上有3个恒定区个恒定区constant region,C区区（CH1,CH2和和CH3）,n 轻链上有一个恒定区（轻链上有一个恒定区（CL）。）
8、。重链重链轻链轻链第十八页，本课件共有87页n用木瓜蛋白酶处理，将抗体分解成用木瓜蛋白酶处理，将抗体分解成3个部分个部分(2个个Fab片段和片段和1个个 Fc片段片段)；nFab：一条完整的轻链和重链的可变区，轻链和：一条完整的轻链和重链的可变区，轻链和重链恒定区。重链恒定区。CL和和CH1之间以二硫键连接；之间以二硫键连接；n保存有抗原结合活性和特异性。保留保存有抗原结合活性和特异性。保留VH和和VL即即可完全获得原抗体的抗原结合活性，可完全获得原抗体的抗原结合活性，FvnFc：两条重链的：两条重链的CH2和和CH3区域，二硫键连接，区域，二硫键连接，没有抗原接合活性，但是没有抗原接合活性，
9、但是抗体结合上抗原后激抗体结合上抗原后激活免疫反应的主要部位活免疫反应的主要部位。第十九页，本课件共有87页第二十页，本课件共有87页接接受受抗抗原原刺刺激激后后，能能分分泌泌针针对对该该抗抗原原的的特特异性抗体异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。，在体液免疫中具有重要功能。B淋淋巴巴细细胞胞本本身身是是一一种种终终末末分分化化细细胞胞，通通常常不不再再进进行行细细胞胞分分裂裂，存存活活一一段段时时间间后后便便会会死死亡亡短命细胞短命细胞一、杂交瘤技术产生的一、杂交瘤技术产生的3个技术关键个技术关键1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B淋巴细胞淋巴细胞(B lymph
10、ocytes)：二、杂交瘤细胞系的生产二、杂交瘤细胞系的生产第二十一页，本课件共有87页骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞(myeloma cells):恶恶性性增增殖殖的的转转化化细细胞胞，只只要要营营养养条条件件适适合合可可永远分裂和存活永远分裂和存活长命细胞长命细胞。经经筛筛选选与与驯驯化化，现现已已建建立立多多种种骨骨髓髓瘤瘤细细胞胞株株没有抗体分泌物没有抗体分泌物。第二十二页，本课件共有87页2.细胞融合技术：细胞融合技术：脾细胞脾细胞(B淋巴细胞淋巴细胞)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体短命分泌抗体长命分泌抗体长命(Khler和和Milst
11、ein,Jerne)1984年年Nobel生生 理理 学学 及及 医医 学学 奖奖第二十三页，本课件共有87页3.杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/脾细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型第二十四页，本课件共有87页HAT培养基筛选原理培养基筛选原理(1)(1)n细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：氨甲蝶呤氨甲蝶呤(Aminopterin，A):可阻断正常的可阻断正常的 DNA合成（嘌呤及合成（嘌呤及TMP合成受抑制）合成受抑制）次黄嘌呤次黄
12、嘌呤(Hypoxanthine，H):是是HGPRT的底物的底物,为为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）；合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）；胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷(Thymidine，T):胸苷激酶胸苷激酶(TK)的的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原合成提供原料。料。第二十五页，本课件共有87页核苷酸合成途径核苷酸合成途径-生物合成途径（生物合成途径（D D途径途径-主要途径）主要途径）n主途径：主途径：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。过
13、程。n叶酸叶酸作为重要的作为重要的辅酶辅酶参与这一过程。参与这一过程。nHAT培养液中培养液中氨基喋呤氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，是一种叶酸的拮抗物，可以阻断可以阻断DNA合成的合成的“D途径途径”。第二十六页，本课件共有87页n辅助途径：辅助途径：是在是在次黄嘌呤次黄嘌呤和和胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经存在的情况下，经次黄嘌呤次黄嘌呤磷酸核糖转化磷酸核糖转化酶酶（HGPRT）和）和胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成的催化作用合成DNA，两种酶缺一不可。，两种酶缺一不可。核苷酸合成途径核苷酸合成途径-生物合成途径（旁生物合成途径（旁途径途径-S-S途径途径 ）第
14、二十七页，本课件共有87页筛选：筛选：HAT培养基筛选原理培养基筛选原理DNA 内源性途径内源性途径(D-主要途径主要途径)谷氨酰胺谷氨酰胺 or单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶A AHHT T外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径)(Hypoxanthine Guznine Phosphoribosyl Transferase)次嘌呤次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶(Thymidine kinase,TK)B淋巴细胞：淋巴细胞：HGPRT+，TK+骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：HGPRT-，TK-存活存活 死亡死亡外源性途径外
15、源性途径(S-旁路途径旁路途径)第二十八页，本课件共有87页1、未融合的效应、未融合的效应B细胞和两个效应细胞和两个效应B细胞融合细胞融合nB淋巴细胞：淋巴细胞：HGPRT+，TK+n在在HAT培养液中，未融合的效应培养液中，未融合的效应B细胞和两个细胞和两个效应效应B细胞融合的细胞融合的“D途径途径”被氨基喋呤阻断被氨基喋呤阻断n虽虽“S途径途径”正常，但因缺乏在体外培养液正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般中增殖的能力，一般10d左右会死亡。左右会死亡。第二十九页，本课件共有87页n骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HGPRT，TKn在在HAT培养液中，因此自身没有培养液中，因此自身没有“S途径
16、途径”n“D途径途径”又被氨基喋呤阻断，所以在又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。培养液中也不能增殖而很快死亡。2 2、骨髓瘤细胞以及自身融合细胞、骨髓瘤细胞以及自身融合细胞第三十页，本课件共有87页n骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HGPRT-，TK-n既具有效应既具有效应B细胞的细胞的“S途径途径”，又具有骨髓瘤，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性。细胞在体外培养液中长期增殖的特性。n在在HAT培养液中，选择性存活下来，并不断增殖。培养液中，选择性存活下来，并不断增殖。3 3、杂交瘤细胞、杂交瘤细胞第三十一页，本课件共有87页浆细胞自发或诱发突变脾B细胞用SRBC免疫
17、(注射X蛋白)不能在HAT培养基上生长的骨髓细胞(带有X蛋白的抗体)细胞融合转到HAT培养基上非融合细胞死亡杂交瘤细胞生长第三十二页，本课件共有87页在多孔塑料板孔内培养单个细胞(HAT培养液)培养2周杂交瘤细胞可继续繁殖优良杂交瘤细胞检测单克隆抗体接种动物,大量生产单克隆抗体细胞大量培养罐大量生产克隆抗体冷冻保藏淘汰不合格的细胞亲代死亡第三十三页，本课件共有87页三、筛选阳性克隆与克隆化三、筛选阳性克隆与克隆化（1 1）筛选阳性克隆：）筛选阳性克隆：产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细胞的胞的5%5%左右。左右。筛选技术：免疫酶技术、免疫荧光技术和放筛
18、选技术：免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免疫技术。射免疫技术。免疫酶技术和放射免疫技术均适用于免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测。第三十四页，本课件共有87页1、精制破伤风毒素抗原（、精制破伤风毒素抗原（）吸附）吸附（约（约10 g/ml，4，3h）洗涤洗涤2、加杂交瘤培养上清液（、加杂交瘤培养上清液（）（4，1h）3、加辣根过氧化物酶标记的羊抗、加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（鼠抗体（）（4，1h）洗涤洗涤洗涤洗涤4、加酶作用底物，呈色孔为阳、加酶作用底物
19、，呈色孔为阳性克隆孔性克隆孔ELISA用于破伤风抗体的筛选用于破伤风抗体的筛选第三十五页，本课件共有87页杂交瘤细胞杂交瘤细胞培养细胞向培养培养细胞向培养基中分泌抗体基中分泌抗体收集培养基收集培养基预先包埋好目预先包埋好目标抗原的培养标抗原的培养板板抗原与抗体的结合抗原与抗体的结合EEEEE加入二抗加入二抗显色说明有抗体的显色说明有抗体的存在存在在酶的情况下在酶的情况下,与二抗与二抗结合的分子产生特殊的结合的分子产生特殊的颜色颜色(ELISA)第三十六页，本课件共有87页第三十七页，本课件共有87页（2）克隆化）克隆化有限稀释法和软琼脂法有限稀释法和软琼脂法筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌
20、抗体的细筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞胞或有多株分泌抗体的细胞，而且刚刚融合获得的，而且刚刚融合获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失，因此应尽早杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失，因此应尽早克隆化。克隆化。杂交瘤细胞要经过大约杂交瘤细胞要经过大约3次的克隆化，才能达次的克隆化，才能达到到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆。孔内均为抗体阳性细胞克隆。常用的克隆化方法有常用的克隆化方法有有限稀释法有限稀释法和和软琼脂法软琼脂法。第三十八页，本课件共有87页有限稀释法：是把杂交瘤细胞悬液稀释后，有限稀释法：是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到加入到96孔细胞培养板中，
21、使每个孔中在理孔细胞培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克培养液，以后的克隆化可用不含隆化可用不含HT的的RPMI1640培养液。培养液。单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养细单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养细胞辅助其生长。胞辅助其生长。第三十九页，本课件共有87页n软琼脂法：在培养液中加入软琼脂法：在培养液中加入0.5%0.5%左右的琼脂糖左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块。凝胶，细胞分裂后形成小球样团块。n培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸
22、出，团块打碎后，移入出，团块打碎后，移入9696孔板中继续培养。孔板中继续培养。n这种方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，因这种方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易增殖，所以用软琼脂法进行克初代细胞很不易增殖，所以用软琼脂法进行克隆化容易成功。隆化容易成功。第四十页，本课件共有87页三、杂交瘤细胞的鉴定三、杂交瘤细胞的鉴定1）染色体鉴定染色体鉴定:正常小鼠脾细胞的染色体数目为正常小鼠脾细胞的染色体数目为 40,而小鼠骨髓瘤细胞的染色体数目的变异较大而小鼠骨髓瘤细胞的染色体数目的变异较大，可以有可以有6268 条染色体。条染色体。2）特性鉴定特性鉴定:对单克隆抗体的亲和力的鉴定是最重
23、要的对单克隆抗体的亲和力的鉴定是最重要的,一般采用酶联免疫吸附测定一般采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法。法。3）类别鉴定类别鉴定:可以用相应的抗血清及双向免疫扩散可以用相应的抗血清及双向免疫扩散法进行鉴定法进行鉴定;4）单克隆抗体的纯度鉴定单克隆抗体的纯度鉴定:可以用有还原剂或者无还原可以用有还原剂或者无还原剂条件下的剂条件下的 SDS-PAGE 电泳进行鉴定。电泳进行鉴定。第四十一页，本课件共有87页四、单克隆抗体的大量制备四、单克隆抗体的大量制备（1）体外培养法可获得）体外培养法可获得10 g/ml的抗体；的抗体；（2）动物体内诱生法，可获得）动物体内诱生法，可获得520mg/ml的抗
24、体。的抗体。-目前多采用此法生产制备单克隆抗体。目前多采用此法生产制备单克隆抗体。优点：优点：操作简便、比较经济、所得抗体量多、操作简便、比较经济、所得抗体量多、所得单克隆抗所得单克隆抗体量较多且效价亦高，体量较多且效价亦高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株，缺点：缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。带来难度。第四十二页，本课件共有87页n大量培养方法：大量培养方法：n利用悬浮培养方式利用悬浮培养方式可增加细胞生长空间，杂可增加细胞生长空间，杂交瘤细
25、胞生长旺盛，单克隆抗体产量得到提交瘤细胞生长旺盛，单克隆抗体产量得到提高。高。n连续悬浮培养的细胞密度连续悬浮培养的细胞密度可达可达2.0 107细胞细胞/ml，收集的单克隆抗体可达到收集的单克隆抗体可达到400 g/ml左左右。右。n微载体悬浮培养法，增大单位体积的表面积，微载体悬浮培养法，增大单位体积的表面积，利于杂交瘤细胞生长，细胞密度可达利于杂交瘤细胞生长，细胞密度可达108细胞细胞/ml。并能收获更多的单抗。并能收获更多的单抗。第四十三页，本课件共有87页五、单克隆抗体的纯化五、单克隆抗体的纯化动物体内诱生法制备单克隆抗体具体方法及过程动物体内诱生法制备单克隆抗体具体方法及过程1、澄
26、清和沉淀处理、澄清和沉淀处理小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块及脂质等，应首先用离心力凝块及脂质等，应首先用离心力1000g离心离心5min，去除残留的小颗粒物质；去除残留的小颗粒物质；再用再用0.2 m的微孔滤膜过滤，除掉污染的细菌、的微孔滤膜过滤，除掉污染的细菌、支原体和脂质；用饱和硫酸铵沉淀抗体，支原体和脂质；用饱和硫酸铵沉淀抗体，50%饱和硫酸铵能回收饱和硫酸铵能回收90%以上的单克隆抗体。以上的单克隆抗体。2、分离、分离 主要分离方法有凝胶过滤、阴离子交换层析、亲主要分离方法有凝胶过滤、阴离子交换层析、亲和层析等。和层析等。第四十四页
27、，本课件共有87页2、分离、分离（1）凝胶过滤）凝胶过滤（2）阴离子交换）阴离子交换（3）亲和层析）亲和层析第四十五页，本课件共有87页第三节第三节 基因工程抗体及其制备基因工程抗体及其制备(Genetic engineering antibody)基因工程抗体：基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基因根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。生新型抗体。主要包括：嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、主要包括：嵌合抗体、单链抗体、人源化
28、抗体、双价抗体和双特异性抗体。双价抗体和双特异性抗体。第四十六页，本课件共有87页一、一、单单克隆克隆抗抗体靶向制剂体靶向制剂纤溶酶原纤溶酶原纤溶酶原激活纤溶酶原激活剂剂(tPA)纤溶酶纤溶酶血纤维蛋白原血纤维蛋白原血纤维血纤维蛋白蛋白降解降解产物产物降解降解产物产物第四十七页，本课件共有87页2 2、耦联了、耦联了tPAtPA的血纤维蛋白的单克隆抗体的血纤维蛋白的单克隆抗体纤溶酶原纤溶酶原纤溶酶纤溶酶抗血纤维抗血纤维蛋白抗体蛋白抗体血块血块第四十八页，本课件共有87页(1)(1)药物与单抗直接偶联药物与单抗直接偶联 n通过化学反应在通过化学反应在药物分子的氨基药物分子的氨基和和抗体分子的抗体
29、分子的羧羧基之间基之间形成形成酰胺酰胺键键,但由于但由于酰胺酰胺键很稳定键很稳定,药物与药物与抗体分子结合后无法释放出来抗体分子结合后无法释放出来,因此其药用活性因此其药用活性几乎完全无法发挥出来。几乎完全无法发挥出来。n用用氧化剂氧化剂把药物分子上的糖基氧化成把药物分子上的糖基氧化成羰羰基基,然后然后利用利用羰羰基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱,最最后还原。这样制成的靶向制剂可以保留一定的药物后还原。这样制成的靶向制剂可以保留一定的药物活性活性,同时体外实验证明同时体外实验证明,药物显示出一定的选择药物显示出一定的选择性。性。第四十九页，本课件共有87页(
30、2)药物通过小分子与单抗连接药物通过小分子与单抗连接n通过一些小分子交联剂通过一些小分子交联剂,把药物分子上的某把药物分子上的某些基团与抗体分子上的某些基团连接起来些基团与抗体分子上的某些基团连接起来。(3)药物通过大分子与抗体相连药物通过大分子与抗体相连 n将较多的药物分子接连在一种大分子聚合物上将较多的药物分子接连在一种大分子聚合物上,然后再与单克隆抗体交联。然后再与单克隆抗体交联。第五十页，本课件共有87页二、杂交人二、杂交人-鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体n鼠源单克隆抗体在临床上的应用前景很广鼠源单克隆抗体在临床上的应用前景很广,n鼠源的抗体有其局限性鼠源的抗体有其局限性:被清除出人的循环系
31、统被清除出人的循环系统;n鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统统,n在大多数情况下在大多数情况下,还会引发人对于鼠源抗体本身的还会引发人对于鼠源抗体本身的免疫反应免疫反应,人的抗鼠反应人的抗鼠反应(human antimouse resmse),也就是产生人的抗鼠抗体也就是产生人的抗鼠抗体(human antimouse antibody,简称简称 HAMA)。第五十一页，本课件共有87页Chimeric AntibodiesHuman Fc regionsMouse V regions第五十二页，本课件共有87页三、人源化抗体三、人源化抗体(
32、humanized antibody)1.将小鼠的将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体。移植抗体。2.将小鼠将小鼠Ig基因敲除，转染人基因敲除，转染人Ig基因，在基因，在小鼠体内产生人小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体产生大量完全人源化抗体第五十三页，本课件共有87页人源单克隆抗体人源单克隆抗体n化学偶联的单抗靶向制剂产率很低化学偶联的单抗靶向制剂产率很低;n偶联分子其连接位置也是随机的偶联分子其连接位置也是随机的;n药物分子的酶活性和其他生物活性部分、甚至药物分子的酶活性和
33、其他生物活性部分、甚至全部丧失。全部丧失。n嵌合抗体嵌合抗体的的可变区可变区100%都是鼠源的都是鼠源的，对人对人体仍然有一定的免疫原性。体仍然有一定的免疫原性。第五十四页，本课件共有87页传统的杂交瘤技术是很难获得人源单克隆抗体传统的杂交瘤技术是很难获得人源单克隆抗体主要原因主要原因:n人一鼠淋巴细胞的融合细胞中人源的染色人一鼠淋巴细胞的融合细胞中人源的染色体不稳定体不稳定,得到的人源单克隆抗体极少得到的人源单克隆抗体极少;n没有没有能有效代替鼠的骨髓瘤细胞的人的骨髓能有效代替鼠的骨髓瘤细胞的人的骨髓瘤细胞瘤细胞;n伦理上伦理上,无法对人进行多种抗原的免疫。无法对人进行多种抗原的免疫。第五十
34、五页，本课件共有87页获得人源抗体的方法获得人源抗体的方法In先分离出正在活跃产生抗体的人先分离出正在活跃产生抗体的人B 细胞细胞,n通过荧光标记选择能产生特殊抗体的通过荧光标记选择能产生特殊抗体的B cell,n病毒转化病毒转化,使之能在培养条件下正常生长。使之能在培养条件下正常生长。n其中的一些转化的其中的一些转化的 B 细胞就可以分泌出能与特细胞就可以分泌出能与特异性抗原结合的单抗。异性抗原结合的单抗。n产率很低产率很低,抗体对于抗原的结合能力也较差。抗体对于抗原的结合能力也较差。第五十六页，本课件共有87页获得人源抗体的方法获得人源抗体的方法IIn将人源免疫干细胞导人缺失大部分免疫细胞
35、的将人源免疫干细胞导人缺失大部分免疫细胞的小鼠体内小鼠体内,n这种小鼠遇到抗原时这种小鼠遇到抗原时,会产生人源的抗体。会产生人源的抗体。获得人源抗体的方法获得人源抗体的方法IIIn将改造过的人的抗体基因导人鼠胚胎系中将改造过的人的抗体基因导人鼠胚胎系中,以得到能在免疫后产生人的抗体的转基因鼠。以得到能在免疫后产生人的抗体的转基因鼠。n改造过的抗体改造过的抗体，除了构成抗原结合部位的轻重除了构成抗原结合部位的轻重链各链各3个个CDR区是鼠源外区是鼠源外,其余均为人源的其余均为人源的。第五十七页，本课件共有87页Humanized AntibodiesnCloned human genenInse
36、rt sequences from mouse monoclonal antibody for CDR1-3 segmentsnPCR amplified segments第五十八页，本课件共有87页Isolation of CDR SegmentsnPCR amplification of CDR segments from mouse monoclonal antibody to desired targetnInsert into cDNA clone of human antibodynProduce human antibody with desired CDRs and antig
37、en specificity第五十九页，本课件共有87页四、抗体融合蛋白四、抗体融合蛋白n一种是将抗体的可变区域与一非抗体蛋白融一种是将抗体的可变区域与一非抗体蛋白融合，使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异合，使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异性。性。n另一种是用非免疫球蛋白的序列替换抗体的可变另一种是用非免疫球蛋白的序列替换抗体的可变区，如用区，如用CD4、白细胞介素、白细胞介素3和肿瘤坏死因子等。和肿瘤坏死因子等。第六十页，本课件共有87页五、抗体酶五、抗体酶n 抗体酶抗体酶(abzyme)(abzyme)：应用于单克隆技术生产的兼：应用于单克隆技术生产的兼具抗体及酶催活性的工程蛋白质。也就
38、是说，其具抗体及酶催活性的工程蛋白质。也就是说，其行为如同蛋白酶一样，能够催化化学反应的一类行为如同蛋白酶一样，能够催化化学反应的一类新型的抗体。新型的抗体。n抗体酶的制备抗体酶的制备(自学自学)第六十一页，本课件共有87页ImmunotoxinsnProtein toxin connected to Fv regionnSingle-chain or S-S linked Fv regionnToxin localized to antigen-expressing cells第六十二页，本课件共有87页六、单链抗体六、单链抗体(single chain antibody)n单链抗体：用基因
39、工程方法，将抗体重单链抗体：用基因工程方法，将抗体重链和轻链可变区通过一个连接肽连接而链和轻链可变区通过一个连接肽连接而成的重组蛋白。成的重组蛋白。n特点：能保持与抗原结合的性能，分子特点：能保持与抗原结合的性能，分子量小，穿透性强，体内循环半衰期短，量小，穿透性强，体内循环半衰期短，免疫原性低。免疫原性低。第六十三页，本课件共有87页单链抗体单链抗体nFv片段抗体片段抗体(single chain Fv fragment,scFv)n要获得正确的抗原结合构象要获得正确的抗原结合构象,VL衔接物衔接物VH;单链抗体的应用前景单链抗体的应用前景n体积小体积小,免疫原性较低免疫原性较低,不易引起人
40、体的免疫排斥不易引起人体的免疫排斥,渗透性好渗透性好,能有效地穿透致密的肿瘤屏障能有效地穿透致密的肿瘤屏障,有利有利于基因治疗。于基因治疗。n构建双功能分子构建双功能分子生物导弹生物导弹第六十四页，本课件共有87页单链抗体的应用单链抗体的应用：n用于肿瘤的导向治疗用于肿瘤的导向治疗n肿瘤的影像分布肿瘤的影像分布n基因治疗基因治疗细胞内抗体：在细胞内表达特异性识别某细胞内抗体：在细胞内表达特异性识别某一基因产物的抗体，可干扰该基因产物一基因产物的抗体，可干扰该基因产物的生物活性。的生物活性。n研究基因结构与功能的关系研究基因结构与功能的关系第六十五页，本课件共有87页七、嵌合抗体七、嵌合抗体(c
41、himeric antibody)n嵌合抗体：从杂交瘤细胞分离出功能性嵌合抗体：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人达人-鼠嵌合抗体。鼠嵌合抗体。n特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。能力。第六十六页，本课件共有87页八、双价抗体与双特异性抗体八、双价抗体与双特异性抗体(bispecific antibody)许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位许多抗原抗体反应要
42、求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和将识别肿瘤抗原的抗体和 识别细胞毒性识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。取得杀伤肿瘤细胞的作用。第六十七页，本课件共有87页九、单克隆抗体的改造和应用九、单克隆抗体的改造和应用单克隆抗体与杀伤性单克隆抗体与杀伤性药物耦联药物耦联破坏特定破坏特定的目标细胞的目标细胞;单克隆抗体与药物单克隆抗体与药物前体耦
43、联前体耦联在酶的作在酶的作用下用下,可转化为具杀伤可转化为具杀伤活性的药物活性的药物,杀伤靶细杀伤靶细胞胞第六十八页，本课件共有87页转基因的方法在杂交瘤细胞中生产完全转基因的方法在杂交瘤细胞中生产完全的人源单克隆抗体的人源单克隆抗体n轻链和重链各由位于两条染色体上的两组基因轻链和重链各由位于两条染色体上的两组基因分别编码。分别编码。n通过重排产生大量的各不相同的轻链和重链通过重排产生大量的各不相同的轻链和重链分子。分子。n再通过轻链和重链分子之间的排列组合而再通过轻链和重链分子之间的排列组合而形成几乎无限的多的抗体分子。形成几乎无限的多的抗体分子。第六十九页，本课件共有87页1 12 23
44、34 4 5 51 12 23 34 45 593939 94 49 95 528282 29 93 30 01 12 23 3 4 45 56 6 VHDHJHCHVH(1/95)DH(1/30)JH(1/6)CH(1/5)基因重排后得到的重链A74747 75 57 76 61 12 23 3 4 45 5VKJk1 12 23 34 45 5CkC Ck kVk(1/76)Jk(1/5)CkB基因重排后得到的轻链第七十页，本课件共有87页ES细胞人重链基因YAC人轻链基因YACH H抗体基因敲除的小鼠抗体基因敲除的小鼠h hH Hh只表达人重链的纯合转基因鼠只表达人轻链的纯合转基因鼠hA
45、bhAb只表达人源抗体的纯合转基因鼠第七十一页，本课件共有87页第四节第四节 基因工程抗体和抗体工程基因工程抗体和抗体工程一、噬菌体抗体库技术的基本方法一、噬菌体抗体库技术的基本方法1、获得目的基因、获得目的基因2、抗体库技术的载体：现在普遍使用噬菌、抗体库技术的载体：现在普遍使用噬菌粒（粒（phagemid）载体，其中的载体，其中的pHEN1为为新一代载体，转化效率高，有利于提高新一代载体，转化效率高，有利于提高库容量。库容量。第七十二页，本课件共有87页3、淘筛：抗原固定化后，对噬菌粒群的吸、淘筛：抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬附、洗涤和洗脱后再感染扩增，
46、与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增。的克隆，且使目的克隆大量扩增。四、表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入四、表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用western blot分析确定后，就完成了全过分析确定后，就完成了全过程。程。第七十三页，本课件共有87页二、噬菌体抗体库技术的特点二、噬菌体抗体库技术的特点1、模拟天然全套抗体库、模拟天然全套抗体库n抗体文库抗体文库 1011库
47、容，能包含库容，能包含B细胞全部克细胞全部克隆。隆。n建库的外源基因来自人外周血、骨髓或脾建库的外源基因来自人外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的反转录形成的cDNA扩增，使用的通用引物采自多个人扩增，使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。体，具有人的种属普遍性。nVH和和VL随机重组增加抗体的多样性。随机重组增加抗体的多样性。第七十四页，本课件共有87页2、避开了人工免疫和杂交瘤技术、避开了人工免疫和杂交瘤技术3、可获得高亲和力的人源化抗体、可获得高亲和力的人源化抗体在噬菌体抗体库中，在噬菌体抗体库中，VH和和VL基因的随机重组基因的随机重组模拟
48、了体内抗体亲和力成熟过程，所用抗体基模拟了体内抗体亲和力成熟过程，所用抗体基因又都是来自人体，因又都是来自人体，因此产生的抗体必然都是高亲和力的。因此产生的抗体必然都是高亲和力的。第七十五页，本课件共有87页三、基因工程抗体的表达三、基因工程抗体的表达1、原核细胞表达、原核细胞表达2、真核细胞表达、真核细胞表达3、转基因植物表达、转基因植物表达4、转基因动物表达、转基因动物表达第七十六页，本课件共有87页第五节第五节 抗体诊断试剂抗体诊断试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂1、鉴定病原菌的抗体试剂：诊断血清制备、鉴定病原菌的抗体试剂：诊断血清制备步骤：步骤：（1）制备细
49、菌抗原，）制备细菌抗原，O（菌体）抗原，菌体）抗原，H（鞭毛）抗原；鞭毛）抗原；（2）免疫动物和制备抗体血清）免疫动物和制备抗体血清2、乙型肝炎病毒表面抗原（、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反的反向被动血凝诊断试剂向被动血凝诊断试剂3、妊娠诊断试剂、妊娠诊断试剂4、抗、抗ABO血型系统血清血型系统血清第七十七页，本课件共有87页二、免疫标记技术用的抗体类试剂二、免疫标记技术用的抗体类试剂1、荧光抗体诊断试剂、荧光抗体诊断试剂荧光色素如异硫氰酸荧光素（荧光色素如异硫氰酸荧光素（FITC）等标记抗等标记抗体球蛋白，即成为荧光抗体。体球蛋白，即成为荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片
50、或细用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体与抗原集合，在荧光显微镜下成胞，荧光抗体与抗原集合，在荧光显微镜下成为可发光的可视物，从而达到诊断或定位的目为可发光的可视物，从而达到诊断或定位的目的。的。（1）荧光抗体的制备）荧光抗体的制备（2）免疫荧光测定法有直接和间接两种方法。）免疫荧光测定法有直接和间接两种方法。第七十八页，本课件共有87页2、免疫酶抗体诊断试剂、免疫酶抗体诊断试剂免疫酶技术是用酶标记抗体来检测抗原的方法，免疫酶技术是用酶标记抗体来检测抗原的方法，本法分为免疫酶染色（组化法）和酶免疫测定本法分为免疫酶染色（组化法）和酶免疫测定（EIA）两种类型。两种类型。（1）免