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1、蛋白质是生物功能的主要载体：蛋白质是生物功能的主要载体：蛋白质的共价蛋白质的共价结构结构第第 4 章章一、蛋白质的分子大小一、蛋白质的分子大小二、蛋白质结构的组织层次二、蛋白质结构的组织层次三、肽三、肽四、蛋白质测序的策略四、蛋白质测序的策略五、蛋白质测序的一些常用方法五、蛋白质测序的一些常用方法六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基七、蛋白质一级结构的举例七、蛋白质一级结构的举例八、蛋白质序列数据库八、蛋白质序列数据库九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成教学内容教学内容一、蛋白质分子的大小蛋白质蛋白质Mr的范围：的
2、范围：6 000 1106，下限一般认为从胰岛素（，下限一般认为从胰岛素（Mr 5 733）。）。肽、蛋白质的一般区别：肽、蛋白质的一般区别：一般情况，少于一般情况，少于 50 个个 氨基酸残基的低分子量氨基酸残基的低分子量 氨基酸多氨基酸多聚物为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽；多聚物为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽；多于于50个氨基酸残基的称为蛋白质。有时把含有一条肽个氨基酸残基的称为蛋白质。有时把含有一条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。链的蛋白质不严谨地称为多肽。多肽一词着重于结构，而蛋白质原则强调了其功能。多肽一词着重于结构，而蛋白质原则强调了其功能。一、蛋白质分子的大小单体蛋
3、白、寡聚蛋白或多聚蛋白、亚基超分子复合体对简单蛋白质，用对简单蛋白质，用 110 除它的除它的 Mr 即可约略估计其氨即可约略估计其氨基酸残基的数目。基酸残基的数目。蛋白质中蛋白质中 20 种基本种基本 aa 平均平均 Mr 约约 138，但多数蛋白，但多数蛋白质较小氨基酸占优势，平均质较小氨基酸占优势，平均 Mr 接近接近 128。形成一个。形成一个肽键将除去一分子肽键将除去一分子H2O)，所以氨基酸残基的平均，所以氨基酸残基的平均 Mr 约为约为110一、蛋白质分子的大小氨基酸残基数目的估算氨基酸残基数目的估算一、蛋白质的分子大小一、蛋白质的分子大小二、蛋白质结构的组织层次二、蛋白质结构的
4、组织层次三、肽三、肽四、蛋白质测序的策略四、蛋白质测序的策略五、蛋白质测序的一些常用方法五、蛋白质测序的一些常用方法六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基七、蛋白质一级结构的举例七、蛋白质一级结构的举例八、蛋白质序列数据库八、蛋白质序列数据库九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成教学内容教学内容二、蛋白质结构的组织层次一级结构：多肽链的氨基酸序列，包括共价键。一级结构：多肽链的氨基酸序列，包括共价键。二级结构：多肽链借助氢键形成的有规则的局部结构，如二级结构：多肽链借助氢键形成的有规则的局部结构，如螺螺旋、旋、折叠等元
5、件。折叠等元件。三级结构：借助次级键形成特定走向的球状实体三级结构：借助次级键形成特定走向的球状实体.四级结构：亚基借助非共价键彼此缔合成寡聚或多聚蛋白质四级结构：亚基借助非共价键彼此缔合成寡聚或多聚蛋白质.一、蛋白质的分子大小一、蛋白质的分子大小二、蛋白质结构的组织层次二、蛋白质结构的组织层次三、肽三、肽四、蛋白质测序的策略四、蛋白质测序的策略五、蛋白质测序的一些常用方法五、蛋白质测序的一些常用方法六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基七、蛋白质一级结构的举例七、蛋白质一级结构的举例八、蛋白质序列数据库八、蛋白质序列数据库九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽
6、的合成九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成教学内容教学内容(一)肽和肽键的结构(二)肽的物理和化学性质(三)天然存在的活性肽三、肽肽：是由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水肽：是由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物缩合而成的化合物.肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键(酰氨键酰氨键),),氨基酸氨基酸氨基酸残基氨基酸残基.二肽：两个氨基酸，寡肽二肽：两个氨基酸，寡肽:2-10:2-10个氨基酸，多肽多于个氨基酸，多肽多于1010个氨基酸个氨基酸.（一）肽键的结构（一）肽键的结构氨基末端氨基末端(残基残基)羧基末端羧基末端(残
7、基残基)酰胺基称为肽基酰胺基称为肽基或肽单位或肽单位多肽链主链：肽链骨架由-N-C-C-重复排列而成（一）肽键的结构酰胺氮上的孤对电子与羰基酰胺氮上的孤对电子与羰基O之间的共振作用之间的共振作用,形成共振杂化体形成共振杂化体,稳定性高稳定性高.肽键具部分双键性质，不能自由旋转肽键具部分双键性质，不能自由旋转,具平面性具平面性.个原子几乎处个原子几乎处在同一平面内在同一平面内(酰氨平面酰氨平面)。有的。有的40%的双键性质，的双键性质，CO 有有40%的单键性质。的单键性质。肽键亚氨基在肽键亚氨基在pH014内不解离内不解离.肽键一般是反式构型，而肽键一般是反式构型，而Pro肽键可能出现顺、反两
8、种构型肽键可能出现顺、反两种构型肽键的结构特点：肽键的结构特点：短肽以偶极离子形式存在。短肽以偶极离子形式存在。pH 014，亚氨基不解离，酸碱性取决于端亚氨基不解离，酸碱性取决于端-NH3+和端和端-COO-以及侧链上可解离以及侧链上可解离的基团。的基团。-羧基，羧基，-氨基和侧链氨基和侧链R基上的活性基团基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。都能发生与游离氨基酸相似的反应。凡有肽键结构的化合物都会发生双缩脲凡有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。双缩脲反应是反应，可用于定量分析。双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应。肽和蛋白质特有的反应。旋光性旋光性:一般短肽的旋光度等
9、于其各个氨一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和基酸的旋光度的总和;蛋白质水解得到的蛋白质水解得到的各种短肽各种短肽,只要不发生消旋作用只要不发生消旋作用,也具有也具有旋光性旋光性.（二）肽的物理和化学性质先分别判断各解离基团带电情况,再统计净电荷的量（二）肽的物理和化学性质可解离功能基团推测的PKa值可解离功能基团推测的PKa值-COOH3.7-SH 8.8侧链-COOH4.6酚-OH 9.6咪唑基(His)7.0-NH3+10.2-NH3+7.8胍基12肽 pI 的计算:从模型化合物获得数据推测的多肽连可解离基团的pKa值 pI=1/2(4.5+7.8)=6.15（三）天然存在的活
10、性肽(自学)解离范围功能基团解离(带电)状况占优势离子净电荷-COOH侧链-COOH-NH2-NH23.5-COOH-COOH-NH3+-NH3+23.74.5-COO-COOH-NH3+-NH3+14.57.8-COO-COO-NH3+-NH3+07.810.2-COO-COO-NH2-NH3+-110.2-COO-COO-NH2-NH2-2以四肽甘氨酰 谷氨酰赖氨酰丙氨酸的酸碱性质分析一、蛋白质的分子大小一、蛋白质的分子大小二、蛋白质结构的组织层次二、蛋白质结构的组织层次三、肽三、肽四、蛋白质测序的策略四、蛋白质测序的策略五、蛋白质测序的一些常用方法五、蛋白质测序的一些常用方法六、根据基因
11、的核苷酸序列推定多肽的氨基六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基七、蛋白质一级结构的举例七、蛋白质一级结构的举例八、蛋白质序列数据库八、蛋白质序列数据库九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成教学内容教学内容四、蛋白质测序的策略测定多肽链的数目测定多肽链的数目:单体蛋白或同具体蛋白含一种多肽链单体蛋白或同具体蛋白含一种多肽链;杂多聚蛋白含杂多聚蛋白含多种多肽链；多种多肽链；拆分多肽链拆分多肽链:非共价结合非共价结合,用变性剂如尿素用变性剂如尿素,盐酸胍或高浓度盐盐酸胍或高浓度盐;多肽链多肽链之间有二硫键之间有二硫键(胰岛素胰岛素),用氧化剂或还原剂；用氧化剂
12、或还原剂；多肽链内二硫键的断裂多肽链内二硫键的断裂:在步骤在步骤4 之前断裂之前断裂,否则影响后面的测序；否则影响后面的测序；分析每一条多肽链的氨基酸组成分析每一条多肽链的氨基酸组成:酸水解、碱水解或酶解；酸水解、碱水解或酶解；鉴定多肽链的鉴定多肽链的N-末端和末端和C-末端氨基酸残基末端氨基酸残基:鉴定两个末端，作重建肽链氨基酸顺序的参考点；鉴定两个末端，作重建肽链氨基酸顺序的参考点；用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段；用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段；测定各肽段的氨基酸序列；测定各肽段的氨基酸序列；拼接各肽段成完整的多肽链；拼接各肽段成完整的多肽链；确定二硫键的位置。确定二硫键的位置
13、。四、蛋白质测序的策略一、蛋白质的分子大小一、蛋白质的分子大小二、蛋白质结构的组织层次二、蛋白质结构的组织层次三、肽三、肽四、蛋白质测序的策略四、蛋白质测序的策略五、蛋白质测序的一些常用方法五、蛋白质测序的一些常用方法六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基六、根据基因的核苷酸序列推定多肽的氨基七、蛋白质一级结构的举例七、蛋白质一级结构的举例八、蛋白质序列数据库八、蛋白质序列数据库九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成教学内容教学内容(一)末端分析(二)二硫键的断裂(三)氨基酸组成的分析(四)多肽链的部分裂解(五)肽段氨基酸序列的测定(六)肽段在原多肽链中的
14、次序的确定(七)二硫键位置的确定五、蛋白质测序的一些常用方法(一)末端分析1.N-末端分析末端分析DNP-多肽经酸水解后,只有N-末端残基变成黄色的DNP-氨基酸；DNP-氨基酸经有机溶剂提取，用层析法鉴定2.羧基末端分析：羧基末端分析：采用羧肽酶法丹磺酰氯（5-二甲基氨基-1-萘磺酰氯）2,4-二甲基氨基-偶氮苯-4-磺酰氯N-末端分析的试剂还有：（二）二硫桥的断裂一般用酸水解：6 mol/L HCl，1101024 h，Trp 破坏，Ser、Thr、Tyr也被破坏,程度与保温时间有线性关系;辅之以碱水解:5 mol/L NaOH,110,20 h;氨基酸自动分析仪；表示方法：一般用每摩尔蛋
15、白质中所含的氨基酸残基的摩尔数表示.（三）氨基酸组成的分析氨基酸残基数氨基酸残基数/蛋白质分子蛋白质分子马心细胞马心细胞色素色素c牛胰核糖牛胰核糖核酸酶核酸酶菠菜铁氧菠菜铁氧还蛋白还蛋白人碳酸人碳酸酐酶酐酶氨基酸氨基酸残基总数残基总数（四）多肽链的部分裂解胰蛋白酶：胰蛋白酶：R1=Lys或或Arg（专一要求）；（专一要求）；R2=Pro（抑制水解）（抑制水解）胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶:R1=Phe、Trp或或Tyr（水解速率快）；（水解速率快）；R2=Pro（抑（抑制水解）制水解）胃蛋白酶：胃蛋白酶：R2=Phe、Trp、Tyr或或Val等疏水残基（水解速度快）；等疏水残基（水解速度快）；Rl
16、=Pro（抑制水解）（抑制水解）葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶:Rl=Asp或或Glu溴化氰（溴化氰（CNBr）：）：Rl=Met肽段用凝胶过滤、凝胶电泳和肽段用凝胶过滤、凝胶电泳和 HPLC 等方法分离等方法分离苯胺基苯胺基噻唑啉酮噻唑啉酮苯乙内酰硫苯乙内酰硫脲氨基酸脲氨基酸(PTH-氨基酸氨基酸)苯氨基苯氨基硫甲酰肽硫甲酰肽pH 9(五)肽段氨基酸序列的测定Edman 化学降解法化学降解法(六)肽段在原多肽链中的次序决定Partial protein digest of sample is smeared along one edge of paperMigration of peptide
17、stoward negetive electrodeSample strip is cut fromelectrophoretogram and treatedwith performic acid vaporsPerformic acidHCOOOH-treated strip is attached to new sheet of paper and second electrophoresis run is performedPeptides derived from disulfide-linked protein fragmentsDiagonalBuffer（七）二硫键位置的确定六
18、、根据基因的核苷酸序列推定多肽链的氨基酸序列用对角线电泳法用对角线电泳法胰岛胰岛细胞分泌，前胰岛素原细胞分泌，前胰岛素原内质网腔酶切信号肽（内质网腔酶切信号肽（N-端约端约20个残基）个残基）胰岛素原胰岛素原 高尔基体酶切连接胰岛素高尔基体酶切连接胰岛素B链链C端和端和A链链N端连接肽端连接肽(C肽肽,约约30个残基个残基)成熟胰岛素成熟胰岛素1953，Sanger F 等首次完成了胰岛素的全部结构测定工作等首次完成了胰岛素的全部结构测定工作七、蛋白质一级结构的举例胰岛素(insulin):欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多万条肽链的信息；美国国家
19、生物医学基金会主持的PIR有近30万条肽链的信息，但多数由核酸信息翻译而来，有些未经严格检验。美国政府支持的Gen Bank和欧洲的 EMBL有大量的基因序列信息，从其阅读框可以得到蛋白质序列的不少信息。八、蛋白质序列数据库九、肽与蛋白质的化学合成：固相肽的合成保护基应具备的条件：起到保护作用；易除去而不引起肽键断裂9-芴甲氧羰基Insoluble polystyrene beadAttachment of carboxyl-terminal amino acid to reactive group on resin.Protecting group is removed by flushin
20、g with solution containing a mild organic base.去保护基去保护基连接连接Dicyclohexylcarbodiimide(DCC)Amino acid 2 with protected-amino group is activated at carboxyl group by DCC.活化活化-amino group of amino acid 1 attacks activated carboxyl group of amino acid 2 to form peptide bond.Dicyclohexylurea byproductCompl
21、eted peptide is deprotected as in reaction；HF cleaves ester linkage between peptide and resin.缩合缩合 裂解裂解不溶性树脂不溶性树脂连接：连接：-氨基被保护的氨基酸氨基被保护的氨基酸1 1与树脂的反应基团连接与树脂的反应基团连接去保护基：去保护基：用用CF3COOH/CH2Cl2冲洗并用二异丙乙胺冲洗并用二异丙乙胺/CH2Cl2中和中和异丁烯异丁烯+CO2异丁烯异丁烯+CO2（在（在CH2Cl2中）中）活化：氨基活化：氨基酸酸2与与DCC反反应形成活化应形成活化酯酯缩合：氨基酸缩合：氨基酸1 1的的-氨基进攻氨氨基进攻氨基酸基酸2 2的被活化的羧基形成肽键的被活化的羧基形成肽键N,N-二环二环己基脲己基脲裂解：去保护基并用裂解：去保护基并用HF/CH2Cl2断断裂肽与树脂间的酯键裂肽与树脂间的酯键(根据需要重复根据需要重复到到)作业题：第作业题：第4 4、7 7、8 8三题三题基本要求：基本要求：掌握肽键的结构特点掌握肽的理化性质掌握蛋白质测序的一些常用方法可以书山有路勤为径，不要学海无涯苦作舟！可以书山有路勤为径，不要学海无涯苦作舟！