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1、气相、液相色谱技术气相、液相色谱技术及应用及应用昆虫生理毒理组昆虫生理毒理组一、色谱学发展简史一、色谱学发展简史二、色谱学基本原理二、色谱学基本原理三、色谱仪的基本结构三、色谱仪的基本结构 一、色谱学发展简史一、色谱学发展简史二、色谱学基本原理二、色谱学基本原理三、色谱仪的基本结构三、色谱仪的基本结构 l色谱法（色谱法（chromatography）是是20世纪初世纪初由俄国植物学家由俄国植物学家Tswett发明并命名的发明并命名的 1903年，他做了一个著名的实验，把干年，他做了一个著名的实验，把干燥的叶用石油醚萃取后，将少量的萃取燥的叶用石油醚萃取后，将少量的萃取液倾入填充有沉降液倾入填充
2、有沉降CaCO3的直立玻璃管的直立玻璃管柱的顶端，然后用石油醚洗脱，发现叶柱的顶端，然后用石油醚洗脱，发现叶中的色素在中的色素在CaCO3柱上互相分离，形成柱上互相分离，形成不同颜色的色带。他把这种方法命名为不同颜色的色带。他把这种方法命名为色谱法（色谱法（Chromatography）。）。l1931年年，Kuhn和和Lederer用用填填充充氧氧化化铝铝粉粉末末的的柱柱管管将将胡胡萝萝卜卜素素中中两两种种性性质质非非常常相相似似的的烃烃的的异异构构体体（-和和-胡胡萝萝卜卜素素）分分离离成成功功，才才引引起起人人们们的的注注意意，认认识识到到色色谱谱法法在分离混合物方面有着广阔的前景。在分
3、离混合物方面有着广阔的前景。l1940-1943年年，Tiselius发发展展了了吸吸附附色色谱谱，并并由由于于在在吸吸附附色色谱谱和和电电泳泳等等方方面面做做出出的的重重要贡献而获得要贡献而获得1948年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。l1941年年，Martin和和Synge在在研研究究氨氨基基酸酸分分离离时时又又发发明明了了分分配配色色谱谱法法，他他们们因因此此获获得得了了1952年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。一、色谱学发展简史一、色谱学发展简史二、色谱学基本原理二、色谱学基本原理三、色谱仪的基本结构三、色谱仪的基本结构 l色谱是一种分离技术，当这种分离技术色谱是一种分离技术，当这种
4、分离技术应用于化学分析，就是色谱分析应用于化学分析，就是色谱分析l色谱分析的基本要求是实现各混合物的色谱分析的基本要求是实现各混合物的分离分离l它的分离原理是使混合物中各组分在两它的分离原理是使混合物中各组分在两相间进行分配：即固定相、流动相相间进行分配：即固定相、流动相l固定相分两类：活性固体、活性液体固定相分两类：活性固体、活性液体l流动相一般为惰性气体或有机溶剂流动相一般为惰性气体或有机溶剂1.色谱法分类色谱法分类 按两相物理状态分类：按两相物理状态分类：气气-固色谱（固色谱（gas-solid chromatography,GSC）气气-液色谱（液色谱（gas-liquid chrom
5、atography,GLC）液液-固色谱（固色谱（liquid-solid chromatography,LSC）液液-液色谱（液色谱（liquid-liquid chromatography,LLC）按固定相形态分类：按固定相形态分类：填充柱色谱填充柱色谱柱色谱柱色谱 毛细柱色谱（开管式色谱）毛细柱色谱（开管式色谱）1.色谱法分类色谱法分类 按分离过程物理化学原理分类：按分离过程物理化学原理分类：吸附色谱吸附色谱：用固体吸附剂做色谱固定相，样品各：用固体吸附剂做色谱固定相，样品各组分在吸附剂上吸附力大小不同。组分在吸附剂上吸附力大小不同。分配色谱分配色谱：用液体做固定相，利用试样组分在固：用
6、液体做固定相，利用试样组分在固定相中溶解、吸收或吸着能力不同，因而两相定相中溶解、吸收或吸着能力不同，因而两相分配系数不同进行分离。分配系数不同进行分离。离子交换色谱：离子交换剂为固定相，分离离子离子交换色谱：离子交换剂为固定相，分离离子型化合物型化合物还有：离子对色谱、凝胶色谱、络合色谱、亲和还有：离子对色谱、凝胶色谱、络合色谱、亲和色谱等。色谱等。2.色谱过程色谱过程:由由于于各各组组分分在在固固定定相相的的分分配配系系数数或或吸吸附附和和脱脱附附能能力力有有差差异异，各各组组分分在在色色谱谱柱柱中中的的滞滞留留时时间间也也就就不不同同，即即它它们们在在柱柱中中向向前前移移动动的速率不同。
7、的速率不同。随随着着流流动动相相不不断断流流过过，组组分分在在柱柱中中两两相相间间经经过过了了反反复复多多次次的的分分配配和和平平衡衡过过程程，当当移移动动一一定定柱柱长长以以后后，试试样样中中各各组组分分即即可可得得到到较完整的分离。较完整的分离。色谱图的基本结构色谱图的基本结构：1基线基线 2色谱峰色谱峰 3峰高与峰面积峰高与峰面积 4 保留时间保留时间 色谱图：色谱图：色谱图：色谱图：一、色谱学发展简史一、色谱学发展简史二、色谱学基本原理二、色谱学基本原理三、色谱仪的基本结构三、色谱仪的基本结构 流流 动动 相相供供 输输 系系统统进进 样样器器色色谱谱柱柱（恒温箱）（恒温箱）检检测测器
8、器（恒温箱）（恒温箱）数数据据处处理理系统系统组组分分收收集集系统系统控控制制显显示示系系统统（计算机）（计算机）三、色谱仪的基本结构三、色谱仪的基本结构 3.1 气相色谱仪 3.2 液相色谱仪三、色谱仪的基本结构三、色谱仪的基本结构 3.1 气相色谱仪 3.2 液相色谱仪3.1气相气相色谱仪的基本结构色谱仪的基本结构3.1气相气相色谱仪的基本结构色谱仪的基本结构l流动相：气流动相：气-液色谱分离中载气是惰性的，液色谱分离中载气是惰性的，仅携带样品通过色谱柱。气仅携带样品通过色谱柱。气-固色谱载气固色谱载气与组分一起与固体吸附剂作用，因而对与组分一起与固体吸附剂作用，因而对气谱分离具有一定影响
9、。气谱分离具有一定影响。l一般载气主要为：氮、氢、氦、氩、空一般载气主要为：氮、氢、氦、氩、空气、氧气、二氧化碳等。气、氧气、二氧化碳等。l要求：纯度高要求：纯度高3.1 气相气相色谱仪的基本结构色谱仪的基本结构l进样系统：进样就是把试样快速、进样系统：进样就是把试样快速、准确的加到色谱柱头。若试样为纯准确的加到色谱柱头。若试样为纯液体或溶液，则要求在进样系统中液体或溶液，则要求在进样系统中瞬间气化。进样系统包括进样口、瞬间气化。进样系统包括进样口、气化室。气化室的温度通常比试样气化室。气化室的温度通常比试样中最难气化的组分的沸点高中最难气化的组分的沸点高50。3.1 气相气相色谱仪的基本结构
10、色谱仪的基本结构l气谱柱：色谱柱包括填充柱和毛细柱，填充柱气谱柱：色谱柱包括填充柱和毛细柱，填充柱是在柱内均匀、紧密填充固定相颗粒的色谱柱。是在柱内均匀、紧密填充固定相颗粒的色谱柱。填充柱管通常用玻璃、金属（不锈钢、铜、铝）填充柱管通常用玻璃、金属（不锈钢、铜、铝）或聚四氟乙烯制成。柱长或聚四氟乙烯制成。柱长1-3m。填充剂可以是填充剂可以是吸附剂（气吸附剂（气-固色谱），也可以是涂有固定液固色谱），也可以是涂有固定液的载体（气的载体（气-液色谱）。毛细柱一般为开管柱，液色谱）。毛细柱一般为开管柱，即在毛细柱内壁上涂有固定液。即在毛细柱内壁上涂有固定液。3.1 气相气相色谱仪的基本结构色谱仪的
11、基本结构l固定相固定相:气气-固色谱以固体吸附剂作为固定相，例固色谱以固体吸附剂作为固定相，例如：炭质吸附剂、硅胶、氧化铝等。如：炭质吸附剂、硅胶、氧化铝等。气气-液色谱以涂有固定液的载体作为固定液色谱以涂有固定液的载体作为固定相。固定液系涂渍在载体表面上起分离相。固定液系涂渍在载体表面上起分离作用的物质，在操作温度下不易挥发的作用的物质，在操作温度下不易挥发的物质。例如：聚硅氧烷物质。例如：聚硅氧烷。3.1 气相气相色谱仪的基本结构色谱仪的基本结构l检检测测器器：是是能能检检测测色色谱谱柱柱流流出出组组分分及及这这些些组组分分量量的的变变化化的的器器件件，其其功功能能是是将将经经色色谱谱分分
12、离离的的组组分分的的物物质质信信号号转转化化为为易易于于测测量量的的电电信信号号，故故也也称称为为“换换能能器器”。最最常常用用的的检检测测器器是是热热导导检检测测器器（TCD）和和火火焰焰离离子子化化检检测测器器（FID）。此此外外，电电子子俘俘获获检检测测器器（ECD）和火焰光度检测器（和火焰光度检测器（FPD）也用得比较多。也用得比较多。问题：问题：l1、为什么程序升温可以更好的实现混合、为什么程序升温可以更好的实现混合物的分离？物的分离？问题：问题：l恒温气相色谱的柱温恒定在试样平均沸恒温气相色谱的柱温恒定在试样平均沸点，如试样的沸程很宽，则低沸点组分点，如试样的沸程很宽，则低沸点组分
13、因柱温太高而色谱峰窄，相互重叠，而因柱温太高而色谱峰窄，相互重叠，而高沸点组分又因柱温太低，洗出很慢，高沸点组分又因柱温太低，洗出很慢，有些甚至不能洗出有些甚至不能洗出 如果采用程序升温，采用足够低的初始如果采用程序升温，采用足够低的初始温度，低沸点组分最先洗出，得到很好温度，低沸点组分最先洗出，得到很好分离，随着柱温升高，较高沸点的组分分离，随着柱温升高，较高沸点的组分也能较快洗出，得到良好的峰形也能较快洗出，得到良好的峰形问题：问题：l2、为什么需要分流？、为什么需要分流？由于开管柱载气体积流速很小，将样品由于开管柱载气体积流速很小，将样品从汽化室冲洗到色谱柱需要较长时间，从汽化室冲洗到色
14、谱柱需要较长时间，导致进样器内色谱带扩张。此外，开管导致进样器内色谱带扩张。此外，开管柱样品容量小，采用填充柱常规进样方柱样品容量小，采用填充柱常规进样方式，引入样品量将超过色谱柱负荷式，引入样品量将超过色谱柱负荷问题：问题：l3、气谱峰的拖尾与哪些因素有关？如何、气谱峰的拖尾与哪些因素有关？如何消除？消除？问题：问题：l与载体、样品类型、进样量等因素有关。与载体、样品类型、进样量等因素有关。样品含脂肪烃、芳香烃、烯烃等成较弱样品含脂肪烃、芳香烃、烯烃等成较弱的拖尾；含羟基、羧基的醇、酸等严重的拖尾；含羟基、羧基的醇、酸等严重拖尾；脂类拖尾较小。拖尾；脂类拖尾较小。进样量小，拖尾弱，进样量大，
15、拖尾严进样量小，拖尾弱，进样量大，拖尾严重。重。问题：问题：l尽量减少进样量尽量减少进样量l形成衍生物形成衍生物使用气相色谱注意事项使用气相色谱注意事项l综上所述，使用仪器时，应注意：综上所述，使用仪器时，应注意：1.样品要进行净化，提纯样品要进行净化，提纯 2.进样量要控制在一定范围内进样量要控制在一定范围内 3.进样要迅速进样要迅速 4.柱温要控制在柱温要控制在300 以内，以免损害柱以内，以免损害柱子子三、色谱仪的基本结构三、色谱仪的基本结构 3.1 气相色谱仪 3.2 液相色谱仪3.2 液相色谱的基本结构液相色谱的基本结构l流动相：种类较多。改变流动相的性质流动相：种类较多。改变流动相
16、的性质和组成，是提高色谱系统分离度和分析和组成，是提高色谱系统分离度和分析速度的重要手段速度的重要手段l基本要求：保持色谱柱的稳定性、化学基本要求：保持色谱柱的稳定性、化学惰性、必须适合所使用的检测器、具有惰性、必须适合所使用的检测器、具有溶解样品的能力、溶剂的清洗和更换方溶解样品的能力、溶剂的清洗和更换方便、毒性小、价格便宜、纯度高便、毒性小、价格便宜、纯度高3.2 液相色谱的基本结构液相色谱的基本结构l色谱柱：采用优质不锈钢管或硬质玻璃色谱柱：采用优质不锈钢管或硬质玻璃管。最好是直形柱。装柱方法复杂，需管。最好是直形柱。装柱方法复杂，需要高压泵加压。要高压泵加压。l硅胶是高效液相色谱应用最
17、多的固定相硅胶是高效液相色谱应用最多的固定相填料。最重要的有两种：表面多孔层硅填料。最重要的有两种：表面多孔层硅胶，全多孔微粒硅胶。胶，全多孔微粒硅胶。3.2 液相色谱的基本结构液相色谱的基本结构l高压泵：它将流动相在高压下连续不断地高压泵：它将流动相在高压下连续不断地送入色谱系统。高压泵的性能直接影响整送入色谱系统。高压泵的性能直接影响整机的稳定性、重复性和分析精度。机的稳定性、重复性和分析精度。它应具有如下性能：流量稳定；流量它应具有如下性能：流量稳定；流量范围宽，且连续可调；输出压力高、密封范围宽，且连续可调；输出压力高、密封性能好；耐腐蚀；操作、更换溶剂方便性能好；耐腐蚀；操作、更换溶
18、剂方便。3.2 液相色谱的基本结构液相色谱的基本结构l检测器：常用的有紫外检测器检测器：常用的有紫外检测器（ultraviolet detector,UV）和荧光检测和荧光检测器（器（fluorescence detector,FD）。）。两种色谱法的特点两种色谱法的特点 1、气相色谱法气相色谱法 （1）高选择性：能够分离分析性质极为）高选择性：能够分离分析性质极为相近的物质相近的物质 （2）高效能）高效能（3）高灵敏度）高灵敏度 （4）分析速度快）分析速度快 但由于它要求试样必须能够气化，使其但由于它要求试样必须能够气化，使其应用受到一定限制。应用受到一定限制。两种色谱法的特点两种色谱法的特
19、点2、高效液相色谱法、高效液相色谱法（HPLC）（1）高效高效（2）高速）高速（3）较高灵敏度）较高灵敏度（4）高度自动化）高度自动化 高效液相色谱法具有应用范围广的优高效液相色谱法具有应用范围广的优点，表现在：点，表现在：（1）HPLC不受试样挥发性和相对分子质量的限制，不受试样挥发性和相对分子质量的限制，可用于分离高沸点、相对分子质量大、热稳定性差可用于分离高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物，还可用于各种离子的分离。的有机化合物，还可用于各种离子的分离。（2）HPLC不仅可利用被分离组分的极性差别，还可不仅可利用被分离组分的极性差别，还可利用组分分子尺寸大小的差别、离子交换能力
20、的差利用组分分子尺寸大小的差别、离子交换能力的差别以及生物分子间亲和力的差别进行分离。它还可别以及生物分子间亲和力的差别进行分离。它还可以用多种溶剂作为流动相，对于性质和结构类似的以用多种溶剂作为流动相，对于性质和结构类似的物质，分离的可能性比气相色谱法更大。物质，分离的可能性比气相色谱法更大。（3）HPLC易于收集流出的组分，可利用制备柱进行易于收集流出的组分，可利用制备柱进行较大量的制备较大量的制备。气相色谱仪的应用气相色谱仪的应用多重联用多重联用 气相色谱气相色谱-质谱（质谱（GC-MS）液相色谱液相色谱-质谱（质谱（LC-MS）曾经是实验室里最需要曾经是实验室里最需要并被认为是一定会出
21、现的技术装备。并被认为是一定会出现的技术装备。今天的色谱技术发展是日新月异，不今天的色谱技术发展是日新月异，不但与质谱连用，还与液谱、红外光谱仪、但与质谱连用，还与液谱、红外光谱仪、EAG等连用，大大的加大了其应用范围。等连用，大大的加大了其应用范围。气相色谱气相色谱仪与仪与EAG连用连用气气谱谱进进样口样口毛毛细细管管柱柱触触 角角 检检测器测器双双通通道道记记录仪录仪气气 谱谱 的的 FID检测器检测器气相色谱在昆虫学中的应用气相色谱在昆虫学中的应用l气相色谱应用于昆虫化学生态学气相色谱应用于昆虫化学生态学昆虫性信息素的研究昆虫性信息素的研究 昆虫抑卵信息素的昆虫抑卵信息素的 研究研究气相
22、色谱在昆虫学中的应用气相色谱在昆虫学中的应用l气相色谱应用于昆虫化学生态学气相色谱应用于昆虫化学生态学昆虫性信息素的研究昆虫性信息素的研究 昆虫抑卵信息素的昆虫抑卵信息素的 研究研究气相色谱在昆虫学中的应用气相色谱在昆虫学中的应用气相色谱在昆虫学中的应用气相色谱在昆虫学中的应用l在昆虫分类中的应用在昆虫分类中的应用 利用气相色谱技术对昆虫表皮碳氢化合物进利用气相色谱技术对昆虫表皮碳氢化合物进行分析，并以此来对昆虫进行分类鉴定，是行分析，并以此来对昆虫进行分类鉴定，是近年来昆虫分类研究的一种新方法。它主要近年来昆虫分类研究的一种新方法。它主要用于近缘种及种下类群的分类研究。用于近缘种及种下类群的
23、分类研究。例如：用气相色谱例如：用气相色谱(GC)分析冈比亚按蚊分析冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）复合组中两个近缘种复合组中两个近缘种An.arabiensis、An.gambiae，结果发现结果发现C25-39的化合物分布有种间差异。的化合物分布有种间差异。岛津气谱仪操作过程：岛津气谱仪操作过程：1.开氮气，平衡十分钟开氮气，平衡十分钟2.打开气相色谱仪开关，转换器开关，计算机开关打开气相色谱仪开关，转换器开关，计算机开关3.打开打开Class-GC10程序程序4.调出调出realtime 系统，设置程序升温，点击系统，设置程序升温，点击system on，激活激活5.开氢
24、气、空气，平衡十分钟开氢气、空气，平衡十分钟6.点火点火岛津气谱仪操作过程：岛津气谱仪操作过程：l关机关机1.设设置置降降温温程程序序：进进样样口口、柱柱温温、检检测测器器都都为为25，等待降温。，等待降温。2.降温之后，关闭程序降温之后，关闭程序3.关机，关闭色谱仪，转换器，拔掉电源。关机，关闭色谱仪，转换器，拔掉电源。4.关氢气、氮气、空气。关氢气、氮气、空气。5 5整理桌面，关灯。整理桌面，关灯。Class-GC10工作站工作站l工作站结构包括：修改和设定气谱条件工作站结构包括：修改和设定气谱条件部分部分(configuration)configuration)，实时分析系统实时分析系统
25、（real time analysis)real time analysis)，分析数据和修分析数据和修改文件部分改文件部分(post run analysis)post run analysis)等。等。l它可以把电信号传输到电子计算机上，它可以把电信号传输到电子计算机上，并且进行分析。大大减轻了研究者的劳并且进行分析。大大减轻了研究者的劳动量。动量。Class-GC10工作站的操作工作站的操作打开打开real time analysisreal time analysis，打开打开setupsetup窗口，窗口，进入进入TempTemp窗口，设置柱温，检测器，进窗口，设置柱温，检测器，进样口温度及升温程序，点击样口温度及升温程序，点击system onsystem on，打开打开GC MonitorGC Monitor。等到窗口出现等到窗口出现ReadyReady，进入进入Sample LoginSample Login窗窗口，输入分析试样资料，保存。口，输入分析试样资料，保存。进样，点击进样，点击start,start,开始分析。开始分析。谢谢