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1、GenesmRNAsProteinsLoss-of-FunctionPhenotypesTools for Functional Analysis Knockouts Dominant Negative(显型负显型负 突变突变)Antibodies Aptamers(寡寡核苷酸适配子核苷酸适配子)Antisense Ribozymes siRNAsDemonstration of a casual role of a gene in the initiation,maintenance,or modulation of a phenotype by selective decrease(kno
2、ckdown)or lack(knockout)of gene function.Gene of Interest Gain of Function Loss of Function六、基因剔除技术（一）基因剔除技术的概念基基因因剔剔除除（gene gene knock knock outout）或或基基因因靶靶向向(gene gene targeting)targeting)灭灭活活是是将将生生物物体体中中某某一一特特定定的的基基因因功功能能给给破破坏坏，再再研研究究当当生生物物体体缺缺少少这这个个基基因因在在生生长长发发育育的的过过成成中中会会有有怎怎样样的的改改变，或是会好发怎样的疾病。
3、变，或是会好发怎样的疾病。n原理：利用原理：利用细胞复制分裂时细胞复制分裂时，染色，染色体体进行进行联合互换发生同源重组联合互换发生同源重组homologous recombination）Prdx1 geneES cell胚胎胚胎杂杂合子合子Prdx+/-纯纯合子合子Prdx-/-Prdx1+/+:wide type mice(N=34)Prdx1+/-：Prdx1 heteroxygous mice(N=88)Prdx1-/-：Prdx1 knock out mice(N=64)Sourthern blot-DNANothern blot-RNAGeneration of Prdx1-/-
4、mice进入多重防护的SPF动物室检查受精母鼠取胚胚显微注射DNA显微注射显微注射完成胚植入输卵管养殖小鼠动物饲养动物饲养（二）基因剔除技术的应用 阐明特定基因功能、基因间相互作用阐明特定基因功能、基因间相互作用 阐明基因结构与功能异常在疾病发生、演阐明基因结构与功能异常在疾病发生、演进和归转中的作用，即疾病分子调控机制进和归转中的作用，即疾病分子调控机制 在精确的时间、组织打开或关闭特定基因在精确的时间、组织打开或关闭特定基因 可对基因进行单个碱基或大片段的修饰可对基因进行单个碱基或大片段的修饰 确定药物作用的分子靶点，有效筛选新药确定药物作用的分子靶点，有效筛选新药Model Organi
5、sms Used in Functional GenomicsMajor Events in the Development of Gene Targeting骨保护蛋白骨保护蛋白(Osteoprotegerin,OPG)+/+-/-转基因鼠转基因鼠基因剔除鼠基因剔除鼠骨硬化骨硬化骨质疏松症骨质疏松症Procedure of Knockout Mice七、七、RNA干扰技术干扰技术（一）（一）RNA干扰技术的概念干扰技术的概念生生物物体体内内，双双链链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，能能识识别别含含有有其其互互补补序序列列的的mRNA并并与与之之结结合合，在在酶酶
6、的的作作用用下下降降解解mRNA，从从而而干干扰扰相相应应基基因因表表达达。这这一一现现象象称为称为RNA干扰干扰(RNA interference，RNAi)。RNAi在在生生物物抵抵御御病病毒毒感感染染、维维持持基基因因组组中中转转座座子子的的稳稳定定以以及及某某些些生生物物生生殖殖细细胞胞的的发发育育过过程中都起着重要作用。程中都起着重要作用。（细胞膜）（细胞膜）（细胞核）（细胞核）（细胞质）（细胞质）基因的表达转录转录翻译翻译（转运（转运RNA）（核糖体（核糖体RNA）RNAiRNAi现象的发现现象的发现 19951995年，康奈尔大学的研究人员年，康奈尔大学的研究人员GuoGuo和和
7、KemphuesKemphues尝试用尝试用反义反义RNARNA去阻断去阻断par-1par-1基因基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNARNA的确能够阻断的确能够阻断par-1par-1基因的表达，但是奇怪基因的表达，但是奇怪的是，注入的是，注入正义链正义链RNARNA作为对照，也同样阻作为对照，也同样阻断了该基因的表达。断了该基因的表达。Guo S,Kemphues KJ.par-1,a gene required for establishing polarity in C.elegans embryos,encodes a putative Se
8、r/Thr kinase that is asymmetrically distributed.Cell.1995;81(4):611-20.Section of Genetics and Development,Cornell University,Ithaca,New York 14853,USA.基因沉默，即基因沉默，即性状不表现性状不表现外源导入或者转外源导入或者转基因表达反义基因表达反义RNA，抑制抑制rRNA和和tRNA的翻译。的翻译。FireFire等等(1998)(1998)发现将发现将dsRNAdsRNA注入线虫体内后注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达可抑制序列同源基因的
9、表达,并证实这种抑制并证实这种抑制主要作用于转录之后，所以又称转录后基因沉主要作用于转录之后，所以又称转录后基因沉默默(post transcriptional gene silencingpost transcriptional gene silencing,PTGS),PTGS)。该课题组将这一现象称为该课题组将这一现象称为RNARNA干扰（干扰（RNA RNA interferenceinterference，简称简称RNAiRNAi）。）。Fire A,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded R
10、NA in C.elegans.Nature.1998;391(6669):806-11.（二）（二）RNA干扰技术的原理干扰技术的原理（3步骤）dsRNA的形成的形成siRNA的形成的形成RNAi的形成的形成靶基因靶基因mRNAsiRNA的反义链的反义链RNAi是生物体抵御外源遗传物质是生物体抵御外源遗传物质入侵的自我入侵的自我 保护机制。保护机制。mRNAmRNA被酶切破坏，性状无法表达。被酶切破坏，性状无法表达。dsRNA：外源或内外源或内生，或病毒或其他生，或病毒或其他双链双链RNA；或异常或异常RNA由由RdRP催化催化合成双链合成双链RNAsiRNADicer核酸酶核酸酶特异性蛋白
11、结合，特异性蛋白结合，siRNA解链解链活化的活化的siRNA复合体复合体(RISC)靶基因的靶基因的mRNAsiRNADicer核酸酶核酸酶核酸酶降解核酸酶降解mRNARdRP催化合成新的双链催化合成新的双链RNA（dsRNA）以反义以反义siRNA为引为引物物3555335随机降解性聚合酶链式反应（随机降解性聚合酶链式反应（random degradative PCR）InitiationStepATPATPADP+ppiADP+ppiDICERDICERKINASEKINASERdRPRdRPEffectorStep siRNA bindingsiRNA binding siRNA un
12、windingsiRNA unwinding RISC activationRISC activationDicersiRNA55335533RNA诱导沉默复合体（诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）的组成的组成 2 2 RNA binding RNA binding proteinsproteins RNA/DNA RNA/DNA HelicaseHelicase Translation Initiation Translation Initiation FactorFactor RNA-Dependent RNA RNA-Dependent
13、 RNA Polymerase(RdRP)Polymerase(RdRP)Transmembrane Transmembrane ProteinProteinVectorsexpressingsiRNAsU6H1siRNAVectorsexpressingsiRNAsU6Sense sequenceAnti-sense sequenceHair-pin loopSense sequenceAnti-sense sequence（二）（二）RNARNA干扰技术的应用干扰技术的应用1 1用于功能基因组分析用于功能基因组分析随着人类基因组计划的完成，科学家急随着人类基因组计划的完成，科学家急需一种新
14、的、快速的方法解读基因功能、基需一种新的、快速的方法解读基因功能、基因表达机制以及基因之间的相互关系。而因表达机制以及基因之间的相互关系。而RNAiRNAi技术已成为解决这些问题的重要手段。技术已成为解决这些问题的重要手段。RNAiRNAi可以高通量分析植物的全基因可以高通量分析植物的全基因组基因。组基因。在水稻和拟南芥的基因组测序完成在水稻和拟南芥的基因组测序完成后，人们获得了众多的候选基因，后，人们获得了众多的候选基因，RNAiRNAi为为注释和认识这些基因在植物体中所起的作注释和认识这些基因在植物体中所起的作用提供了一种快速、高效的鉴定方法。用提供了一种快速、高效的鉴定方法。2用于生物遗
15、传改良用于生物遗传改良 随着生活水平的提高，人们对植物随着生活水平的提高，人们对植物产品品质的要求也日益提高。例如油料产产品品质的要求也日益提高。例如油料产品中的硫甙含量、不饱和脂肪酸的含量，品中的硫甙含量、不饱和脂肪酸的含量，咖啡中的咖啡因的含量等。而传统育种很咖啡中的咖啡因的含量等。而传统育种很难同时改变作物多个品质性状。难同时改变作物多个品质性状。人们对一些生化物质代谢途径的认人们对一些生化物质代谢途径的认识使得分子改良成为可能。识使得分子改良成为可能。RNAiRNAi的功能之一是保护基因组不被的功能之一是保护基因组不被可移动的基因元件如转座子或病毒可移动的基因元件如转座子或病毒RNAR
16、NA的的侵犯，侵犯，RNAiRNAi效应为植物中利用效应为植物中利用siRNAsiRNA抗病抗病毒提供了广阔的前景。毒提供了广阔的前景。以靶以靶mRNAmRNA为模板的为模板的PCRPCR模式尤其适用模式尤其适用于抗变异病毒：只需要根据病毒保守的序于抗变异病毒：只需要根据病毒保守的序列设计列设计siRNAsiRNA，就可抑制所有的变异病毒。就可抑制所有的变异病毒。3用于基因治疗用于基因治疗 RNAiRNAi可以直接用于疾病相关基因的抑制，可以直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的。从而达到疾病治疗或预防的目的。在治疗病毒性疾病的研究中，可以设计针在治疗病毒性疾病的研究中，可以
17、设计针对病毒基因组对病毒基因组RNARNA的的siRNAsiRNA或针对宿主细胞病或针对宿主细胞病毒受体的毒受体的siRNAsiRNA来抗病毒。来抗病毒。针对乙型肝炎病毒针对乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒、呼呼吸道合胞体病毒吸道合胞体病毒、流感病毒流感病毒、脊髓灰质炎病脊髓灰质炎病毒毒、HIV-1HIV-1、SARSSARS等均取得了令人欣喜的体等均取得了令人欣喜的体外病毒抑制作用。外病毒抑制作用。20032003年爆发的非典型肺炎给人类健康带来极年爆发的非典型肺炎给人类健康带来极大的危害，引起全球关注。大的危害，引起全球关注。20052005年，中美科学家根据年，中美科学家根据RNA
18、RNA干扰的原理研制干扰的原理研制出了一种可有效抑制出了一种可有效抑制SARSSARS的新疗法：利用小型的新疗法：利用小型RNARNA片段阻碍基因的表达，即片段阻碍基因的表达，即RNARNA干扰干扰(RNAiRNAi)。冠状病毒基本结构冠状病毒基本结构 SARSSARS病毒核心为螺旋状排列的病毒核心为螺旋状排列的RNARNA及衣壳及衣壳（N N蛋白）组成的核壳体，其外为包膜。蛋白）组成的核壳体，其外为包膜。N N蛋蛋白是白是SARSSARS病毒重要结构蛋白，在病毒转录、病毒重要结构蛋白，在病毒转录、复制和成熟中起作用。病毒包膜复制和成熟中起作用。病毒包膜S S蛋白的功能蛋白的功能是与细胞受体结
19、合，使细胞发生融合，是是与细胞受体结合，使细胞发生融合，是SARSSARS冠状病毒侵染细胞的关键蛋白。冠状病毒侵染细胞的关键蛋白。乙肝病毒的结构乙肝病毒的结构针对乙肝病毒的针对乙肝病毒的RNAi技术可能治疗乙肝技术可能治疗乙肝RNAi用于肿瘤的治疗用于肿瘤的治疗生存素生存素(survivin)在细胞凋亡在细胞凋亡和周期调控中发挥重要作用。和周期调控中发挥重要作用。许多恶性肿瘤的生存素基因表许多恶性肿瘤的生存素基因表达增高，而正常组织无表达。达增高，而正常组织无表达。赵赵伟伟红红，郭郭俊俊明明，等等.生生存存素素siRNA表表达达质质粒粒对对MGC-803细细胞胞细细胞胞周周期期和和增殖的影响增殖的影响.世界华人消化杂志，世界华人消化杂志，2005，13：2302-2305空白对照空白对照 转染试剂转染试剂 空载质粒空载质粒 siRNA质粒质粒采用采用RNA干扰技术抑制胃癌细胞的生存素基因表达干扰技术抑制胃癌细胞的生存素基因表达RT-PCR 流式细胞仪检测流式细胞仪检测（三）三）RNAiRNAi的优点的优点简单易行，容易开展简单易行，容易开展与基因敲除相比实验周期短，成本低与基因敲除相比实验周期短，成本低与反义技术相比具有高度特异性和高效性与反义技术相比具有高度特异性和高效性可进行高通量基因功能分析可进行高通量基因功能分析