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1、第五章第五章 受精的机制受精的机制n n受精（fertilization）是指两性生殖细胞融合并形成具备双亲遗传潜能的新个体的过程。受精作用是发育的开端，一个新的生命从此开始。n n受精的第一个功能是将父母的基因传递给子代，第二个功能是激发卵细胞中确保发育正常进展的一系列反应。n n受精过程中几个重要的事件：精子与卵子的接触与识别、精子入卵、精子与卵子遗传物质的融合以及卵子的激活和发育开始。n受精既可以发生在体外，也可以在体内发生。1.成熟精子和卵子的结构2.精子和卵子的接触和识别3.精子入卵的调控4.卵子代谢的激活5.遗传物质的融合一、成熟精子和卵子的结构一、成熟精子和卵子的结构1.精子作用
2、的发现nA complex dialogue exists between egg and sperm.The egg activates the sperm metabolism that is essential for fertilization,and the sperm reciprocates by activating the egg metabolism needed for the onset of development.n1678年，荷兰显微镜专家Anton van Leeuwenhoek发现了精子，Nicolas Hartsoeker（the other co-disc
3、overer of sperm）描绘了一幅精子中存在一个预成的小人(a preformed human homunculus)的画面。n17世纪末，意大利的博物学家Lazzaro Spallanzani 发现过滤去除精子之后的精液不能使蟾蜍的卵子受精（filtered toad semen devoid of sperm would not fertilize eggs）。nIn 1824,J.L.Prevost and J.B.Dumas（French speaking）发现只有性成熟的雄性动物才能产生精子，而未成熟的和年老的动物体内都没有精子产生，同时他们还注意到骡的不育性。nThey c
4、laimed that sperm were not parasites,but rather the active agents of fertilization.They proposed that the sperm entered the egg and contributed materially to the next generation.nUntil the 1840s,A.von Kolliker described the formation of sperm from cells within the adult testes.It was only in 1876 th
5、at Oscar Hertwig and Herman Fol independently demonstrated sperm entry into the egg and the union of the two cells nuclei.nFertilization was at last recognized as the union of sperm and egg,and the union of sea urchin gametes remains one of the best-studied examples of fertilization.2.精子的结构人类精子由头部、中
6、部（颈部）和尾部组成。人类精子由头部、中部（颈部）和尾部组成。n n精子头部由顶体囊泡（acrosomal vesicle）和精核构成。大部分精子的细胞质在精子成熟过程中被排除。顶体位于精核前端，由高尔基体演化而来。顶体中含有多种水解酶，主要作用是溶解卵子的外膜。有些动物的顶体中还有与精卵识别有关的分子。整个精核是一致密结构，几乎看不到染色质丝和核仁，精子中所有的基因都不表达。n n不同的动物以不同的形式推动精子游动。大多数动物的精子依靠尾部或鞭毛波浪式的摆动，推动精子在水或雌性动物生殖道中移动。鞭毛具有特殊的结构，轴纤丝（axoneme）是鞭毛中起推动作用的主要部分，具有典型的“92”结构。
7、哺乳动物精子鞭毛的横切面，示中央的轴纤丝（central axoneme）和外围的纤丝（external fibers）。精子的运动装置鞭毛的超微结构，示微管排列的“92”结构。A.精子的成熟过程B、C分别为牛和小鼠的精子。3.卵子的结构 成熟卵子中合成和吸收了大量的物质，包括大量的蛋白质、核糖体和tRNA、mRNA、形态发生因子（morphogenetic factor）以及保护性化学物质（如Ig），为以后的生长和发育奠定了基础。海胆卵子的结构，示精子和卵子的大小比例。卵质外是质膜（plasma membrane），质膜外是卵黄膜（vitelline envelope）。质膜在受精时可以调控
8、特定的离子在卵子内外的流动，且能与精子质膜融合。卵黄膜能识别同一物种的精子，对受精的物种特异性有非常重要的作用。在哺乳动物中特称为透明带（zona pellucida），紧靠着透明带的一层滤泡细胞称为放射冠（corona radiata）。海胆未受精卵的扫描电镜照片，示卵黄膜（vitelline envelope）和质膜（plasm membrane）仓鼠卵子受精前的卵子被包裹在透明带（zona pellucida）内，透明带的外围为卵丘细胞（cumulus cell）层所包围。低倍显微镜下观察，小鼠未受精的卵细胞被卵丘细胞所包围。n皮层（cortex）是质膜下一层约5um厚的胶状胞质，比内部
9、的胞质硬，含有高浓度的肌动蛋白分子，受精时，聚合成微丝，延伸到细胞表面形成微绒毛（microvilli），帮助精子进入卵子。n皮层内有皮层颗粒（cortical granule），含消化酶、粘多糖、黏性糖蛋白和透明蛋白，阻止多精入卵并可以为卵裂球提供支持。二、二、精子和卵子的接触和识别精子和卵子的接触和识别n n受精过程中，精卵的识别具有种属特异性，即给定物种的卵子对同源精子的识别与结合具有绝对的特异性。造成这种特异性的原因在于雌雄配子表面具有某些结构互补的特异分子，通过这些特异分子之间的相互作用，保证了雌雄配子的正确识别。n n精子和卵子的相互作用主要分为5个步骤：1.精子的趋化性（chem
10、otaxis）2.精子的顶体反应，释放水解酶。3.精子与卵子外围的卵黄膜（透明带）结合4.精子穿过卵外的结构5.精卵细胞质膜的融合1、精子的趋化性：Action at a distance 精子的趋化性（chemotaxis）是指精子根据化学浓度梯度直接向卵子运动的现象。现已在许多动物中发现，其卵母细胞完成第二次减数分裂后，可以分泌具有物种特异性的的趋化因子如海胆的精子激活肽resact，构成卵周特有的微环境。加入10nM呼吸活化肽（resact）1纳升后，海胆精子的聚集。A、B、C和D示加入呼吸活化肽1、20、40、90秒后的观察结果ABCD2、精子获能 哺乳动物的精子需要在雌性生殖道中停留
11、一个特定的时期，以获得对卵子受精的能力，这一过程称为精子获能（capacitation）。获能期间，精子的细胞膜发生了一系列变化，包括内膜分子重排、精子表面某些成分移除，但分子机制还不很清楚。哺乳动物精子获能的位置随物种的不同有很大的差异，如许多啮齿类、猪和狗在输卵管获能。哺乳动物精子获能的模型哺乳动物精子的获能，牛精子在到达输卵管壶腹部之前与输卵管上皮细胞的接触。3.顶体反应（acrosomal reaction）顶体反应是指受精前精子在同卵子接触时，精子顶体产生的一系列变化。具有顶体结构的无脊椎动物或脊椎动物中，只有发生顶体反应的精子才能进入卵子并与卵子融合，也只有精子与卵子接触时才发生顶
12、体反应。海胆的顶体反应 精子与卵子胶膜结合后，可引起顶体反应。顶体发应包括两个主要的事件：顶体膜与精子质膜发生融合以及顶体突起（acrosomal process）的形成。顶体突起海胆精子的顶体反应过程 哺乳动物的顶体反应 哺乳动物的顶体是一个帽状结构，覆盖于精核的前端。顶体反应时，顶体帽部分的质膜与顶体外膜在多处发生融合，使顶体内的物质从融合处释放出来。仓鼠精子的顶体反应 精子顶体酶及其穿透作用 通过顶体反应释放的物质中含有大量的水解酶，因此顶体这一结构被认为具有类似溶酶体（lysosome）的功能。精子顶体酶的一个功能是在卵子外围打一个洞，另外顶体反应还与精卵结合有关。海胆的精卵识别 海胆
13、精子发生顶体反应后释放顶体酶，使卵细胞外的胶膜降解，精子穿越胶膜，其突起与卵黄膜(vitelline membrane)相互识别，与之融合，然后与卵细胞膜融合，导致精核进入卵细胞中。4.精卵识别的特异性海胆精子顶体突起与卵子微绒毛的接触 海胆的精卵识别是由特异性结合蛋白（Bindin）所介导的。Bindin定位在精子的顶体突起上，具有种属特异性。卵子卵黄膜上存在Bindin的受体，也被分离纯化出来。海胆精子顶体突起上Bindin的定位海胆卵子表面的Bindin受体哺乳动物的精卵识别哺乳动物精卵的特异性识别发生在卵细胞的透明带（zona pellucida）部分。小鼠 透明带中含有ZP3 糖蛋白
14、，它与ZP1、ZP2以网状的骨架结构存在于透明带中。ZP3能结合精子，并引发顶体反应。小鼠透明带丝状串珠样结构示意图精子细胞膜上有三种受体：精子细胞膜上有三种受体：1.sp56（56kDa，半乳糖结合蛋白）-可与ZP3分子上的半 乳糖端部相结合。如果ZP3的一个半乳糖基发生丢失或改变，精子将无法与卵子结合。2.半乳糖基转移酶(GalTase)可与ZP3分子上的N-乙酰葡糖胺结合，使精子G蛋白激活并诱导顶体反应。3.P95（ZP受体激酶）(95kDa)一种跨膜蛋白，其外侧部分可与ZP3分子特异结合，而内侧部分具有酪氨酸激酶的功能。该酶被激活后，导致顶体反应。ZP3在小鼠精子与透明带的结合中的作用
15、。二次结合 在顶体反应期间，与ZP3结合的顶体前端发生胞吐作用，精子必须与透明带结合才可以完成穿透作用，这种结合称为二次结合（secondary binding）。二次结合是通过顶体内膜上的特殊蛋白与透明带中的ZP2糖蛋白结合的。三、精子入卵的调控三、精子入卵的调控1、雌雄配子的融合 精子通过与卵黄膜或透明带的相互作用，发生顶体反应，使和精子结合的卵黄膜或透明带被顶体反应释放的水解酶溶解，并在该位置进行精卵细胞膜的融合。雌雄配子的融合大多被限定在特定的区域内。海胆精子入卵过程海胆精子入卵过程金色仓鼠精子入卵过程：A，精卵融合的扫描电镜照片 B，精子与透明带的结合 C，精子头部穿过透明带。D，精
16、子与卵子质膜的融合 E，精子顶体与带有微绒毛的卵子质膜融合的示意图2、多精受精阻断的机制与皮层反应 许多精子都可以到达卵子的表面并与之吸附，但许多精子都可以到达卵子的表面并与之吸附，但是通常只有一个精子能完成受精，称为是通常只有一个精子能完成受精，称为单精入卵单精入卵（monospermymonospermy）。）。多个精子入卵受精称为多个精子入卵受精称为多精入多精入卵卵（polyspermypolyspermy），将导致死亡活不正常的发育。），将导致死亡活不正常的发育。生命发展了多种机制防止多倍的染色体组融合，生命发展了多种机制防止多倍的染色体组融合，最普通的办法是最普通的办法是阻碍多精入卵
17、阻碍多精入卵。海胆双精受精卵（dispermic egg）第一次卵裂的中期。人类双精受精卵的第一次有丝分裂。n n海胆阻碍多精入卵的作用方式 海胆卵子细胞膜去极化引起的快速的阻碍作用；卵子皮层颗粒的胞吐作用产生的一种较慢的阻碍作用；卵子细胞质降解额外精子的核酸或排出包含有额外精子核酸的细胞质。1.快速阻碍多精入卵 卵膜中存在离子通道，卵膜的快速阻碍多精入卵作用是通过改变自身膜电位形成的。精子进入卵细胞触发细胞膜静息电位迅速去极化，引起膜外精子与卵细胞识别和融合的障碍。如人为维持原有的膜电位，可诱导多精受精现象发生；如改变正常的初始膜电位，则会阻止卵细胞的受精。海胆卵受精前后的膜电位变化B：co
18、ntrol 490 nM Na C：120 nM Na导致多精入卵的比率升高降低卵外Na浓度导致多精受精比率的升高2.皮层颗粒反应皮层颗粒反应 多精受精快速阻碍机制中膜电位的变化时间非常短暂（1 min左右），不足以永久实现阻碍多精入卵。结合到卵黄膜的精子是通过皮层的小泡破裂，发生皮层反应被移除的；否则将导致多精入卵。n n皮层由皮层颗粒组成，通常分布在没有微绒毛结构的卵膜下方。当精子进入卵子时，皮层颗粒与卵膜发生融合，颗粒内容物被释放到卵膜和卵黄膜之间的区域卵黄周隙（perivitelline space），这些释放物中有几种蛋白质在皮层颗粒反应中发挥了重要的作用。海胆皮层颗粒反应示意图未受
19、精卵（左）和受精卵（右）的皮层皮质颗粒内含物中含有的蛋白质：1）.蛋白水解酶可以使卵黄膜与质膜间的联系分离；剪除卵膜上bindin的受体及与之结合的精子。2）.粘多糖：进入卵周隙吸水膨胀，使卵黄层向外隆起，形成受精膜（fertilization envelope）举起。3）.过氧化物酶：皮层颗粒分泌的过氧化物酶通过交联相邻蛋白质的酪氨酸残基使受精膜变硬。受精膜最先在精子入卵的位置形成，并向外扩张至整个卵细胞，从而阻止多精入卵。4）.透明质素（hyalin）：在卵外形成透明质层(hyalin layer)，它与卵裂中对分裂球的支持作用有关。卵细胞质膜突起的微绒毛深入到其基部。海胆受精膜的形成及多
20、余精子的移除哺乳动物不形成受精膜，但皮质颗粒中释放的酶对透明带中的精子受体分子进行修饰，使之丧失与精子结合的能力，因此，称为透明带反应。(半乳糖基转移酶(GalTase)可与ZP3分子上的N-乙酰葡糖胺结合，使精子G蛋白激活并诱导顶体反应。卵激活时皮质颗粒释放出来的N-乙酰葡糖酶能对ZP3上的GalTase结合位点进行修饰，由此阻断透明带外围的精子与受精卵结合。）3、钙的作用 皮层颗粒反应的作用机制与顶体反应基本相似，Ca2作为细胞内信使发挥了及其重要的作用。研究证明，启动皮层颗粒反应的钙主要储存在卵细胞的内质网中，而不是卵外钙离子的内流。卵细胞内的信号分子三磷酸肌醇IP3激活Ca的释放，而I
21、P3的产生是与GTP结合蛋白或酪氨酸激酶相关的。海胆卵细胞皮层颗粒周围的内质网荧光抗体染色显示，钙离子释放通道位于皮层的内质网中。海胆卵受精时释放的钙波从精子入卵点开始跨越整个卵磷酸肌醇（inocitol phosphates）在钙离子释放过程中的作用四、卵子的激活机制 未受精的卵子是惰性的，细胞的呼吸活动、RNA的转录和蛋白质的合成处于或几乎处于零水平。只有受精的刺激才能唤醒其代谢的活跃进行。这一活化过程分为两个阶段：一、早期反应（应答）：指从精卵接触到发生皮质反应的数秒钟内所发生的事件。二、晚期反应（应答）：在受精开始后数分钟内发生的事件。Model of possible pathway
22、 of egg activation in the sea urchin.卵子激活的可能机制1卵子激活的可能机制2受精后利用卵细胞质中储存的mRNA迅速合成大量的蛋白质海胆发育的最初几个小时内，多聚核糖体的比例迅速增加五、遗传物质的融合1.雌雄原核的形成及融合单倍体的精子核进入卵细胞后，解凝聚形成雄原核（male pronucleus），卵细胞核则形成雌原核（female pronucleus）。精核形成雄性原核的过程受到卵子的严格控制。精子入卵时线粒体与鞭毛在卵细胞内降解，因此线粒体基因一般认为是母源性的；但中心体是父源性的。海胆雌雄原核的融合 海胆雄原核形成后旋转180，其中心体位于雌、雄
23、原核之间，装配成星体，连接并牵动雄原核与雌原核相互靠近，最后融合形成合子核（zygote nucleus）。海胆雌雄原核的迁移中心体发出的微管形成星光，连接并牵动雄原核与雌原核相互靠近海胆雌雄原核的融合哺乳动物雌雄原核的融合 哺乳动物精子入卵后，在卵母细胞胞质中谷胱甘肽的作用下精子染色体解凝聚。随着卵母细胞完成第二次减数分裂，雄原核增大，中心体产生星光，并向雌、性原核的方向迁移。雌雄原核彼此靠拢，在迁移过程中复制DNA。两原核相遇后，核膜解体，染色质浓缩成染色体，定位于纺锤体上。因此，在合子中观察不到真正的二倍体核，两细胞期才可看见。人类受精过程中雌雄原核的运动A:精子入卵，雄原核膨大，精子的
24、尾在卵中；B:雌雄原核并排；C:2细胞期，两个细胞中的核清晰可见。2.哺乳动物雌雄原核的不均等性 形成合子的雌雄原核所携带的单倍体基因组并不等同。一个尚未被了解的生物学进程选择性地沉默父本或母本来源的等位基因，即印记。目前已有60多个哺乳动物的印记基因得到克隆，这些基因在发育过程中起着重要的作用。粪蝇父本的基因组是沉默的，仅表达来自母本的基因。Imprinting 基因:在卵子发生或精子发生过程中被打上了不同印记的基因。由于印记不同，来源于雌核和雄核基因的表达模式也不同，即在胚胎发育过程中，有些基因仅来自于雄性的表达，而另一些基因仅来自于雌性的表达。因此只有来自于精子和卵子的二倍体才能正常发育
25、，而仅来自于雌核或雄核的二倍体胚胎则要在发育过程中夭亡。正常对照（左）和两个雌原核发育成的胚胎（右）3.细胞质成分在受精后的的重组 卵细胞受精后引起卵细胞成分的重新排比和分配称为卵细胞质重排，这种重排对于以后发育过程中细胞的分化至关重要。在卵裂过程中，胞质中含有的形态形成决定子被分配到特定的细胞中去，最终导致特定的基因被激活，从而使不同的细胞获得不同的特性。背囊动物Styela partite减数分裂中，核破裂释放出一种清亮物质，集中在动物极。受精5min后，清亮层与黄色皮质层(含脂肪)向植物极迁移。随着雄原核向赤道方向迁移，脂包涵体和清亮物质也随之迁移。清亮和黄色胞质的最终位置将分别形成间充质和中胚层。两栖类的灰色新月两栖类的灰色新月 精子入卵后，皮层向精子进入的方向旋转大约30，在动物极皮层含大量色素而内层含有少量色素的物种中，这一胞质不同层次的相对运动形成了一个在精子进入点对面的新月形的灰色区域，称为灰色新月灰色新月。4、卵裂的准备 卵裂启动的机制因物种的不同而不同，主要依赖于受精时减数分裂所处的时期。胞内Ca2浓度的增加启动了细胞分裂所需要的细胞器。第一次卵裂的位置不是随机的，而是由精子的进入点和卵质的旋转方向所决定的。植物极半球的微管沿将来背腹轴的方向平行排列