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1、核酸核酸研究进展研究进展内容简介内容简介 核酸的发现和研究核酸的发现和研究概貌概貌 核酸核酸基础基础 基因组基因组与基因组学与基因组学 核酸核酸结构结构与与结构预测结构预测核酸的发现和研究工作进展核酸的发现和研究工作进展l18681868年年 FredricFredric Miescher Miescher从脓细胞中提取从脓细胞中提取“核素核素”l19441944年年 AveryAvery等人等人肺炎球菌转化试验肺炎球菌转化试验l19521952年年HersheyHershey等噬菌体转化试验，等噬菌体转化试验，l19531953年年 WatsonWatson和和CrickCrick发现发现D
2、NADNA的双螺旋结构的双螺旋结构l1958 1958 CrickCrick提出的中心法则提出的中心法则l19681968年年 NirenbergNirenberg发现遗传密码发现遗传密码l19751975年年 TeminTemin和和BaltimoreBaltimore发发现逆转录酶现逆转录酶l19811981年年 GilbertGilbert和和SangerSanger建建立立DNA DNA 测序方法测序方法l19851985年年 MullisMullis发明发明PCR PCR 技术技术l19901990年年 美国启动人类基因组计划美国启动人类基因组计划(HGPHGP)l19941994年
3、年 中国人类基因组计划启动中国人类基因组计划启动l20012001年年 美、英等国美、英等国完成人类基因组计划基本框架完成人类基因组计划基本框架l后基因时代后基因时代核酸核酸基础基础核酸的分子结构核酸的分子结构 DNADNA的的结构结构 RNARNA的的结构结构DNADNA的的结构结构 DNADNA的的一级结构一级结构 DNADNA的的二级结构二级结构 DNADNA的的三级结构三级结构DNADNA的的一级结构一级结构概念概念：DNADNA的一级结构的一级结构是指是指DNADNA分子中脱氧核苷酸的分子中脱氧核苷酸的排列顺序。排列顺序。不同不同的的DNADNA分子（或片段）其一级结分子（或片段）其
4、一级结构不同，即脱氧核苷酸排列顺序不同，也就是碱构不同，即脱氧核苷酸排列顺序不同，也就是碱基排列顺序不同。基排列顺序不同。意义：遗传信息意义：遗传信息v基本结构单位：脱氧核糖核苷酸基本结构单位：脱氧核糖核苷酸连接键：连接键：3 3，5 5磷酸二酯键磷酸二酯键阅读方向：从阅读方向：从5 5 端到端到3 3 端端DNADNA序列分析序列分析(DNA sequencing)DNA sequencing)双脱氧链终止法双脱氧链终止法 Sanger Sanger DNA DNA的自动测序的自动测序 DNADNA化学降解法化学降解法 MaxamMaxamGilbertGilbert DNADNA序列分析序
5、列分析简单回顾简单回顾DNADNA测序方法两位科学家的发明起了决定性作用：测序方法两位科学家的发明起了决定性作用：第一位是第一位是Frederick SangerFrederick Sanger，19771977年发明的年发明的DNADNA测序方法。测序方法。第二位是第二位是Leroy HoodLeroy Hood和同事和同事MichaelMichael Hunkapiller Hunkapiller及及Lloyd Lloyd SmithSmith在在19861986年对年对SangerSanger的方法作了改进。的方法作了改进。HoodHood的发明自动测的发明自动测序仪。首先用荧光方法取代
6、了放射方法，然后采用激光和电序仪。首先用荧光方法取代了放射方法，然后采用激光和电脑来自动读取测序结果。脑来自动读取测序结果。第一台自动测序仪由第一台自动测序仪由AppliedApplied Biosystems Biosystems公司制造成功，一公司制造成功，一天能够产出天能够产出4,8004,800个个DNADNA序列碱基。今天，市场上的测序仪仍序列碱基。今天，市场上的测序仪仍然采用这种设计。然采用这种设计。今天已经趋向于采用毛细管阵列电泳（今天已经趋向于采用毛细管阵列电泳（capillaries arrays capillaries arrays electrophoresiselect
7、rophoresis）技术。技术。AppliedApplied Biosystems Biosystems的毛细阵列电的毛细阵列电泳泳DNADNA分析仪分析仪37303730 xlxl能够并行处理能够并行处理9696孔板，一天可测出大约孔板，一天可测出大约200200万碱基。万碱基。l一个长达数十年的专利申请也许会重写发明一个长达数十年的专利申请也许会重写发明DNADNA自动测自动测序仪的历史。序仪的历史。据美国科学杂志报道，位于纽约的据美国科学杂志报道，位于纽约的一家小型生物技术公司一家小型生物技术公司Enzo BiochemEnzo Biochem ，19821982年，申请年，申请DNA
8、DNA自动测序专利。今年自动测序专利。今年1111月中旬，美国专利和商标局月中旬，美国专利和商标局裁定：裁定：Enzo BiochemEnzo Biochem的这项技术含有与的这项技术含有与19981998年授予加州年授予加州理工学院前任生物学家黎若伊理工学院前任生物学家黎若伊胡德和同事的发明专利胡德和同事的发明专利相同的发明。胡德等的这项专利为加州理工学院拥有，相同的发明。胡德等的这项专利为加州理工学院拥有，该技术目前支撑着该技术目前支撑着7070亿美元的亿美元的DNADNA测序工业。测序工业。EnzoEnzo经过经过律师数十年不懈努力赢得这个专利。位于加州福斯特城律师数十年不懈努力赢得这个
9、专利。位于加州福斯特城的应用生物系统公司（的应用生物系统公司（AppliedApplied Biosystem Biosystem）是购买的是购买的胡德专利，在胡德专利，在20062006年公司测序仪的收入为年公司测序仪的收入为5.45.4亿美元，亿美元，加州理工学院因此专利而每年拥有数百万美元的版税收加州理工学院因此专利而每年拥有数百万美元的版税收入。专利和商标局的决定让加州理工学院和应用生物系入。专利和商标局的决定让加州理工学院和应用生物系统公司的财务状态处于危险之中。双方就谁是技术的第统公司的财务状态处于危险之中。双方就谁是技术的第一发明者争执不已，答案还有待实验室的记录本和日程一发明者
10、争执不已，答案还有待实验室的记录本和日程表公布之后才会出现。表公布之后才会出现。双脱氧链终止法双脱氧链终止法 双脱氧链终止法双脱氧链终止法 310型全自动DNA测序仪DNADNA的自动测序的自动测序 DNA自动测序自动测序采采用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNADNA序序列列分分析析自自动动化化的的基基础础。用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸，然然后后进进行行SangerSanger测测序序反反应应，反反应应产产物物经经电电泳泳（平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电电泳泳）分分离离后后，通通过过四四种种激激光光激激发发不不同同大大小
11、小DNADNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出四四种种不不同同波波长长荧荧光光，检检测测器器采采集集荧荧光光信信号号，并并依依此此确确定定DNADNA碱碱基基的的排排列列顺顺序。序。DNA自动测序结果举例DNADNA化学降解法化学降解法基本步骤基本步骤:(1)(1)先将先将DNADNA的末端之一进行标记的末端之一进行标记(通常为放射性通常为放射性同位素同位素3232P P；(2)(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；碱基的化学修饰；(3)(3)在修饰碱基位置化学法断开在修饰碱基位置化学法断开DNADNA链；链；(4
12、)(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNADNA链按长短分开；链按长短分开；(5)(5)根据放射自显影显示区带，直接读出根据放射自显影显示区带，直接读出DNADNA的的核苷酸序列核苷酸序列。真核生物基因组结构特点真核生物基因组结构特点1 1）真核生物细胞内有两份同源的基因组。）真核生物细胞内有两份同源的基因组。2 2）真核细胞结构基因基因转录产物为单顺反子。）真核细胞结构基因基因转录产物为单顺反子。3 3）大量重复序列：）大量重复序列：高度重复序列：高度重复序列：10106 6次，包括卫星次，包括卫星DNADNA、反向重复序列和较反向重复序列和较复杂的重复单位组成的重复序列；复杂的
13、重复单位组成的重复序列；中度重复序列可达中度重复序列可达10103 310104 4次，如次，如AluAlu家族，家族，KpnIKpnI，HinfHinf家家族，以及编码区序列如族，以及编码区序列如rRNArRNA基因、基因、tRNAtRNA基因、组蛋白基因等；基因、组蛋白基因等；单拷贝或低度重复序列整个基因组中只出现一次或很少几单拷贝或低度重复序列整个基因组中只出现一次或很少几次的核苷酸序列，主要是编码蛋白质的结构基因。次的核苷酸序列，主要是编码蛋白质的结构基因。4 4）间隔序列）间隔序列(intervening sequences)intervening sequences)，内含子内含子
14、(intronintron)。5 5）具有许多复制起点，每个复制子的长度较小。具有许多复制起点，每个复制子的长度较小。原原核生物基因组结构特点核生物基因组结构特点基因组较小基因组较小,形式多样，可能形式多样，可能是是DNADNA，也可能是也可能是RNARNA，可能是单链的，也可能是双链的，可能是闭环分子，可能是单链的，也可能是双链的，可能是闭环分子，也可能是线性分子；细菌染色体基因组则常为环状双也可能是线性分子；细菌染色体基因组则常为环状双链链DNADNA分子。分子。功能相关的结构基因常常串连在一起，并转录在同功能相关的结构基因常常串连在一起，并转录在同一个一个mRNAmRNA分子中，称为多顺
15、反子。分子中，称为多顺反子。DNADNA分子绝大部分用于编码蛋白质，间隔区通常包含分子绝大部分用于编码蛋白质，间隔区通常包含控制基因顺序。控制基因顺序。基因重叠是病毒基因组的结构特点。基因重叠是病毒基因组的结构特点。除真核细胞病毒外，基因是连续的，不含内含子序除真核细胞病毒外，基因是连续的，不含内含子序列。列。DNADNA的二级结构的二级结构 WatsonWatson和和CrickCrick双螺旋结构模型双螺旋结构模型 DNADNA结构的多态性结构的多态性 WatsonWatson和和CrickCrick双螺旋结构模型双螺旋结构模型DNADNA双螺旋结构的多态性双螺旋结构的多态性B-DNA与与
16、Z-DNA的比较的比较比较内容比较内容B-DNAZ-DNA螺旋手性螺旋手性右旋右旋左旋左旋螺旋周期的核苷酸数目螺旋周期的核苷酸数目1012螺旋直径螺旋直径20A18A碱基平面的间距碱基平面的间距3.4A3.7A螺距螺距34A45A相邻碱基对间的转角相邻碱基对间的转角36A60A轴心与碱基的关系轴心与碱基的关系穿过碱基对穿过碱基对不穿过碱基对不穿过碱基对B-DNA结构参数结构参数l性质性质 X X射线衍射分析射线衍射分析 STMSTM分析分析l螺旋的手性螺旋的手性 右旋右旋 右旋右旋l螺旋的旋转周期螺旋的旋转周期 33 33.8.8A *34.4+2A(32-A *34.4+2A(32-36A)
17、36A)l大沟大沟 l 宽度宽度 11.7 11.7A *A *间距间距:22.6:22.6A Al 深度深度 8.5 8.5A 7AA 7Al小沟小沟 l 宽度宽度 5.7 5.7A A 间距间距:12:12A Al 深度深度 7.5 7.5A 2AA 2A大沟和小沟有关值大沟和小沟有关值l的比较的比较 宽度比宽度比2.2 2.2 间距比间距比1.881.88DNADNA双螺旋结构的多双螺旋结构的多态性态性在生理盐溶液中在生理盐溶液中92%92%相对湿度相对湿度下是下是B B型双螺旋。型双螺旋。在钾离子相对湿度为在钾离子相对湿度为75%75%时，时，DNADNA分子是分子是A A构象。一般说
18、来，构象。一般说来，A AT T丰丰富的富的DNADNA片段常呈片段常呈B BDNADNA。用乙醇沉淀法纯化用乙醇沉淀法纯化DNADNA时，时，DNADNA由由B-DNAB-DNA经经C-DNAC-DNA，最终变为最终变为A-DNAA-DNA。若若DNADNA双链中一条链被相应的双链中一条链被相应的RNARNA链所替换，会变成链所替换，会变成A ADNADNA。当当DNADNA处于转录状态时，处于转录状态时，DNADNA模板链与由它转录的模板链与由它转录的RNARNA链间形成的双链间形成的双链就是链就是A ADNADNA。B BDNADNA双链都双链都被被RNARNA链所取代而得到由两条链所取
19、代而得到由两条RNARNA链组成的双螺旋结链组成的双螺旋结构也是构也是A ADNADNA。由此可见由此可见A-DNAA-DNA对基因表达有重要意义。对基因表达有重要意义。除除A-DNAA-DNA、B-DNAB-DNA螺旋外，还存在螺旋外，还存在B-DNAB-DNA、C-DNAC-DNA、D-DNAD-DNA等。等。总之，总之，DNADNA的双螺旋结构处于动态平衡中。的双螺旋结构处于动态平衡中。DNADNA结构的多态性结构的多态性很多研究证明，很多研究证明，DNADNA不仅可以是双螺旋，也可以是不仅可以是双螺旋，也可以是三螺旋，还可以是千奇百怪的折叠弯曲。三螺旋，还可以是千奇百怪的折叠弯曲。目前
20、已经发现目前已经发现DNADNA至少有至少有9 9种特殊结构，而且随着研种特殊结构，而且随着研究的深入，发现究的深入，发现DNADNA的结构还会增多。相对于现有的结构还会增多。相对于现有的经典双螺旋的经典双螺旋DNADNA结构，其他结构，其他DNADNA结构也许处于非主结构也许处于非主流地位。流地位。DNADNA结构的多样性对人类认识人和生物的多样性，结构的多样性对人类认识人和生物的多样性，以及生命现象的多样性具有关键作用，至少有助于以及生命现象的多样性具有关键作用，至少有助于人类治疗疾病、开发新药以及理解生命的本质人类治疗疾病、开发新药以及理解生命的本质。反向重复序列反向重复序列(inver
21、ted repeats)inverted repeats)回回 文文 序序 列列富含富含A/TA/T的序列的序列 在高等生物中，在高等生物中，A+TA+T与与G GC C的含量差不多相的含量差不多相等，然而在它们的染色体某一区域，等，然而在它们的染色体某一区域，ATAT含含量可能相当高。量可能相当高。在很多有重要调节功能在很多有重要调节功能的的DNADNA区段都富含区段都富含ATAT，特别是在复制起点和启动子的特别是在复制起点和启动子的TATATATA框框的序列中，其对于复制和起始十分重要。因的序列中，其对于复制和起始十分重要。因为为A AT T对只有二条氢键，此处的双链较对只有二条氢键，此处
22、的双链较G GC C对处易于解开，有利于起始复合物的形成。对处易于解开，有利于起始复合物的形成。嘌呤和嘧啶的排列顺序嘌呤和嘧啶的排列顺序 考察相邻的二核苷酸对考察相邻的二核苷酸对，发现碱基组成相同，但嘌发现碱基组成相同，但嘌呤和嘧啶的排列顺序不同，双螺旋的稳定性具有显著呤和嘧啶的排列顺序不同，双螺旋的稳定性具有显著的差异。的差异。例如例如55GC3,3CG5GC3,3CG5和和55GC3,3GC5GC3,3GC5，前前者的稳定性远大于后者。它们的氢键数目是相同的，者的稳定性远大于后者。它们的氢键数目是相同的，它们的差别在于相邻碱基之间堆积力不同。即从嘌呤它们的差别在于相邻碱基之间堆积力不同。即
23、从嘌呤到嘧啶的方向的碱基堆积作用显著地大于同样组成的到嘧啶的方向的碱基堆积作用显著地大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基堆集作用。这是因为前者的嘌嘧啶到嘌呤方向的碱基堆集作用。这是因为前者的嘌呤环和嘧啶环重迭面积大于后者的嘧啶环和嘌呤环的呤环和嘧啶环重迭面积大于后者的嘧啶环和嘌呤环的重迭面积重迭面积，这在，这在B B型型DNADNA中确是如此中确是如此。三螺旋三螺旋1.1.19571957年年DaviesDavies等首次根据试验结果提出三螺旋核等首次根据试验结果提出三螺旋核酸的概念。酸的概念。2.2.7070年代初年代初，ArrnottArrnott等根据等根据X X射线衍射结果，建立射线衍射
24、结果，建立了三螺旋核酸简单分子模型。了三螺旋核酸简单分子模型。3.3.三螺旋三螺旋DNADNA的结构单元是三碱基体，有两种基本类的结构单元是三碱基体，有两种基本类型：型：4.4.一种是嘧啶一种是嘧啶-嘌呤嘌呤-嘧啶型三碱基体嘧啶型三碱基体(PyPy-型型)；5.5.另一种则是嘌呤另一种则是嘌呤-嘌呤嘌呤-嘧啶三碱基体嘧啶三碱基体(PuPu型型)。6.6.19871987年年irkinirkin等在酸性溶液的质粒中发现等在酸性溶液的质粒中发现-型型三螺旋，三螺旋，7.7.19871987年年ervanervan等通过将第三股粘接到天等通过将第三股粘接到天然上。结果表明，三螺旋的形成可能伴然上。结
25、果表明，三螺旋的形成可能伴随于转录、复制和重组等细胞过程。随于转录、复制和重组等细胞过程。三螺旋三螺旋DNADNA不是不是DNADNA在自然态下的主要结构，而在自然态下的主要结构，而是在特定的条件下形成的。是在特定的条件下形成的。它是由一它是由一条条ODNODN通过与双链通过与双链DNADNA形成形成HoogsteenHoogsteen键键或反或反HoogsteenHoogsteen键，在其大沟处紧密缠绕而成。键，在其大沟处紧密缠绕而成。具体就是富含嘧啶的具体就是富含嘧啶的ODNODN与双链与双链DNADNA的富含嘌呤的富含嘌呤的链以平行的方式键合，形成的链以平行的方式键合，形成Hoogste
26、enHoogsteen键；键；富含嘌呤富含嘌呤的的ODNODN与双链与双链DNADNA的富含嘌呤的链以反的富含嘌呤的链以反平行的方式键合，形成反平行的方式键合，形成反HoogsteenHoogsteen键。键。lHoogsteenHoogsteen键或反键或反HoogsteenHoogsteen键的形成只是构筑三螺键的形成只是构筑三螺旋的必要条件；要想使三螺旋具备一定的生物学功旋的必要条件；要想使三螺旋具备一定的生物学功能，实现它的实际应用，还必须保证它具有一定的能，实现它的实际应用，还必须保证它具有一定的稳定性。稳定性。l影响三螺旋影响三螺旋DNADNA稳定性的因素可分为内部因素和外部稳定性
27、的因素可分为内部因素和外部因素两方面。内部因素主要是指链长、碱基序列组因素两方面。内部因素主要是指链长、碱基序列组成、骨架本性等因素。这些因素主要是通过影响第成、骨架本性等因素。这些因素主要是通过影响第三条链键合时碱基配合的强度、氢键相互作用的强三条链键合时碱基配合的强度、氢键相互作用的强度以及双链受体重排时的能量大小来影响所形成的度以及双链受体重排时的能量大小来影响所形成的三螺旋的稳定性的。碱基错配对三螺旋稳定性的影三螺旋的稳定性的。碱基错配对三螺旋稳定性的影响很大。响很大。l影响三链核酸稳定性的外界因素主要包括溶液的影响三链核酸稳定性的外界因素主要包括溶液的pHpH值、溶液中阳离子的浓度、
28、配基结合作用力的大小值、溶液中阳离子的浓度、配基结合作用力的大小等。等。“嘧啶型嘧啶型”或嘧啶或嘧啶-嘌呤嘌呤-嘧啶（嘧啶（YRYYRY）型三螺型三螺旋旋 lArnottArnott等提出的三螺旋为等提出的三螺旋为A A型型DNADNA，糖环构象是糖环构象是N N型（型（C3-C3-endoendo），），一个周期含有一个周期含有1212个核苷酸，平均碱基高度为个核苷酸，平均碱基高度为3232.6.6nmnm，有较负有较负的的X X位移（位移（-32-32nmnm）。）。lHowardHoward等根据红外光谱及偏端霉素等根据红外光谱及偏端霉素A A的嵌入实验提出的嵌入实验提出YRYYRY型构
29、象型构象上采取上采取B B型，其糖环构象是型，其糖环构象是C2-C2-endoendo（S S型），型），3 3条核苷酸链都有条核苷酸链都有相同的糖相同的糖-磷酸主链构象。在两个反平行的磷酸主链构象。在两个反平行的T T链间存在一个二重对链间存在一个二重对称轴。称轴。d(T)nd(A)nd(T)nd(T)nd(A)nd(T)n的的B B型结构比型结构比A A型在能量上更优越，型在能量上更优越，l同时同时RaghunathanRaghunathan等给出了等给出了B B型三螺旋结构模型的初始坐标。分子型三螺旋结构模型的初始坐标。分子模型和振动谱的研究表明在模型和振动谱的研究表明在d(G)nd(G
30、)nd(C)nd(G)nd(G)nd(C)n和和d(G)nd(A)nd(T)nd(G)nd(A)nd(T)n三螺旋中，三螺旋中，S S型和型和N N型糖环构象都存在，糖型糖环构象都存在，糖环的二面角在环的二面角在antianti区。区。d(C)nd(C)n链是链是S S型，型，Watson-CrickWatson-Crick中的中的d(G)nd(G)n链是链是N N型。型。l然而，三螺旋究竟然而，三螺旋究竟是是A A型还是型还是B B型或者是两者的混合体还需要进一型或者是两者的混合体还需要进一步实验去证实。步实验去证实。“嘌呤型嘌呤型”或嘌呤或嘌呤-嘌呤嘌呤-嘧啶嘧啶型（型（RRYRRY）三螺
31、旋中，三螺旋中，第三条嘌呤链以反平行于第三条嘌呤链以反平行于Watson-CrickWatson-Crick双螺旋嘌呤双螺旋嘌呤链的方向缠绕到双螺旋的大沟上，专一性地与嘌呤链的方向缠绕到双螺旋的大沟上，专一性地与嘌呤链结合。链结合。早期，在利用光谱学和超分离测量方法探索三链复早期，在利用光谱学和超分离测量方法探索三链复合物时发现了合物时发现了GGCGGC和和IICIIC两种两种RRYRRY型三螺旋。型三螺旋。后来，后来，FrescoFresco等用亲和色谱法确认等用亲和色谱法确认RRYRRY型三螺旋中型三螺旋中也包括也包括AAUIAAUI、IAUTIAUT和和IGCIGC三螺旋。三螺旋。随后，
32、又确认了随后，又确认了GGCGGC、AGCAGC和和TAT 3TAT 3种典型的种典型的RRYRRY型三螺旋，以及型三螺旋，以及CATCAT、AGCAGC和和TCGTCG等相互等相互作用较弱的三螺旋。研究发现作用较弱的三螺旋。研究发现RRYRRY型三螺旋型三螺旋（CATCAT、AGCAGC和和AATAAT等）第三条嘌呤链和等）第三条嘌呤链和Watson-CrickWatson-Crick双螺旋的嘌呤链以两个反双螺旋的嘌呤链以两个反-HoogsteenHoogsteen氢键相连接，且糖环的二面角限制在氢键相连接，且糖环的二面角限制在antianti区。区。核磁共振研究核磁共振研究RRYRRY型内
33、含一个型内含一个TCGTCG三碱基体三碱基体 分子内三分子内三链DNA分子内三链分子内三链DNADNA是由一条单链通过自身回析形成的，是由一条单链通过自身回析形成的，其结构中含有两个其结构中含有两个looploop环，为了满足形成过程中对环，为了满足形成过程中对极性以及碱基配对的要求，这条单链必须具有特殊极性以及碱基配对的要求，这条单链必须具有特殊的序列，即其序列要具有镜像重复性（的序列，即其序列要具有镜像重复性（mirror mirror repeatrepeat）.例如，对例如，对PyPuPyPyPuPy型三链，两条嘧啶链相对于中间的型三链，两条嘧啶链相对于中间的嘌呤链来说具有镜像对称的关
34、系。嘌呤链来说具有镜像对称的关系。由于分子内三链的各条链都位于同一分子内，所以由于分子内三链的各条链都位于同一分子内，所以与分子间三链相比，它更易于形成。与分子间三链相比，它更易于形成。H-DNAH-H-DNADNA又称铰链又称铰链DNADNA，19871987年由年由MirkinMirkin等在一种持粒等在一种持粒的酸性溶液中首次发现。的酸性溶液中首次发现。H-H-DNADNA可在任何以镜象重可在任何以镜象重复的寡聚核苷酸中产生（核苷酸序列具有复的寡聚核苷酸中产生（核苷酸序列具有H H回文结回文结构）。构）。H-H-DNADNA是由部分未缠绕的复合是由部分未缠绕的复合DNADNA中的一个富嘧
35、啶链，中的一个富嘧啶链，经回折同复合体中伸展的富嘌呤链间形成经回折同复合体中伸展的富嘌呤链间形成HoogsteenHoogsteen氢键而形成的分子内三螺旋，氢键而形成的分子内三螺旋，即即DNADNA的双的双链所形成的三链螺旋。由于形成过程中发生链所形成的三链螺旋。由于形成过程中发生CC+CC+的转化，故称的转化，故称H-H-DNADNA。并把这类序列称为并把这类序列称为H H回文序列回文序列。H-DNAl研究还发现在毫摩尔级的研究还发现在毫摩尔级的Mg2+Mg2+和中性和中性pHpH下，下，d(G)30d(C)30d(G)30d(C)30所形成一种由所形成一种由GGCGGC三碱基体组成三碱基
36、体组成的嘌呤分子内三螺旋结构（的嘌呤分子内三螺旋结构（H*-H*-DNADNA），），而另外而另外一些研究则发现一些研究则发现d(AG)nd(T)nd(AG)nd(T)n和和d(G)nd(C)nd(G)nd(C)n束道也能形成同时含有束道也能形成同时含有H-H-DNADNA和和H*-H*-DNADNA的纽结的纽结（nodulenodule）三锭结构。在这个三锭结构。在这个DNADNA结构中，两个结构中，两个三螺旋的顶端含有少数几个未配对的三螺旋的顶端含有少数几个未配对的DNADNA碱基，碱基，而且由于不同结构间存在大量的链节，因此，而且由于不同结构间存在大量的链节，因此，纽纽结结DNADNA的
37、形成具有较高的成核能，但延伸能较的形成具有较高的成核能，但延伸能较低（因为单链区较少）低（因为单链区较少）。R-DNAlLacks 1996Lacks 1996年曾提出了一种三碱基体，其中第三条链上年曾提出了一种三碱基体，其中第三条链上的碱基不仅与双螺旋嘌呤链上的碱基相互作用，同时也的碱基不仅与双螺旋嘌呤链上的碱基相互作用，同时也与第一条链上的嘧啶碱基相互作用。与第一条链上的嘧啶碱基相互作用。lZhurkinZhurkin等在研究活体的基因重组时又提出了这种不同等在研究活体的基因重组时又提出了这种不同于于YRYYRY和和RRYRRY型三螺旋的三链复合物。型三螺旋的三链复合物。l近年来发现在近年
38、来发现在RecARecA核蛋白纤维内接合处有三链复合体并核蛋白纤维内接合处有三链复合体并作为同源重组的中间体，这种三链复合物被称为作为同源重组的中间体，这种三链复合物被称为R-DNAR-DNA。第三条链定义为第三条链定义为R R链，和双螺旋中的一条链（链，和双螺旋中的一条链（W-W-链）相链）相同且平行。在这三螺旋中。对应三碱基体的第三条链上同且平行。在这三螺旋中。对应三碱基体的第三条链上的碱基位置靠近双螺旋的碱基位置靠近双螺旋Watson-CrickWatson-Crick碱基对的二重轴；碱基对的二重轴；从而与另外两个碱基都发生相互作用。同时从而与另外两个碱基都发生相互作用。同时R-R-链上
39、每一链上每一个碱基的电荷分布严格与个碱基的电荷分布严格与W-CW-C碱基对大沟上的碱基电荷碱基对大沟上的碱基电荷电性互补，同源序列的相互识别可能是通过互补的静电电性互补，同源序列的相互识别可能是通过互补的静电相互作用进行的，即含有相互作用进行的，即含有静电识别密码静电识别密码。三螺旋的稳定性核苷酸结构核苷酸结构:寡聚核苷酸序列的组成和长度寡聚核苷酸序列的组成和长度溶液条件溶液条件三螺旋三螺旋的检测的检测紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法:三螺旋解链和双螺旋解链的两个转变温度可作为三螺三螺旋解链和双螺旋解链的两个转变温度可作为三螺旋形成的标准旋形成的标准荧光分析法荧光分析法许多荧光染料不仅可
40、用于检测双螺旋，也可用许多荧光染料不仅可用于检测双螺旋，也可用于检测三螺旋于检测三螺旋，从双螺旋向三螺旋转变的过程从双螺旋向三螺旋转变的过程会诱导荧光强度下降，可用于检测三链的形成会诱导荧光强度下降，可用于检测三链的形成原子力显微技术原子力显微技术原子力显微镜可以直接观察吸附在云母和金表面上的原子力显微镜可以直接观察吸附在云母和金表面上的，根据的宽度和高度来判定三螺旋，根据的宽度和高度来判定三螺旋是否形成。是否形成。三链三链DNADNA的应用的应用6060年代，人们对年代，人们对DNADNA、RNARNA以及以及DNADNARNARNA的杂的杂台三螺旋结构进行了广泛的研究。台三螺旋结构进行了广
41、泛的研究。MorgenMorgen等等(1968)(1968)首先研究了首先研究了RNARNA作为第作为第3 3条链，条链，在体外大肠杆菌体系中三螺旋的形成对转录在体外大肠杆菌体系中三螺旋的形成对转录的抑制作用。的抑制作用。MoserMoser等等(1987)(1987)证明在证明在5 5 端携带端携带EDTA EDTA Fe()Fe()的寡聚核苷酸可以导致双螺旋特定位的寡聚核苷酸可以导致双螺旋特定位点的断裂，产生类似限制性酶的作用，但催点的断裂，产生类似限制性酶的作用，但催化效率远远比不上真实的体内限制性酶。化效率远远比不上真实的体内限制性酶。三螺旋三螺旋DNADNA作为生物的分子工具作为生
42、物的分子工具l通过特定位点的切割和诱导突变可以操纵基通过特定位点的切割和诱导突变可以操纵基因，有助于我们研究基因图谱和基因功能。因，有助于我们研究基因图谱和基因功能。三螺旋三螺旋DNADNA可以作为基因调节剂。当形成三螺可以作为基因调节剂。当形成三螺旋的寡聚核苷酸旋的寡聚核苷酸(简称简称TF0)TF0)结合到一个靶基因结合到一个靶基因上能够阻止上能够阻止RNARNA的转录，抑制靶基因的表达。的转录，抑制靶基因的表达。三螺旋三螺旋DNADNA战略优势在于它能够利用战略优势在于它能够利用TFOTFO直接直接结合到基因上来抑制基因表达，结合到基因上来抑制基因表达，而不必结合而不必结合到到mRNAmR
43、NA上，上，也就是说，也就是说，三螺旋三螺旋DNADNA可以直接可以直接在转录过程而不必到翻译过程起作用。在转录过程而不必到翻译过程起作用。在细胞体系的生物化学方面的研究在细胞体系的生物化学方面的研究l三螺旋三螺旋DNADNA的研究在细胞体系的生物化学方面已经取的研究在细胞体系的生物化学方面已经取得了初步进展。得了初步进展。lc mycc myc致癌基因在真核细胞生长和繁殖的调节过程致癌基因在真核细胞生长和繁殖的调节过程中起着重要的作用。中起着重要的作用。C-mycC-myc基困的过度表达与多种恶基困的过度表达与多种恶性肿瘤有关。最初在核细胞中的转录抑制研究表明，性肿瘤有关。最初在核细胞中的转
44、录抑制研究表明，TFOTFO能降低能降低c-c-mycmyc基因的转录。基因的转录。PostelPostel等等(1991)(1991)研究表研究表明，明，在细胞体系的生理在细胞体系的生理pHpH值和温度下也能产生同样值和温度下也能产生同样的效果。最近的研究还证明，的效果。最近的研究还证明，TFOTFO可以抑制人类免疫可以抑制人类免疫缺乏病毒缺乏病毒(HIvHIv)基因组的表达。基因组的表达。反义寡核苷酸类药物反义寡核苷酸类药物是应用反义寡核苷酸类药物通过是应用反义寡核苷酸类药物通过WastonWastonCrickCrick碱基碱基配对与细胞内核酸配对与细胞内核酸(DNADNA或认或认)特异
45、结合形成杂交分子，特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平抑制特定基因表达的技术。从而在转录和翻译水平抑制特定基因表达的技术。反义寡聚核苷酸反义寡聚核苷酸(ASO)ASO)技术是用单链技术是用单链RNA RNA 或或DNA DNA 来改来改变变mRNAmRNA的新陈代谢从而调节从基因到蛋白质的信息。的新陈代谢从而调节从基因到蛋白质的信息。ASOASO可结台到靶基因上而不影响其它基因，可结台到靶基因上而不影响其它基因，这一特这一特点使得点使得ASO ASO 成为了解蛋白质生物功能的一个有利工具。成为了解蛋白质生物功能的一个有利工具。反义反义RNARNA比反义比反义DNADNA长得多，长得多，而
46、且有不止一个结合位而且有不止一个结合位点，点，可能还会产生非专一性序列的作用可能还会产生非专一性序列的作用 反义反义DNADNA在在细胞液中更稳定屿，但它的作用是瞬时的。细胞液中更稳定屿，但它的作用是瞬时的。义寡核苷酸类药物的机制义寡核苷酸类药物的机制反义寡核苷酸与靶反义寡核苷酸与靶mRNAmRNA结合形成结合形成DNA-RNADNA-RNA杂合分子，杂合分子，可以激活可以激活RNaseRNase H H，该酶可以切割杂合分子中的该酶可以切割杂合分子中的RNARNA链，导致靶链，导致靶mRNAmRNA降解。降解。不能激活不能激活RNaseRNase H H活性的反义寡核苷酸可以通过空间活性的反
47、义寡核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶靶mRNAmRNA的翻译的翻译ASODNASODN的作用是在的作用是在DNADNA结合蛋白（如甲基化酶、激活结合蛋白（如甲基化酶、激活子、限制性内切酶等）的识别位点处，通过与靶基子、限制性内切酶等）的识别位点处，通过与靶基因结合形成三螺旋，并且位点专一性地干扰因结合形成三螺旋，并且位点专一性地干扰DNADNA和蛋和蛋白的结合、激活子的转录起始或转录延伸等，进而白的结合、激活子的转录起始或转录延伸等，进而阻止基因转录和复制。阻止基因转录和复制。可以通过封闭剪接位点，从而纠正错误的剪接。可以通过封闭剪接位点，从而纠正错
48、误的剪接。反义寡核苷酸技术应用反义寡核苷酸技术应用l967l967年就提出了利用与转录年就提出了利用与转录RNARNA互补的寡聚核苷酸来互补的寡聚核苷酸来调节基因表达的设想调节基因表达的设想19781978年在体外研究劳氏肉瘤病毒基因特定位点的抑制年在体外研究劳氏肉瘤病毒基因特定位点的抑制时，时，此设想才得到证实此设想才得到证实(ZamecnikZamecnik等，等，1978)1978)。在人类骨髓细胞的白血病细胞系在人类骨髓细胞的白血病细胞系HLHL一一6060中由载体产生中由载体产生的的ASOASO结合到结合到ccmycmyc先导序列的单链片断上使得先导序列的单链片断上使得ccmycmy
49、c的转录水平降低。的转录水平降低。ccmycmyc转录的降低遣成转录的降低遣成HL6OHL6O细细胞中单核白血球不同且抑制了它的繁殖速度。胞中单核白血球不同且抑制了它的繁殖速度。为人类疾病在基因水平进行治疗的战略手段。为人类疾病在基因水平进行治疗的战略手段。目前，目前，已有近已有近1010种抗肿瘤反义药物已经完成了实验研究，正种抗肿瘤反义药物已经完成了实验研究，正在进行在进行I-I-期临床实验期临床实验.ASODNASODN的作用特点是的作用特点是：l(1)(1)缩短新药的研发周期，降低新药的研发成本。缩短新药的研发周期，降低新药的研发成本。l(2)(2)具有高度的特异性。具有高度的特异性。A
50、SODNASODN是是疾病蛋白基因为疾病蛋白基因为靶点，针对疾病蛋白表达的某一特定过程进行阻靶点，针对疾病蛋白表达的某一特定过程进行阻断，因此具有高度特异性。断，因此具有高度特异性。l(3)(3)在真核细胞中具有内源性。在真核细胞中具有内源性。AS0DNAS0DN的给药系统的给药系统l脂质体载体脂质体载体l脂质乳制剂脂质乳制剂l纳米球及微球载体纳米球及微球载体l树枝状高聚物树枝状高聚物l凝胶制剂凝胶制剂ASODN改性改性l1 1）ASODNASODN的化学改性作用，通过的化学改性作用，通过ASODNASODN进行化学改进行化学改性，如在性，如在ASODNASODN的的3-3-末端连接上化学切割