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1、应用5种荧光素同时标记24条人染色体-显微镜一、形态学观察形态学观察 例子：例子：上个世纪上个世纪40年代科学家年代科学家BMcClintock 观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色观察研究玉米籽粒和叶子时发现有颜色变化。变化。这种颜色变化是由遗传结构的基这种颜色变化是由遗传结构的基本改变引起的，从而导致转座子的发现。本改变引起的，从而导致转座子的发现。肿瘤细胞与正常细胞肿瘤细胞与正常细胞 肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗肿瘤细胞中基因重排现象非常普遍，遗 传结构的改变引起表型的改变。因此从传结构的改变引起表型的改变。因此从 形态学上可以鉴定肿瘤。形态学上可以鉴定肿瘤。二、细胞遗传学二、细胞遗
2、传学染色体核型分析、染色体显带染色体核型分析、染色体显带一个物种的染色体核型及带型是稳定的一个物种的染色体核型及带型是稳定的1.1.染色体核型分析染色体核型分析：观察中期染色体，初步：观察中期染色体，初步分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、分析染色体有无较大片段的缺失、断裂、易位、及附加易位、及附加2.2.常规核型分析常规核型分析3.3.荧光核型分析荧光核型分析4.4.光谱核型分析光谱核型分析(Spectral karyotyping,SKY)SKY)光谱核型分析原理光谱核型分析原理(Spectral karyotyping,SKY)SKY)1996 年年 Schroch等首次描述了等首次描述
3、了SKYSKY技术。技术。应用应用5种荧光素同时标记种荧光素同时标记24条人染色体，制成条人染色体，制成染色体涂染探针，应用染色体涂染探针，应用Fourier光谱仪，光谱仪，CC成成像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处像和荧光显微镜进行检测分析，经计算成像处理，理，46条染色体形成具有不同颜色的核型影像条染色体形成具有不同颜色的核型影像,可用以分析各种染色体异常。可用以分析各种染色体异常。优势优势：特异性和分辨率比传统的显带技术高，它特异性和分辨率比传统的显带技术高，它 可以检测到可以检测到 1.5mb 1.5mb 碱基的转位碱基的转位 一次杂交即可分辨人的一次杂交即可分辨人的2424条染
4、色体条染色体人染色体光谱核型分析人染色体光谱核型分析乳腺癌细胞染色体复杂的畸变乳腺癌细胞染色体复杂的畸变2.2.染色体显带技术染色体显带技术：C-banding C-banding 主要染异染色质主要染异染色质 R-banding R-banding 与与C-banding C-banding 相反，主要染常相反，主要染常 染色质区域染色质区域 G-banding G-banding 是是Giemsa Giemsa 染色结果，产生深染色结果，产生深 浅不同的条带浅不同的条带 Q-banding Q-banding 是用喹丫因（是用喹丫因（quinacrinequinacrine）染染 色得到的
5、荧光条带，带型与色得到的荧光条带，带型与G G带相似带相似 G-G-带带 c.正常染色体正常染色体a.末端缺失末端缺失 d.末端倒位末端倒位b.末端单向易位末端单向易位 e.着丝粒周倒位着丝粒周倒位G G带显示人急性骨髓白血病异常染色体带显示人急性骨髓白血病异常染色体 9 9、1010、1111染色体间易位，右为异常染色体染色体间易位，右为异常染色体三、分子细胞遗传学三、分子细胞遗传学1.原位杂交（原位杂交（In situ hybridisation）标记的核酸探针变性后与已变性的靶核标记的核酸探针变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性，酸在退火温度下复性，在不改变被分析在不改变被分析对象，即
6、维持其原位的前提下对靶核酸对象，即维持其原位的前提下对靶核酸进行分析。进行分析。2.荧光原位杂交荧光原位杂交 Fluorescent in situ hybridisation(FISH)核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通过显微镜观察过显微镜观察。3.3.染色体涂染染色体涂染(Chromosome painting)(Chromosome painting)又称为多重荧光原位杂交又称为多重荧光原位杂交(multiplex-multiplex-fluorescence in situ hybridisation,M-FISH)可同时检测多个染色体，一次杂交即可检
7、可同时检测多个染色体，一次杂交即可检 测人的测人的24条染色体条染色体 可检测简单及复杂的染色体重排可检测简单及复杂的染色体重排荧光原位杂交，荧光原位杂交，据标记物不同可分为：据标记物不同可分为：间接法：用生物素或地高辛标记探针，间接法：用生物素或地高辛标记探针，通过与荧光染料结合的抗生物素或抗通过与荧光染料结合的抗生物素或抗 地高辛抗体将信号放大而进行检测。地高辛抗体将信号放大而进行检测。直接法：直接用荧光素标记，如直接法：直接用荧光素标记，如VysisVysis 公司的公司的FISHFISH探针。探针。荧光原位杂交原理示意荧光原位杂交原理示意 荧光原位杂交过程荧光原位杂交过程 急性骨髓白血
8、病急性骨髓白血病10、11号染色体间易位号染色体间易位10、11号染色体易发生号染色体易发生断裂的基因断裂的基因(MLL)位点位点小麦簇毛麦小麦簇毛麦F1 代染色体间易位代染色体间易位染色体涂染显示人染色体组染色体涂染显示人染色体组 荧光标记探针荧光标记探针 不对环境构成污染不对环境构成污染 灵敏度能得到保障灵敏度能得到保障 可进行多色观察分析，可同时使用多个可进行多色观察分析，可同时使用多个 探针，缩短因单个探针分开使用导致的探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。周期过长和技术障碍。4.4.比较基因组杂交比较基因组杂交 Comparative Genomic Hybridi
9、zation(CGH)(CGH)原理：原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂在荧光原位杂交基础上，结合消减杂 交技术而发展起来的技术，主要用于交技术而发展起来的技术，主要用于 肿瘤的检测及其基因组分析肿瘤的检测及其基因组分析是由是由Kallioniemi等在等在1992年首先提出的，是检年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的增加或减少的强有力的工具工具比较基因组杂交原理示意比较基因组杂交原理示意 肿瘤肿瘤DNADNA和对照和对照DNADNA在染色体上的相对结在染色体上的相对结合量取决于两种合量取决于两种DNADNA标本中相应杂交序列标本中相应杂交序列的多少
10、的多少 因此可根据不同荧因此可根据不同荧光強度的比率而定量光強度的比率而定量分析肿瘤基因組中分析肿瘤基因組中DNADNA的增加或丟失的增加或丟失等比混合等比混合比较基因组杂交过程比较基因组杂交过程DAPIDAPI4,6-4,6-二联脒二联脒-2-2-吲哚苯吲哚苯FITC异硫氰酸酯异硫氰酸酯TRITC硫氰酸四甲基罗丹明硫氰酸四甲基罗丹明人染色体不同荧光素染色结果人染色体不同荧光素染色结果数数字字化化图图像像FITC/TRITC FITC/TRITC 荧光强度比率分析图荧光强度比率分析图Ratio image FITC/TRITCRatio image FITC/TRITC应用：应用：主要应用在检
11、测肿瘤细胞的遗传变化主要应用在检测肿瘤细胞的遗传变化 物种间染色体同源性比较物种间染色体同源性比较优势：优势：可快捷检测中期、间期基因组可快捷检测中期、间期基因组 不需预先知道不需预先知道DNA发生改变的部位发生改变的部位 一次实验即可检出待测样本整个基因一次实验即可检出待测样本整个基因 组拷贝数的增减组拷贝数的增减1.Southern-blotting应用于基因重排检测是应用于基因重排检测是19811981年年KorsmeyerKorsmeyer等等 首先进行的。首先进行的。淋巴瘤淋巴瘤DNADNA重排重排:将细胞将细胞DNADNA抽提出来抽提出来,用限制用限制 性内切酶进行酶切，胚系性内切
12、酶进行酶切，胚系DNADNA就会产生特征就会产生特征 性片段。但发生过基因重排的细胞性片段。但发生过基因重排的细胞DNADNA的酶的酶 切位点有所改变，会产生有别于胚系的切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNADNA 酶切片段。转膜后，与标记的酶切片段。转膜后，与标记的DNADNA探针杂交，探针杂交，如如有有一一定定数数量量的的克克隆隆性性增增殖殖的的淋淋巴巴细细胞胞存存 在在 (1 1 5 5%），克克隆隆性性的的基基因因重重排排条条带带就就 可可显显示示出出来来。对对于于正正常常或或多多克克隆隆性性的的淋淋巴巴 细细胞胞增增生生，由由于于重重排排片片段段大大小小各各异异而而显显弥弥 散带。
13、散带。四、分子生物学技术四、分子生物学技术Figure5._SouthernblotanalysisoftheT-cellreceptor-chaingene.Threespecimensareshown,eachdigestedwithEcoRI,BamHI,andHindIIIrestrictionenzymes,runinagarosegels,transferredtoanylonmembrane,andhybridizedwitharadioactivelylabeledJprobe.Twospecimens,one(negativecontrol)inlanes2,5,and8,a
14、ndthesecondinlanes3,6,and9,revealonlygermlinebandsandarepolyclonal.Thethirdspecimen,inlanes4,7,and10,hasevidenceofgenerearrangementinall3lanesandismonoclonal.Lane1showsthemarkers.Lane11isa5%sensitivitycontrol 优势优势：SouthernSouthern分析已被应用于分析已被应用于IgHIgH、Igk Igk、Igl Igl及各种及各种TCR(T-TCR(T-细胞受体细胞受体)克隆性重排的检
15、测，克隆性重排的检测，并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因并以其令人满意的灵敏度和可靠性被视为基因 重排检测的重排检测的“金标准金标准”。局限：局限：需要较大量（需要较大量（10mg10mg）新鲜或冰冻组织，）新鲜或冰冻组织，操作复杂，若用放射性同位素标记，时间过长操作复杂，若用放射性同位素标记，时间过长（约两周），易污染等缺点，仅适用于科研而不（约两周），易污染等缺点，仅适用于科研而不 适用于临床诊断。适用于临床诊断。改进：改进：荧光素标记荧光素标记IgHIgH、Igk Igk、IglIgl及各种及各种TCRTCR探探 针化学发光试剂盒克服了上述缺点，以荧光素针化学发光试剂盒克服了上述缺
16、点，以荧光素 取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间(5(5 1010 分钟分钟)，并且敏感性不降低，非常有利于在临床，并且敏感性不降低，非常有利于在临床 诊断中推广、应用。诊断中推广、应用。DNADNA发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异，发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异，由此可以检测由此可以检测DNADNA重排重排 淋淋巴巴瘤瘤诊诊断断：淋淋巴巴瘤瘤是是细细胞胞克克隆隆性性增增生生的的结结果果，其其特特殊殊的的基基因因重重排排形形式式占占一一定定的的数数量量优优势势，从从而而成成为为细细胞胞克克隆隆性性的的检检测测指指标标。选选取取I Ig g
17、H H与与T TC CR R（T T细细胞胞受受体体）的的V V、D D、J J、C C区区基基因因编编码码中中2 20 0 个个左左右右的的保保守守核核苷苷酸酸序序列列，人人工工合合成成一一对对或或多多对对（家家族族基基因因）引引物物，以以待待测测样样品品D DN NA A为为模模板板，扩扩增增目目的的D DN NA A序序列列片片段段。如如果果是是淋淋巴巴瘤瘤则则扩扩增增产产物物电电泳泳出出现现单单克克隆隆性性单单带带。而而良良性性增增生生性性淋淋巴巴组组织织或或正正常常组组织织则则出出现现弥弥漫漫涂涂片片状状，2.2.常规常规PCR技术技术不形成单带。不形成单带。转基因材料外源基因的检测
18、转基因材料外源基因的检测1,1,标准分子量；标准分子量；2 2，质粒；，质粒；3 3，对照；，对照；4-84-8，转基因植株，转基因植株12345678转基因黑麦草转基因黑麦草PCRPCR检测外源检测外源UbiUbi启动子启动子(1)PCR-RFLP:PCR-RFLP:多聚酶链反应多聚酶链反应(PCR)-(PCR)-限制性片限制性片段长度多态性段长度多态性 (restriction fragment length Polymorphism，RFLP)原理原理：PCRPCR产物限制性内切酶切多态性分产物限制性内切酶切多态性分 析，析，DNADNA发生重排后，酶切位点发生改变。发生重排后，酶切位点
19、发生改变。优点优点：具有分辩率高，无需标记：具有分辩率高，无需标记,重复性好，重复性好，简便快速直观等。主要用于简便快速直观等。主要用于核酸变异性分析核酸变异性分析 与比较与比较,微生物的分群分型分亚型，癌基因微生物的分群分型分亚型，癌基因 分析，遗传病的诊断等。分析，遗传病的诊断等。局限：局限：只能应用突变引起限制性酶切位点改变只能应用突变引起限制性酶切位点改变 的情况下，一次只能完成一个特定位点突变的情况下，一次只能完成一个特定位点突变 筛选，检测效率低。筛选，检测效率低。3.3.PCR相关技术相关技术 PCR-RFLP原理示意原理示意原理：原理：是将经扩增的是将经扩增的DNADNA片段经
20、过变性处理，形成单片段经过变性处理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。的对比，即可检测出有无变异。刚建立时是将刚建立时是将同位素同位素掺入掺入PCRPCR扩增的产物中，通过放扩增的产物中，通过放射自显影显示结果。后用射自显影显示结果。后用银染银染取代同位素显示取代同位素显示DNADNA带带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏等特点。点。19931993年起用年起用EBEB染
21、色法显示染色法显示DNADNA带型，使得带型，使得SSCPSSCP操操作更简单，更经济，更迅速。作更简单，更经济，更迅速。（2 2）PCR-SSCP：聚合酶链反应：聚合酶链反应一一单链构象多态性单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism)聚合酶链反应聚合酶链反应一一单链构象多态性单链构象多态性（PCR-SSCP）示意）示意优点：优点：检测基因变异，具有操作简便、快速、检测基因变异，具有操作简便、快速、不需特殊设备，适用于大样本筛选。己广泛不需特殊设备，适用于大样本筛选。己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失应用于检测各种病原体基因的点
22、突变及缺失突变，基因的多态性分析等。突变，基因的多态性分析等。（3 3）PCR-southern blot及及Dot blot技术：技术：PCR-southern blot原理原理：是将：是将PCRPCR扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼 龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，来龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，来检测有无特定的扩增片段及相对含量。检测有无特定的扩增片段及相对含量。优点优点：可以直接检测基因的点突变，缺失及重：可以直接检测基因的点突变，缺失及重排，比排，比PCRPCR产物产物EBEB染色电泳分离法的灵敏度至少染色电泳分离法的灵敏度至少要高要高10310
23、3以上，由于非放射性同位素标记的探针以上，由于非放射性同位素标记的探针的应用，使得的应用，使得PCR-southern blot应用更简便，应用更简便，现己广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病现己广泛应用于癌基因、遗传特异基因、病 原原体特异基因等方面的研究及检测。体特异基因等方面的研究及检测。PCR-Dot blot即是将即是将PCRPCR扩增产物变性后直接点扩增产物变性后直接点在膜上，与标记的特异性探针进行杂交。在膜上，与标记的特异性探针进行杂交。优点：优点：时间短，可半定量分析，一张膜上可时间短，可半定量分析，一张膜上可 同时检测多个样品。同时检测多个样品。局限：局限：只能看到一个斑点，必
24、须小心控制反只能看到一个斑点，必须小心控制反 应条件，设立阳性及阴性对照，以便对检测应条件，设立阳性及阴性对照，以便对检测 标本做出正确鉴定标本做出正确鉴定.原理：原理：在扩增反应中加入不等量的两段寡核在扩增反应中加入不等量的两段寡核 苷酸引物，引物量相差苷酸引物，引物量相差100100倍，通过倍，通过PCRPCR扩增扩增 获得单链获得单链DNADNA，然后利用双脱氧法直接测序。，然后利用双脱氧法直接测序。应用应用：扩增产物的测序，可以很容易确定群：扩增产物的测序，可以很容易确定群 体中某一特定基因的序列变异情况，这种方体中某一特定基因的序列变异情况，这种方 法是了解目的基因突变的较理想的方法
25、。法是了解目的基因突变的较理想的方法。（4 4）不对称）不对称PCRPCR（asymmetricPCR）直接测序法直接测序法 原理：原理：即聚合酶原位扩增技术。将即聚合酶原位扩增技术。将PCRPCR技术技术 与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织与原位杂交技术结合起来，不改变周围组织 的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原的原有位置，直接在组织、细胞或病原体原 位研究基因变化的技术。位研究基因变化的技术。(5)(5)原位原位PCRPCR技术技术固定组织固定组织蛋白酶蛋白酶K消化消化PCR扩增扩增显微镜观察显微镜观察dNTP-荧光素荧光素或或dNTP-地高辛地高辛 -生物素生物素或荧光染料抗地高
26、辛抗体或荧光染料抗地高辛抗体 抗生物素抗体抗生物素抗体 优点：优点：提高了杂交的灵敏度，又能直接显微提高了杂交的灵敏度，又能直接显微 观察病变部位，且标本不需特殊处理或制备，观察病变部位，且标本不需特殊处理或制备，比较省时和经济，尤其对形态学研究具有其比较省时和经济，尤其对形态学研究具有其 它方法难以比拟的独到长处。它方法难以比拟的独到长处。应用：应用：原位原位PCRPCR自创立以来，已经在神经性自创立以来，已经在神经性 疾病、肿瘤、微生物病原体等多种检测中得疾病、肿瘤、微生物病原体等多种检测中得 到广泛应用。到广泛应用。（6）RT-PCR(reverse transcriptase-PCR)
27、原理：原理：mRNAmRNA反转录后进行反转录后进行PCRPCR扩增。实际上扩增。实际上 是检测基因表达产物的方法。是检测基因表达产物的方法。优点：优点：灵敏度高，可在灵敏度高，可在10106 6个正常细胞中检个正常细胞中检 测出测出1 1个白血病细胞。个白血病细胞。4.4.基因芯片技术检测基因突变基因芯片技术检测基因突变基因芯片（基因芯片（gene chips)gene chips)DNADNA芯片芯片(DNA chips)(DNA chips)DNADNA微阵列（微阵列（DNA microarray)DNA microarray)将数以万计的将数以万计的DNADNA探针按照一定的顺序排列固
28、化探针按照一定的顺序排列固化 于支持物表面上，产生二维于支持物表面上，产生二维DNADNA高密度的分子探高密度的分子探 针阵列，然后与标记的样品进行杂交，再利用计针阵列，然后与标记的样品进行杂交，再利用计 算机控制的信号产生、识别及图象处理系统进行算机控制的信号产生、识别及图象处理系统进行 结果分析来实现对生物样品快速、并行、高效地结果分析来实现对生物样品快速、并行、高效地 检测。检测。基因芯片技术是分子生物学、信息科学、材料基因芯片技术是分子生物学、信息科学、材料 科学、微加工技术、光学检测技术、计算机技术科学、微加工技术、光学检测技术、计算机技术 等多学科相互结合的产物。等多学科相互结合的
29、产物。DNADNA方阵的构建方阵的构建 芯片制作芯片制作 硅片、玻璃片、瓷片或聚硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物丙烯膜、尼龙膜等支持物带标记带标记样品样品DNADNA或或mRNAmRNA的准备的准备分子杂交分子杂交杂交图谱的检测和分析杂交图谱的检测和分析计算机控制的信号产生、计算机控制的信号产生、识别及图象处理系统识别及图象处理系统二维二维DNADNA高密度高密度的分子探针阵列的分子探针阵列生物样品快速、并生物样品快速、并行、高效地检测行、高效地检测通常是荧光标记通常是荧光标记PCRPCR扩增扩增基因芯片突变检测原理示意基因芯片突变检测原理示意DNA芯片芯片应用：应用：突变检测，基
30、因测序，突变检测，基因测序，DNADNA重排，多态重排，多态分析，基因表达，克隆选择，文库筛选，病分析，基因表达，克隆选择，文库筛选，病源诊断，药物筛选等源诊断，药物筛选等其他：其他：1.1.与与PCRPCR相关的技术：多重相关的技术：多重PCR(multi-PCR)PCR(multi-PCR)、巢式巢式PCRPCR（nested-PCR)nested-PCR)，长，长PCR(long-PCR),PCR(long-PCR),定量定量PCR(quantification PCR)PCR(quantification PCR)，等位基因，等位基因特异性特异性 PCR(allele specific
31、 PCR,ASPCR)PCR(allele specific PCR,ASPCR)，酶联免疫酶联免疫PCR(ELISA-PCR)等等2.2.限制酶切片段长度多态性组织配型技术限制酶切片段长度多态性组织配型技术 3.3.连接酶链反应技术连接酶链反应技术(ligase chain (ligase chain reaction LCR)reaction LCR)4.4.变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient(denaturing gradient gel electrophoresis)gel electrophoresis)5.5.抑制消减杂交抑制消减杂交(SSH)(SSH)等等此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢