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1、第六章兽药残留检测技术抗生素类第一页，本课件共有94页一、氨基糖苷类一、氨基糖苷类二、四环素类二、四环素类三、氯霉素类三、氯霉素类四、大环内酯类四、大环内酯类五、林可霉素类五、林可霉素类第二页，本课件共有94页一、氨基糖苷类抗生素一、氨基糖苷类抗生素l氨基糖苷类抗生素是由链霉菌或小单孢菌培养液中提取氨基糖苷类抗生素是由链霉菌或小单孢菌培养液中提取,或以天然品为原料半合成制取而得的一类或以天然品为原料半合成制取而得的一类水溶性较强水溶性较强的的碱性碱性抗生素。包括链霉素、双氢链霉素、新霉素、庆大霉素、抗生素。包括链霉素、双氢链霉素、新霉素、庆大霉素、卡那毒素、阿米卡星、阿布拉霉素、斑伯霉素、妥布
2、霉素、卡那毒素、阿米卡星、阿布拉霉素、斑伯霉素、妥布霉素、壮观霉素等壮观霉素等,结构式见图。结构式见图。l由于其分子结构中都有一个由于其分子结构中都有一个氨基环醇环氨基环醇环和一个或多个和一个或多个氨基氨基糖糖分子分子,由由配糖键配糖键相连接相连接,因此最好称为因此最好称为氨基糖苷氨基糖苷-氨基环醇类氨基环醇类(Aminoglycoside-Aminocyclitol)(Aminoglycoside-Aminocyclitol)抗生素抗生素,但因氨基糖但因氨基糖苷类抗生素这一名称沿用已久，故仍用此名。苷类抗生素这一名称沿用已久，故仍用此名。氨基环醇氨基糖氨基糖第三页，本课件共有94页l从抗菌作
3、用的特点看从抗菌作用的特点看,氨基糖苷类是一类较优良的抗生素氨基糖苷类是一类较优良的抗生素,然然而而,该类药物的该类药物的治疗浓度范围窄治疗浓度范围窄,不良反应较常见不良反应较常见,主要为主要为肾毒肾毒性性、耳毒性耳毒性、神经肌肉阻滞神经肌肉阻滞、造血系统毒性造血系统毒性反应和反应和过敏性过敏性反应反应,其中有些是不可逆毒性。其中有些是不可逆毒性。l氨基糖苷类氨基糖苷类肌肉注射肌肉注射或或静脉滴注静脉滴注吸收吸收,内服后不吸收或很少吸内服后不吸收或很少吸收。与收。与血浆蛋白结合很少血浆蛋白结合很少,主要分布在细胞外液。主要分布在细胞外液。l肾脏皮质肾脏皮质内药物浓度可超过血药浓度内药物浓度可超
4、过血药浓度1050倍倍,也可进入也可进入内耳内耳外淋巴液外淋巴液,其半衰期较血浆半衰期长其半衰期较血浆半衰期长56倍。倍。l氨基糖苷类药物在体内几乎不被代谢，约氨基糖苷类药物在体内几乎不被代谢，约90%以以原形原形经肾经肾小球过滤排出小球过滤排出,尿尿药浓度极高药浓度极高,约为血浆峰浓度的约为血浆峰浓度的25100倍。倍。靶组织检测物第四页，本课件共有94页例如：例如：卡那霉素卡那霉素l卡那霉素对卡那霉素对耳毒性耳毒性、肾毒性肾毒性的发生率较高的发生率较高,仅次于新霉素。仅次于新霉素。l卡那霉素肌注卡那霉素肌注,1h血药浓度达峰值血药浓度达峰值,血浆蛋白结合率很低血浆蛋白结合率很低。用药。用药
5、后后24h内有内有90%的药物经肾以的药物经肾以原形原形排泄。排泄。l卡那霉素可透过胎盘进入羊水和胎儿循环中卡那霉素可透过胎盘进入羊水和胎儿循环中,在在牛奶牛奶中可检中可检测到。测到。l牛、羊、猪肌注牛、羊、猪肌注,1日日510mg/kg,分为分为2次给予次给予,间隔间隔12h,36h后后牛奶中观测不到卡那霉素残留牛奶中观测不到卡那霉素残留,肾脏肾脏中药物滞留期长。中药物滞留期长。靶组织检测物第五页，本课件共有94页链霉素、双氢链霉素链霉素、双氢链霉素l链霉素和双氢链霉素对肾毒性反应稍轻链霉素和双氢链霉素对肾毒性反应稍轻,但可引起但可引起神经性紊神经性紊乱乱,如听力减退、耳鸣或耳部胀滞、眩晕、
6、麻木、针刺感、面如听力减退、耳鸣或耳部胀滞、眩晕、麻木、针刺感、面部灼伤感部灼伤感;偶可发生生理力减退、皮疹、乏力、呼吸困难等。偶可发生生理力减退、皮疹、乏力、呼吸困难等。l链霉素和双氢链霉素内服吸收差链霉素和双氢链霉素内服吸收差,大部分以大部分以原形原形随粪便和尿随粪便和尿液排出。液排出。l牛、羊、马肌注后牛、羊、马肌注后,血药浓度于血药浓度于1h达到峰值。一次肌注有效达到峰值。一次肌注有效浓度可维持浓度可维持12h。24h内内,30%90%的药物以原形经肾排出。的药物以原形经肾排出。l注射部位注射部位和和肾脏肾脏中链霉素残留中链霉素残留滞留期较长滞留期较长,其他可食部分残留其他可食部分残留
7、量低量低,停药期不必很长。停药期不必很长。l乳牛肌注双氢链霉素后不久乳牛肌注双氢链霉素后不久,乳汁中残留量很低乳汁中残留量很低,在在0.050.13ng/g间。乳房注入不吸收间。乳房注入不吸收,药物滞留期应予注意药物滞留期应予注意,以以免乳汁中残留超标。免乳汁中残留超标。靶组织第六页，本课件共有94页壮观霉素、新霉素壮观霉素、新霉素l壮观霉素毒副作用较小壮观霉素毒副作用较小,无明显的耳毒性无明显的耳毒性,但可引起但可引起肝、肾和肝、肾和血液系统紊乱血液系统紊乱,偶可发生过敏性反应。偶可发生过敏性反应。l壮观霉素主要以壮观霉素主要以原形原形药物由肾排泄药物由肾排泄,半衰期约为半衰期约为2.5h2
8、.5h。肝和。肝和肾中代谢物主要为双氢壮观霉素和壮观霉素。肾中代谢物主要为双氢壮观霉素和壮观霉素。肝和肾中药肝和肾中药物残留量高物残留量高,滞留期约滞留期约1515天。天。l新霉素几乎不被胃肠道吸收新霉素几乎不被胃肠道吸收,乳腺很少吸收。药物不经胃肠乳腺很少吸收。药物不经胃肠道给予道给予,体内药物生物转化很小。内服大部分以原形随体内药物生物转化很小。内服大部分以原形随粪便排出粪便排出,注射吸收迅速注射吸收迅速,很快随尿液排出。很快随尿液排出。l新霉素在动物新霉素在动物可食部分、鸡蛋、牛奶可食部分、鸡蛋、牛奶中药物滞留期长应予注意。中药物滞留期长应予注意。靶组织靶组织第七页，本课件共有94页（一
9、）样品处理（一）样品处理与蛋白质和与蛋白质和脂类等混杂脂类等混杂较强极性较强极性多羟基多羟基碱性碱性水溶性水溶性不挥发不挥发氨基糖苷类氨基糖苷类抗生素性质抗生素性质用塑料器皿盛放难以用有机溶剂提取脱脂除蛋白液液萃取在水相中或加入离子对试剂进入有机相阳离子交换吸附剂进行固液萃取第八页，本课件共有94页生物样品预处理生物样品预处理l生物样品预处理是除去混杂物以免污染色谱柱和干扰氨基生物样品预处理是除去混杂物以免污染色谱柱和干扰氨基糖苷类的分离、分析。糖苷类的分离、分析。l样品的预处理样品的预处理包括包括脱脂除蛋白脱脂除蛋白、提取提取、净化净化和样品和样品浓缩浓缩。l生物样品中氨基糖苷类药物仍具有水
10、溶性质生物样品中氨基糖苷类药物仍具有水溶性质,难以用有机溶难以用有机溶剂提取剂提取,因此首先必须用蛋白沉淀剂或固相萃取柱除去生物因此首先必须用蛋白沉淀剂或固相萃取柱除去生物组织组织(如蛋白质、脂肪等如蛋白质、脂肪等)。l含脂高的生物样品一般在提取前先除去脂类。含脂高的生物样品一般在提取前先除去脂类。l体液样品体液样品脱脂脱脂可采用离心或正己烷提取。可采用离心或正己烷提取。l固态样品固态样品(如肌肉、肾、肝如肌肉、肾、肝)处理相对复杂些处理相对复杂些,包括包括匀浆匀浆、提取提取/脱脂脱脂等步骤。等步骤。第九页，本课件共有94页除蛋白的方法：除蛋白的方法：l一是一是沉淀法沉淀法,即在样品溶液中加入
11、甲醇即在样品溶液中加入甲醇/盐酸溶液沉淀蛋白质。盐酸溶液沉淀蛋白质。l二是二是酸提取法酸提取法,即在样品中加入三氟乙酸、三氯乙酸、三氯乙酸即在样品中加入三氟乙酸、三氯乙酸、三氯乙酸/柠檬酸盐、高氯酸溶液沉淀蛋白质柠檬酸盐、高氯酸溶液沉淀蛋白质,将生物样品与酸溶液混将生物样品与酸溶液混匀或一起均质。某些情况下匀或一起均质。某些情况下,如测定肾脏中阿布拉霉素如测定肾脏中阿布拉霉素,还需用还需用浓氢氧化氨溶液对蛋白进行水解浓氢氧化氨溶液对蛋白进行水解,保证有较好的样品回收率。蛋保证有较好的样品回收率。蛋白水解包括酸解法或碱解法白水解包括酸解法或碱解法,上清液再经中和。上清液再经中和。l三是三是超滤法
12、超滤法,经超滤法处理后的样品不会引入新的盐类污染及假色经超滤法处理后的样品不会引入新的盐类污染及假色谱峰。谱峰。l四是四是固相萃取法固相萃取法,这是近年来在残留分析中应用最广的一种快这是近年来在残留分析中应用最广的一种快速、简便的除蛋白方法。速、简便的除蛋白方法。第十页，本课件共有94页1、提取、提取l用高或低的用高或低的pHpH值介质可有效提取生物样品中氨基糖苷类药物。值介质可有效提取生物样品中氨基糖苷类药物。l酸性介质酸性介质：三氯醋酸、三氟醋酸、高氯酸、三氯醋酸：三氯醋酸、三氟醋酸、高氯酸、三氯醋酸-柠檬酸或柠檬酸或甲醇甲醇-高氯酸溶液与样品一起均质、提取。高氯酸溶液与样品一起均质、提取
13、。l碱性介质碱性介质：如甲醇：如甲醇-氢氧化氨溶液提取猪肾组织中的阿布氢氧化氨溶液提取猪肾组织中的阿布拉霉素。拉霉素。l食品中氨基糖苷类药物的提取食品中氨基糖苷类药物的提取,可加入碱性缓冲液可加入碱性缓冲液,并加热脱并加热脱去蛋白去蛋白,达到提取的目的。达到提取的目的。第十一页，本课件共有94页2、净化、净化l净化方法包括液净化方法包括液-液分配、固相萃取和基质固相分散技术液分配、固相萃取和基质固相分散技术(MSD)(MSD)、在线痕量富集法等。在线痕量富集法等。l有时为了达到更好的净化效果有时为了达到更好的净化效果,通常将几种方法结合应用。通常将几种方法结合应用。l液液-液分配液分配是将干扰
14、组分从水相直接转移至有机相中。是将干扰组分从水相直接转移至有机相中。l由于氨基糖苷类的高极性由于氨基糖苷类的高极性,在在pHpH范围内不能被提取到有机相范围内不能被提取到有机相中中,仍仍留在水相留在水相中。中。l唯一例外的是阿布拉霉素唯一例外的是阿布拉霉素,在在辛烷磺酸离子对试剂辛烷磺酸离子对试剂介质中介质中,可以用可以用乙酸乙酯乙酸乙酯进行提取进行提取,提取回收率约提取回收率约90%90%。第十二页，本课件共有94页l固相萃取法固相萃取法是近年发展起来的一种更有效、迅速和方便是近年发展起来的一种更有效、迅速和方便的提取及除蛋白方法。的提取及除蛋白方法。l氨基糖苷类药物的浓缩和净化采用氨基糖苷
15、类药物的浓缩和净化采用阳离子交换吸附剂阳离子交换吸附剂较为理较为理想想,如如CM-Sephadex C-25CM-Sephadex C-25、Amberlite CG-50Amberlite CG-50、苯磺酸基、苯磺酸基、羧基阳离子交换柱等。羧基阳离子交换柱等。l正相或反相色谱吸附剂也能对样品进行提取和净化正相或反相色谱吸附剂也能对样品进行提取和净化,如如CC1818固相萃取柱固相萃取柱净化时净化时,提取液中预先加入适当提取液中预先加入适当庚烷磺酸离庚烷磺酸离子对试剂子对试剂,以提高氨基糖苷类抗生素的保留能力。以提高氨基糖苷类抗生素的保留能力。l基质固相分散技术基质固相分散技术应用相对较应用
16、相对较少少第十三页，本课件共有94页l柱切换技术柱切换技术：采用在线痕量富集技术对初提取液进行净化：采用在线痕量富集技术对初提取液进行净化,在含离子对试剂的流动相中在含离子对试剂的流动相中,预柱预柱(C(C1818柱柱)对链霉素和双氢链霉对链霉素和双氢链霉素进行富集素进行富集,干扰组分被淋洗除去干扰组分被淋洗除去,最后待测物被洗脱进入分最后待测物被洗脱进入分析柱中。析柱中。l与预富集过程相反与预富集过程相反,在酸性流动相中在酸性流动相中,阳离子交换柱对干扰组阳离子交换柱对干扰组分有吸附作用，不被保留的壮观霉素直接进入分析柱进行分有吸附作用，不被保留的壮观霉素直接进入分析柱进行分离检测。分离检测
17、。第十四页，本课件共有94页（二）分析方法（二）分析方法1、气相色谱法、气相色谱法l气相色谱已被用于测定血清中的庆大霉素、妥布霉素、萘气相色谱已被用于测定血清中的庆大霉素、妥布霉素、萘替米星和丁胺卡那霉素。替米星和丁胺卡那霉素。l样品脱蛋白和脱水后样品脱蛋白和脱水后,用三甲基硅咪唑和七氟丁酰咪唑分两步用三甲基硅咪唑和七氟丁酰咪唑分两步衍生化衍生化,然后用然后用电子捕获检测器（电子捕获检测器（ECD）检测。检测。l还有报道采用三氯乙酸提取和离子交换净化的方法测定牛肉还有报道采用三氯乙酸提取和离子交换净化的方法测定牛肉组织中的卡那霉素组织中的卡那霉素,提取液用七氟丁酰咪唑提取液用七氟丁酰咪唑衍生化
18、衍生化,随后用随后用三甲基硅烷化三甲基硅烷化,GC/ECD检测检测,回收率为回收率为74%86%,检测限为检测限为0.1mg/kg。第十五页，本课件共有94页2、液相色谱法、液相色谱法l氨基糖苷类药物可采用氨基糖苷类药物可采用阳离子交换色谱柱阳离子交换色谱柱或或非极性反相色谱非极性反相色谱柱柱分离。分离。l由于氨基糖苷类药物的极性和离子特征由于氨基糖苷类药物的极性和离子特征,它们在阳离子交换柱它们在阳离子交换柱上的分离效果较佳上的分离效果较佳,在反相色谱柱上不易分离。在反相色谱柱上不易分离。l但在反相色谱分离中但在反相色谱分离中,流动相中加入流动相中加入离子对试剂离子对试剂如磺酸钠或五如磺酸钠
19、或五氟丙酸氟丙酸,可以改善它们在可以改善它们在CC1818柱上的分配性能。柱上的分配性能。l也可在反相柱分离前也可在反相柱分离前,将氨基糖苷类药物将氨基糖苷类药物衍生化衍生化,使极性下降使极性下降,以以改善其在色谱柱上的分配性能。改善其在色谱柱上的分配性能。l使用使用CC8 8和和CC1818分离柱分离柱,流动相流动相一般由醋酸盐缓冲液和甲醇或乙一般由醋酸盐缓冲液和甲醇或乙腈组成腈组成,加入离子对试剂可以改变出峰顺序和改善峰形。加入离子对试剂可以改变出峰顺序和改善峰形。第十六页，本课件共有94页l高效凝胶渗透色谱法高效凝胶渗透色谱法亦应用于牛奶中氨基糖苷类药物的测定。亦应用于牛奶中氨基糖苷类药
20、物的测定。利用蛋白排阻柱利用蛋白排阻柱(Hisep)(Hisep)选择性地保留新霉素选择性地保留新霉素(进入凝胶孔进入凝胶孔穴中穴中),),而蛋白质分子不能进人凝胶的孔穴中而蛋白质分子不能进人凝胶的孔穴中,随流动相由固随流动相由固定相间隙通过色谱柱而不被保留定相间隙通过色谱柱而不被保留,达到分离的目的。达到分离的目的。第十七页，本课件共有94页检测器l紫外或荧光紫外或荧光衍生化衍生化l检测方法有荧光检测、电化学检测、示差折光检测和质谱检测方法有荧光检测、电化学检测、示差折光检测和质谱检测。检测。l大部分氨基糖苷类分子中含大部分氨基糖苷类分子中含-NH-NH2 2基团基团,能与邻苯二甲醛能与邻苯
21、二甲醛(OPA)(OPA)、丹酰氯、丹酰氯、1-1-氟氟-2,4-2,4-二硝基苯二硝基苯(FDND)(FDND)等反应等反应,形成稳定的荧光产形成稳定的荧光产物。物。l最常用的以最常用的以邻苯二甲醛邻苯二甲醛为衍生剂为衍生剂,采用柱前或柱后荧光衍生采用柱前或柱后荧光衍生化。柱前衍生反应可在溶液中进行化。柱前衍生反应可在溶液中进行,亦可在离子交换柱或硅胶亦可在离子交换柱或硅胶柱的净化过程中进行。柱后衍生需要柱后衍生装置。柱的净化过程中进行。柱后衍生需要柱后衍生装置。第十八页，本课件共有94页例子：荧光衍生化例子：荧光衍生化HPLC法测定牛奶中庆大法测定牛奶中庆大霉素的四种主要组分霉素的四种主要
22、组分l取取10mL10mL牛奶样品于牛奶样品于44中离心中离心,弃去上层脂肪层弃去上层脂肪层,加入加入1mL30%1mL30%三氯醋酸三氯醋酸,离心离心,上清液过上清液过CC1818固相萃取柱固相萃取柱,用用水、水水、水-甲醇甲醇(1+1)(1+1)和甲醇淋洗和甲醇淋洗,最后用最后用16%16%氢氧化铵的氢氧化铵的甲醇溶液洗脱甲醇溶液洗脱,洗脱液挥发至干洗脱液挥发至干,用水溶解残余物用水溶解残余物,取部取部分提取液加入离子对试剂戊磺酸分提取液加入离子对试剂戊磺酸,进样分析。进样分析。l色谱柱为色谱柱为Spherisorb ODS2(15cm,5m),Spherisorb ODS2(15cm,5
23、m),以水以水-甲醇甲醇(82+18)(82+18)含含0.1%0.1%醋酸、醋酸、5.6mmol/L5.6mmol/L硫酸钠和硫酸钠和11mmol/L11mmol/L戊磺酸作流动相戊磺酸作流动相,邻苯二甲醛柱后衍生邻苯二甲醛柱后衍生,荧荧光检测光检测,检测限为检测限为15g/kg15g/kg。第十九页，本课件共有94页二、四环素类二、四环素类l四环素类四环素类(Tetracyclines)抗生素是一类抗生素是一类碱性碱性广谱抗生素。包括广谱抗生素。包括从链霉菌属培养物提取的四环素、土霉素、金霉素以及多种从链霉菌属培养物提取的四环素、土霉素、金霉素以及多种半合成四环素如强力霉素、美他霉素、米诺
24、环素等。半合成四环素如强力霉素、美他霉素、米诺环素等。l四环素类早在四环素类早在20世纪的世纪的6070年代即广泛应用年代即广泛应用,在兽医上尤为在兽医上尤为滥用滥用,以致细菌对四环素类的耐药现象颇为严重以致细菌对四环素类的耐药现象颇为严重,一些常见病原菌一些常见病原菌的的耐药率很高耐药率很高。l四环素、土霉素等四环素、土霉素等盐盐类类,内服能吸收内服能吸收,但不完全但不完全,而四环素而四环素碱碱、土、土霉素霉素碱碱吸收更差吸收更差。第二十页，本课件共有94页四环素l内服吸收不完全内服吸收不完全,约为约为30%70%。血药浓度较土霉素。血药浓度较土霉素略高略高,对组织的透过率亦较高。对组织的透
25、过率亦较高。l蛋白结合蛋白结合率率65%。在。在胆汁胆汁中浓度可达血清浓度的中浓度可达血清浓度的520倍倍,可透入胎盘进入乳汁。可透入胎盘进入乳汁。l水牛、黄牛、猪一次静脉注射盐酸四环素的半衰水牛、黄牛、猪一次静脉注射盐酸四环素的半衰期分别为期分别为3.99h、5.39h、3.62h。休药期。休药期:牛牛5日日,猪猪5日日,鸡鸡2日。日。第二十一页，本课件共有94页土霉素l内服易吸收内服易吸收,但不完全。一次内服后但不完全。一次内服后,一般一般24h达血达血药峰浓度药峰浓度,牛因部分药物进入瘤胃后延缓吸收牛因部分药物进入瘤胃后延缓吸收,需需48h才达峰浓度。吸收后广泛分布于肝、肾、肺等组织和才
26、达峰浓度。吸收后广泛分布于肝、肾、肺等组织和体液中体液中,易渗入胸水、腹水、胎畜循环及乳汁中。易渗入胸水、腹水、胎畜循环及乳汁中。l主要以主要以原形原形从尿中排出。一部分在肝脏胆汁中浓缩从尿中排出。一部分在肝脏胆汁中浓缩,排排入肠内入肠内,部分再被吸收部分再被吸收,形成形成“肝肠循环肝肠循环”。肾功能减。肾功能减退时可在体内蓄积。退时可在体内蓄积。第二十二页，本课件共有94页（一）样品处理（一）样品处理l四环素类抗生素的四环母核上含有下列官能团四环素类抗生素的四环母核上含有下列官能团:二甲胺基二甲胺基-N(CH3)2、酰氨基、酰氨基(-CONH2)、酚羟基和两个含有酮基和烯醇、酚羟基和两个含有
27、酮基和烯醇基的基的共轭双键共轭双键系统。系统。l本类抗生素是本类抗生素是两性化合物两性化合物,分子中存在酚羟基和烯醇型羟基分子中存在酚羟基和烯醇型羟基,显显弱酸性弱酸性;同时含有二甲胺基同时含有二甲胺基,显显弱碱性弱碱性,故遇酸及碱故遇酸及碱,均能生成相均能生成相应的盐。应的盐。l四环素类抗生素的游离碱四环素类抗生素的游离碱,在水中的溶解度很小在水中的溶解度很小,其溶解度与溶液其溶解度与溶液的的pH值有关值有关,在在pH4.57.2之间时之间时难溶于水难溶于水,但若酸性或碱性但若酸性或碱性增强增强,则溶解度增加。则溶解度增加。l当当pH值低于值低于4或高于或高于8时时,可以得到高浓度的四环类化
28、合物的水溶可以得到高浓度的四环类化合物的水溶液。液。l其盐类在水中会水解其盐类在水中会水解,当溶液浓度较大时当溶液浓度较大时,会析出游离碱会析出游离碱,酸度酸度大时能防止水解。大时能防止水解。第二十三页，本课件共有94页l由于四环类抗生素的分子内含有由于四环类抗生素的分子内含有蒽酮类发色团蒽酮类发色团,一般为黄色结一般为黄色结晶性粉末晶性粉末,在在270360nm处有强的紫外吸收。处有强的紫外吸收。l四环类抗生素在碱性溶液中四环类抗生素在碱性溶液中,C环打开环打开,生成无活性的具有生成无活性的具有内酯类结构的异四环素。若在强碱性溶液中加热内酯类结构的异四环素。若在强碱性溶液中加热,几乎可几乎可
29、以定量转化为以定量转化为异四坏素类异四坏素类产物产物,具有具有强烈荧光强烈荧光。l液体样品液体样品(如牛奶如牛奶)一般通过离心去除部分蛋白和颗粒一般通过离心去除部分蛋白和颗粒,再用再用乙酸盐、磷酸盐、乙酸盐、磷酸盐、Mcvaine或或Mcvaine/EDTA缓冲液稀释。缓冲液稀释。l组织样品组织样品(肌肉、肾脏、肝脏肌肉、肾脏、肝脏)提取前提取前,样品需要剁碎或均质。样品需要剁碎或均质。第二十四页，本课件共有94页1、提取、提取l从生物样品中分离四环素类比较复杂从生物样品中分离四环素类比较复杂,因为这类药物易与金属离因为这类药物易与金属离子形成子形成螯合物螯合物,以及与组织中的以及与组织中的蛋
30、白强烈结合蛋白强烈结合,因此须用因此须用强酸或强酸或酸性脱蛋白剂酸性脱蛋白剂进行提取。进行提取。l然而然而,在酸性条件下在酸性条件下(pH2.0),四环素类药物降解为脱水物四环素类药物降解为脱水物,加加热时又可转变为差向异构体。因此热时又可转变为差向异构体。因此,提取时最好用含有提取时最好用含有EDTA、琥珀酸盐、草酸等螯合剂的弱酸性溶剂。琥珀酸盐、草酸等螯合剂的弱酸性溶剂。l常用的弱酸性溶剂有常用的弱酸性溶剂有EDTA-Mcvaine缓冲液缓冲液(pH4.0)、琥、琥珀酸盐缓冲液珀酸盐缓冲液(pH4.0)、酸化乙腈、酸化甲醇。、酸化乙腈、酸化甲醇。l另外另外,三氯乙酸三氯乙酸(pH2.0)、
31、柠檬酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)、柠檬酸、柠檬酸盐缓冲液盐缓冲液/乙酸乙酯乙酸乙酯(pH45)和盐酸和盐酸/甘氨酸缓冲液亦用于样品甘氨酸缓冲液亦用于样品的提取和沉淀蛋白质。的提取和沉淀蛋白质。l其他提取方法包括用其他提取方法包括用含苯丁唑酮离子对试剂的二氯甲烷含苯丁唑酮离子对试剂的二氯甲烷提取蛋中提取蛋中四环素类药物四环素类药物,超滤法超滤法提取牛奶、猪组织中四环素类药物。提取牛奶、猪组织中四环素类药物。酸提取法+金属螯合剂第二十五页，本课件共有94页2、净化、净化l初提取液中含大量的内源性干扰杂质初提取液中含大量的内源性干扰杂质,还需要净化处理还需要净化处理,包括液包括液-液萃取
32、、固相萃取液萃取、固相萃取(SPE)(SPE)、基质固相分散、超滤、免疫亲和色、基质固相分散、超滤、免疫亲和色谱和在线痕量富集等方法。为达到更好的净化效果谱和在线痕量富集等方法。为达到更好的净化效果,可将几种可将几种方法结合使用。方法结合使用。（1 1）液）液-液萃取：液萃取：l四环素类药物四环素类药物不溶于不溶于二氯甲烷等二氯甲烷等疏水性有机溶剂疏水性有机溶剂,因此液因此液-液萃取利用疏水性有机溶剂将水相中的一些脂溶性杂质液萃取利用疏水性有机溶剂将水相中的一些脂溶性杂质洗去。洗去。l但有但有四丁基铵离子对试剂四丁基铵离子对试剂存在时存在时,二氯甲烷可直接提取水相中二氯甲烷可直接提取水相中(p
33、H8.2)(pH8.2)的土霉素和四环素的土霉素和四环素,其萃取率达其萃取率达85%85%以上。以上。第二十六页，本课件共有94页（2）固相萃取固相萃取(SPE)(SPE)l由于四环素类不易从水相进入有机相由于四环素类不易从水相进入有机相,可采用固相萃取柱净化。可采用固相萃取柱净化。l常用的常用的SPESPE柱柱固定相为固定相为CC1818、多聚类和环己基填料。采用硅胶基、多聚类和环己基填料。采用硅胶基质的质的SPESPE柱时柱时,四环素类易与固定相的硅醇基发生吸附四环素类易与固定相的硅醇基发生吸附,可通过加可通过加入入EDTAEDTA等硅醇基阻断剂来解决等硅醇基阻断剂来解决,并在淋洗液中加入
34、草酸。并在淋洗液中加入草酸。l将反相柱与阳离子交换柱串联使用将反相柱与阳离子交换柱串联使用,或使用混合填料的或使用混合填料的SPESPE柱柱,如如CC1818与与CM-Sephadex C-25CM-Sephadex C-25、苯磺酸型、羧酸型、苯磺酸型、羧酸型阳离子交阳离子交换树脂换树脂混合混合,可以提高净化效率。可以提高净化效率。l基质固相分散法基质固相分散法采用采用CC1818吸附剂吸附剂,已用于牛奶中的四环素类的提已用于牛奶中的四环素类的提取和净化取和净化,加入等量的加入等量的EDTAEDTA和草酸和草酸,可缩短提取时间。可缩短提取时间。第二十七页，本课件共有94页l超滤超滤和和免疫亲
35、和色谱法免疫亲和色谱法亦被用于牛奶样品的提取和净亦被用于牛奶样品的提取和净化。化。l柱切换技术柱切换技术：有人采用：有人采用金属螯合亲和柱金属螯合亲和柱作为富集柱作为富集柱(Anagel-TSK Chelate-5PW),(Anagel-TSK Chelate-5PW),通过柱切换通过柱切换,在线浓在线浓缩净化动物组织和蛋中四环素类药物。缩净化动物组织和蛋中四环素类药物。第二十八页，本课件共有94页（二）分析方法（二）分析方法l生物样品中四环素药物的含量测定方法生物样品中四环素药物的含量测定方法,除有微生物除有微生物测定外测定外,主要还有主要还有荧光分光光度法荧光分光光度法、薄层色谱法薄层色谱
36、法、高效液相色谱法高效液相色谱法和和毛细管电泳法毛细管电泳法等。等。第二十九页，本课件共有94页1、荧光分光光度法、荧光分光光度法l四环素类抗生素本身在四环素类抗生素本身在0.1mo1/L盐酸液中有微弱荧光盐酸液中有微弱荧光,若将它们转变为脱水物若将它们转变为脱水物,能使荧光强度增强。能使荧光强度增强。l若在一定若在一定pH条件下条件下,使脱水物与铝盐络合使脱水物与铝盐络合,形成的络合形成的络合物具强烈荧光物具强烈荧光,可用于含量测定。可用于含量测定。l由于本法灵敏度高由于本法灵敏度高(0.1mg/L),线性范围在线性范围在05mg/L间间,适适用于血浆中四环素类抗生素的测定。用于血浆中四环素
37、类抗生素的测定。第三十页，本课件共有94页血浆中四环素的测定血浆中四环素的测定l取血浆取血浆2.0mL,2.0mL,加加1.5mol/L1.5mol/L三氯醋酸液三氯醋酸液0.6mL,0.6mL,振摇振摇,离心离心(3500r/min)5min,(3500r/min)5min,取上层液取上层液1.6mL,1.6mL,加加0.lmol/L0.lmol/L盐酸液盐酸液0.5mL,0.5mL,某中含有某中含有-硫代丙酸硫代丙酸 1.0g/L;1.0g/L;溶液于溶液于100100加热加热10min10min后后,立即将试管浸入冷水中冷却立即将试管浸入冷水中冷却,加加pH6.0pH6.0枸橼酸缓冲液枸
38、橼酸缓冲液(1L(1L溶液溶液中含枸橼酸中含枸橼酸125g125g和和10mol/L10mol/L氢氧化钠液氢氧化钠液160mL)1.0mL,160mL)1.0mL,然后然后加加0.75mol/L0.75mol/L三氯化铝液三氯化铝液0.5mL,0.5mL,振摇并在室温放置振摇并在室温放置15min,15min,于于485nm485nm处激发处激发,555nm,555nm处检测荧光强度。处检测荧光强度。第三十一页，本课件共有94页l四环素在四环素在pH5pH5的条件下的条件下,与与AlAl3+3+以以1:11:1的定量关系形成具有强烈的定量关系形成具有强烈荧光的络合物荧光的络合物,该络合物至少
39、能稳定该络合物至少能稳定1h;1h;试剂中加试剂中加-TPA,-TPA,能增能增强四环素对光的稳定性强四环素对光的稳定性,-TPA-TPA为抗氧剂。该法适用于血浆中为抗氧剂。该法适用于血浆中其他四环类抗生素的测定。其他四环类抗生素的测定。lGalaGala等报道了荧光分光光度法筛选测定牛奶中四环素药物。等报道了荧光分光光度法筛选测定牛奶中四环素药物。PoigerPoiger等测定了组织中三种四环素类药物。等测定了组织中三种四环素类药物。SalinasSalinas等报道了一等报道了一种种4 4步荧光衍生化步荧光衍生化,荧光分光光度法测定蜂蜜中土霉素残留量。荧光分光光度法测定蜂蜜中土霉素残留量。
40、第三十二页，本课件共有94页2、薄层色谱法、薄层色谱法l薄层色谱法设备简单薄层色谱法设备简单,操作方便操作方便,可作为四环素类的筛选方可作为四环素类的筛选方法。法。l薄层板一般采用硅胶板或薄层板一般采用硅胶板或CC8 8板。硅胶板遍常以板。硅胶板遍常以ETDA-ETDA-2Na(pH7.0)-2Na(pH7.0)-乙酸乙酯乙酸乙酯-氯仿氯仿-丙酮溶液作展开剂丙酮溶液作展开剂,C,C8 8板用含板用含0.5mol/L0.5mol/L草酸的流动相展开草酸的流动相展开;展开后展开后,取出薄层板取出薄层板,晾干晾干,检测检测方法包括方法包括生物自显影法生物自显影法(枯草杆菌枯草杆菌)和和分光光度法分光
41、光度法。l荧光分光光度荧光分光光度检测采用检测采用氯化镁氯化镁和和三乙胺三乙胺显色显色,紫外分光光度紫外分光光度检检测采用测采用快蓝快蓝BBBB和和吡啶吡啶显色。显色。第三十三页，本课件共有94页3、毛细管电泳法、毛细管电泳法lChen等报道了毛细管电泳法测定牛奶中等报道了毛细管电泳法测定牛奶中4种甲环素类药种甲环素类药物。物。l样品用样品用金属螯合柱金属螯合柱提取提取,洗脱液过洗脱液过C18固相萃取柱固相萃取柱,乙醇乙醇洗脱洗脱,开管石英毛细管柱开管石英毛细管柱(57cm 75m)分离分离,电泳电压电泳电压23kV,温度温度23,电泳液含电泳液含10mmol/L十二烷基磺酸钠、十二烷基磺酸钠
42、、50mmol/L硼酸盐和硼酸盐和50mmol/L磷酸盐磷酸盐,pH8.5,紫外检测紫外检测波长波长370nm,四环素类的检测限四环素类的检测限1.35.6ng/mL,定量检测定量检测限限1.78.7ng/mL。第三十四页，本课件共有94页4、高效液相色谱法、高效液相色谱法lHPLCHPLC法是四环素类药物残留分析法是四环素类药物残留分析最常用最常用的方法的方法,l但采用但采用硅胶硅胶基质的色谱柱时基质的色谱柱时,常遇见两个问题常遇见两个问题:l一是四环素类可与色谱系统中的金属离子形成螯合物一是四环素类可与色谱系统中的金属离子形成螯合物,色谱行为差色谱行为差;l二是四环素类与固定相发生吸附二是
43、四环素类与固定相发生吸附,造成峰形不对称造成峰形不对称,灵敏度下降。灵敏度下降。l前者可通过加入前者可通过加入EDTAEDTA解决解决,后者可通过对柱填料进行后者可通过对柱填料进行硅烷化硅烷化或加入或加入季铵盐季铵盐等硅醇基的阻断剂来解决。等硅醇基的阻断剂来解决。l亦可采用含金霉素的流动相预先淋洗过夜亦可采用含金霉素的流动相预先淋洗过夜,金霉素作为硅醇金霉素作为硅醇基的阻断剂基的阻断剂,以消除土霉素和四环素的峰形拖尾现象。以消除土霉素和四环素的峰形拖尾现象。第三十五页，本课件共有94页l土霉素、四环素和强力霉素在酸性水溶液中土霉素、四环素和强力霉素在酸性水溶液中,268nm、270nm和和26
44、9nm处有最大吸收处有最大吸收,在在350370nm处亦有强的紫外吸收处亦有强的紫外吸收,检测灵检测灵敏度可达敏度可达g/kg水平。水平。l由于四环素类分子中含有两个由于四环素类分子中含有两个共轭双键共轭双键,因此在紫外光照下能产因此在紫外光照下能产生荧光生荧光,它们的降解产物也具有荧光性质它们的降解产物也具有荧光性质,可供测定。可供测定。l但四环素类的荧光检测更多的采用但四环素类的荧光检测更多的采用柱后荧光衍生化柱后荧光衍生化测定。例测定。例如如,以二氯化氧锆作荧光衍生剂以二氯化氧锆作荧光衍生剂,柱后荧光检测组织中的四环柱后荧光检测组织中的四环素类药物残留素类药物残留,灵敏度可达灵敏度可达p
45、g水平水平,具有高的灵敏度和选择性。具有高的灵敏度和选择性。l电化学检测具有高的灵敏度电化学检测具有高的灵敏度,但应用相对较少。质谱检测可但应用相对较少。质谱检测可提供化合物的结构信息提供化合物的结构信息,在残留分析中作为确证分析方法。在残留分析中作为确证分析方法。第三十六页，本课件共有94页HPLC法测定牛奶中土霉素和四环素法测定牛奶中土霉素和四环素l取取5mL牛奶样品牛奶样品,用用0.6mol/L硫酸调节至硫酸调节至pH2.7,用用10mL乙腈提乙腈提取取,吹干吹干,用用2mL磷酸盐缓冲液溶解磷酸盐缓冲液溶解,加入四丁基铵离子对试剂加入四丁基铵离子对试剂,二氯甲烷提取二氯甲烷提取,再用再用
46、0.1mol/L高氯酸抽提。高氯酸抽提。C18柱柱(25cm5m)分离分离,使用前用含金霉素的流动相淋洗过夜使用前用含金霉素的流动相淋洗过夜,以以0.02mol/L磷酸磷酸-乙腈乙腈(76+24)作流动相作流动相,流速流速1.2mL/min,柱温柱温35,紫外检测波长紫外检测波长355nm。在上述条件下。在上述条件下,样品色谱图见样品色谱图见图图,可检测到牛奶样品中土霉素和四环素浓度可检测到牛奶样品中土霉素和四环素浓度10ng/mL。第三十七页，本课件共有94页HPLC法测定牛和猪的组织与血清中的四环素法测定牛和猪的组织与血清中的四环素l取取25g25g组织样组织样,加加3 3倍体积的倍体积的
47、1mol/L1mol/L盐酸盐酸,血清中加入血清中加入1 1倍体积倍体积的的1mol/L1mol/L盐酸盐酸,匀浆匀浆,取匀浆取匀浆8mL8mL加人乙腈加人乙腈32mL32mL涡旋混合涡旋混合,静静置后滤过置后滤过,收集滤液收集滤液20mL,20mL,加人二氯甲烷加人二氯甲烷20mL20mL和石油醚和石油醚20mL,20mL,用力振荡用力振荡,取水层取水层200L200L进样。色谱柱为进样。色谱柱为PRR1PRR1柱柱(25cm 4.1mm,10m),(25cm 4.1mm,10m),流动相为流动相为0.01mol/L0.01mol/L磷酸磷酸-甲醇甲醇(80+20)(80+20)和和0 0。
48、01mol/L01mol/L磷酸磷酸-乙腈乙腈-甲醇甲醇(30+50+zO),(30+50+zO),梯度淋洗梯度淋洗,流速流速1mL/min1mL/min。紫外检测波长。紫外检测波长355nm355nm。在上述条件下。在上述条件下,方法方法回收率回收率:肌肉肌肉,92.7%;,92.7%;血清血清,99.5%,99.5%。检测限。检测限:土霉素、四环素土霉素、四环素,10ng;,10ng;金霉素金霉素,20ng,20ng。第三十八页，本课件共有94页柱切换技术柱切换技术l采用柱切换技术采用柱切换技术,金属螯合亲和柱在线浓缩金属螯合亲和柱在线浓缩/净化动物组织和净化动物组织和蛋中四环素类药物蛋中
49、四环素类药物,分离测定土霉素、四环素、地美环素和金分离测定土霉素、四环素、地美环素和金霉素残留量。霉素残留量。l取取2g蛋样或组织样蛋样或组织样,用用pH5的柠檬酸盐缓冲液的柠檬酸盐缓冲液(鸡肝鸡肝,pH4)和乙和乙酸乙酯均质酸乙酯均质,离心离心,上清液挥发至干上清液挥发至干,用甲醇溶解用甲醇溶解,注入注入Anagel-TSK Chelate-5PW金属螯合亲和柱金属螯合亲和柱,通过柱切换通过柱切换,将富集的分析物将富集的分析物洗脱至分析柱洗脱至分析柱(PLRRS,15cm5m)中进行分离中进行分离,流动相为流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾磷酸二氢钾-0.01mol/L柠檬酸柠檬酸-0.01
50、mol/L EDTA和乙和乙腈腈-甲醇甲醇-1mol/L柠檬酸盐缓冲液柠檬酸盐缓冲液(pH4)(25+10+65),梯度淋洗梯度淋洗:10min内从内从(100+0)到到(0+100),350nm紫外检测紫外检测,组织和蛋中检测组织和蛋中检测限限:土霉素土霉素3g/kg、四环素、四环素5g/kg、地美环素、地美环素5g/kg、金霉、金霉素素6g/kg。第三十九页，本课件共有94页l采用金属螯合亲和柱净化采用金属螯合亲和柱净化,LC分离测定牛奶中四环素类药物分离测定牛奶中四环素类药物残留量。残留量。l取取5.0mL牛奶样品于牛奶样品于10 离心离心15min,分离乳油分离乳油,加入加入0.1mo