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1、第20高效液相色谱法第1页，本讲稿共45页一、一、HPLC与经典与经典LC区别区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n）分析周期长 无法在线检测，灵敏度差2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径17%，硅胶失活载体，吸附的水固定液，分配色谱4出柱顺序：硅胶极性较大，强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱第19页，本讲稿共45页二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLC）1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易
2、流失，不实用 3正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分4.反相色谱固定液极性 流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分第20页，本讲稿共45页三、化学键合相色谱法（三、化学键合相色谱法（BPC）（一）化学键合相（二）反相键合相色谱（二）反相键合相色谱 （reversed bonded phase chromatography,RBPC）（三）正相键合相色谱（normal bonded phase chromatography,NBPC）（四）离子对色谱（五）离子抑制色谱（了解）第21页，本讲稿共
3、45页（一）化学键合相（一）化学键合相定义：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面，而构成化学键合相1分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）2优点：1）使用过程不流失 2）化学性能稳定，在pH28的溶液中不变质 3）热稳定性好（固定相极性 底剂（水）+与水混溶的极性调节剂 常用甲醇水、乙腈水等3 3、分离机理：、分离机理：疏溶剂理论为代表(了解)溶质的保留机理是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。不是溶质分子与键合相间的色散力第23页，本讲稿共45页续前4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR5出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组
4、分后出柱6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）第24页，本讲稿共45页（三）正相键合相色谱法（了解）（三）正相键合相色谱法（了解）1、固定相：极性键合相如氰基（CN）、氨基（NH2）键合硅胶。2、流动相：类似与以硅胶为固定相的吸附色谱法 非极性或弱极性溶剂加极性调整剂3、分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱6适用：极性组分第25页，本讲稿共45页续前NHPLCRHPLC固定相极性大小（ODS；C18)流动相极性小大甲醇-水；乙腈-水组分流
5、出顺序极性小先出峰极性大先出峰流动相极性k；tRk；tR分离对象极性组分非极性或中等极性组分正相和反相色谱法的区别第26页，本讲稿共45页（四）反相离子抑制色谱（四）反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质或pH一定的缓冲溶液2）k的影响因素：选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k 调节pH范围：3.08.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子3）适用：弱酸、弱碱物质 pH=37弱酸；pH=78弱碱；两
6、性化合物第27页，本讲稿共45页（五）反相离子对色谱法（五）反相离子对色谱法（IPC或或PIC）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离 模型1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱 四丁基季胺盐分析酸2）影响k的因素离子对试剂的种类：碳链长度增加，溶质的k增大；流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大固定相、流动相性质（同一般RP-HPLC）。3）适用：较强的有机酸、碱第28页，本讲稿共45页反相离子对色谱法模型反相离子对色谱法模型33+()+3s3(+固定相：弱极性固定相：弱极性+()+B)+B+
7、H+BHRSO NaRSO +Na+BH RSORSO)BH离子对mB+AB AmA(s流动相：极性流动相：极性通式通式第29页，本讲稿共45页第四节 固定相 固定相（stationary phase）是HPLC的关键组成部分，它直接关系到柱效与分离度。1、液固色谱固定相 液-固吸附色谱固定相,多是具有吸附活性的吸附剂。常用有硅胶、氧化铝及高分子多孔微球等。2、化学键合相（1）优点（P526；5条，注意pH使用范围28）（2）分类非极性键合相：十八烷基键合相（ODS或C18）是最常用 的非极性键合相。中等极性键合相极性键合相12/3/2022第30页，本讲稿共45页 第五节 流动相（溶剂系统）
8、对流动相的要求：与固定相不发生化学反应。对试样有适宜的溶解度。使k在110范围内（可用范围）或25（最佳范围），k小，tR小；k大，tR大，峰宽变大；与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈等可以降低柱压，提高柱效。12/3/2022第31页，本讲稿共45页（一）流动相对分离的影响（分离方程式）（一）流动相对分离的影响（分离方程式）k 受溶剂配比的影响 n由色谱柱（固定相）性能决定主要受溶剂种类的影响12/3/2022第32页，本讲稿共45页（二）流动相的极性和选择性（二）流动相的极性和选择性流动相的极性（强度）正相色谱：溶剂极
9、性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 例：固定相：ODS；流动相：甲醇-水（50：50）；tR=20min；若要缩短分析时间，如何调节流动相？流动相的选择性不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 混合溶剂（二元或多元流动相）溶剂水甲醇乙腈强度因子03.03.5第33页，本讲稿共45页续前（三）洗脱方式（三）洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）类似GC的等温度洗脱；以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）具有方法简便、重复性好、色谱柱易再生等优点。对于成分复杂的样品，往往不能兼顾某些性质相差很大组分的分离要求2）梯度洗脱：类似GC的程序升温 在一定分析周期内不断变换
10、流动相的种类和比例，即不断改变其极性（两个泵）。适于分析极性差别较大的复杂组分 缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度有时引起基线漂移、重复性较差第34页，本讲稿共45页峰的鉴别：峰的鉴别：1苯；苯；2氯苯；氯苯；3对二氯苯对二氯苯 41，2，3三氯苯；三氯苯；51，3，5三氯苯；三氯苯；61，2，4三氯苯；三氯苯；71，2，3，4四氯苯；四氯苯；81，2，4，5四氯苯；四氯苯；9五氯苯；五氯苯；10.六氯苯六氯苯 （a）梯度洗脱梯度洗脱两种洗脱方式的比较两种洗脱方式的比较（b）等度洗脱等度洗脱12/3/2022第35页，本讲稿共45页（四）溶剂系统选择的一般原则（四）溶剂系统选
11、择的一般原则（四）溶剂系统选择的一般原则（四）溶剂系统选择的一般原则RBPC流动相极性越强，洗脱能力越弱，溶质的k越大（1）溶剂种类：水+甲醇、水+乙腈（2）溶剂比例：水的比例增加，使k增大（3）溶剂pH：影响弱酸、弱减的离解 流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂（色谱纯）作流动相，防止微量 杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在 柱中沉积。（4）流动相的）流动相的pH介于介于28第36页，本讲稿共45页一、输液系统
12、一、输液系统高压输液泵恒压泵：流量精度不稳恒流泵（常用）：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式第七节第七节第七节第七节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪输液泵应具备的性能：流量精度高且稳定流量范围宽能在高压下连续工作液缸容积小密封性能好，耐腐蚀 第37页，本讲稿共45页12/3/2022第38页，本讲稿共45页二、色谱柱和进样系统二、色谱柱和进样系统 进样器注射器 进样阀（六通阀，不停泵进样）、自动进样装置色谱柱（column）由柱管（不锈钢管）和固定相组成分析柱（直径46mm如4.6mm，柱长1030cm）、制备柱柱效评
13、价：色谱系统适应性试验 R1.5，n（符合规定），fs（0.951.05）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗（了解）load inject第39页，本讲稿共45页三、检测器三、检测器 1、紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 检测原理：朗伯比尔(Lambert-Beer)定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=Cl特点：灵敏度较高（10-610-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。专属型、浓度型检测器第40页，本讲稿共45页续前紫外检测器类型：1）固定波长检测器：254nm2）可变波长
14、检测器：光源：氘灯（和钨灯），200400（800）nm，单色器，流通池（试样），光电管光路系统和紫外分光光度计相似 3）光电二极管阵列检测器(DAD)：在获得色谱图的同时，还可以获得个组分的光谱图。即获得三维光谱色谱图。用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量,判断峰纯度第41页，本讲稿共45页续前 2、荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高 3、示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格 4、电化学检测器 5、化学发光第42页，本讲稿共45页第八节第八节 定性、定量分析方法（同定性、定量分析方法（同GC法）法）一、定性分析方法一、定性分析方法 1.色谱鉴定法保留
15、时间 2.化学鉴定法 3.色谱-光谱联用鉴定法 （1）非在线色谱光谱联用法 （2）色谱-光谱联用仪12/3/2022第43页，本讲稿共45页二、二、定量分析方法同GC（自己看）1.外标法：应用较为广泛 2.内标法：内标法分为工作曲线法、内标对比法等。内标对比法：不需知校正因子，又具有内标法的定量准确度 与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分析结果（含量）常用标示量表示：12/3/2022第44页，本讲稿共45页主要内容化学键合相色谱法的固定相、流动相化学键合相色谱法的固定相、流动相化学键合相色谱法的分离条件化学键合相色谱法的分离条件高效液相色谱中的速率理论高效液相色谱中的速率理论高效液相色谱仪的结构高效液相色谱仪的结构定量分析方法定量分析方法紫外检测器紫外检测器第45页，本讲稿共45页