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1、第五讲基因定点诱变技术第五讲基因定点诱变技术第一页，本课件共有24页n nM.Smith（加拿大生物化学家）1993年诺贝尔化学奖，1978年发明了寡核苷酸定点诱变技术。利用寡核苷酸定点诱变技术，可以认为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质之间的相互作用。寡核苷酸定点诱变技术寡核苷酸定点诱变技术第二页，本课件共有24页基因诱变的应用n n1 结构和功能n n2 基因的注释n n3 代谢途径-分子育种n n4 蛋白质的修饰n n5 分子设计-分子进化工程第三页，本课件共有24页缺失诱变缺失诱变n n1 简单缺失 通过对DNA片段中具有的相
2、应的酶切位点进行切割，而后用T4连接酶进行连接。n n2 系统缺失 核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大片段第四页，本课件共有24页插入突变插入突变n n1 人工合成片段n n2 Transposon insertion（Tn5）n n3 同源重组n n4 PCR第五页，本课件共有24页 基因的体外诱变第六页，本课件共有24页Kunkel法法 或称或称”U”法法 dut-：dUTPdUTP酶（酶（dUTPasedUTPase）缺陷，细胞不能）缺陷，细胞不能把把dUTPdUTP转化为转化为dUMP,dUMP,因此细胞内因此细胞内dUTPdUTP的含量大的含量大为增加，其中一些为增加，其中
3、一些dUTPdUTP可掺入可掺入DNADNA中正常情况中正常情况下有下有“T”“T”占据的位置。占据的位置。ung ung-：UDGUDG酶缺陷，酶缺陷，UDGUDG酶（尿嘧啶酶（尿嘧啶-N-N-糖基糖基化酶）可除去化酶）可除去DNADNA中的尿嘧啶中的尿嘧啶第七页，本课件共有24页E.Coli（dut-，ung-）n n合成的DNA中含有尿嘧啶，M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基。n nCJ236(dut-，ung-，F+)第八页，本课件共有24页ssDNA制备载体制备载体n n1 单链噬菌体载体 M13n n2 phagemid载体-辅助噬菌体第九页，本课件共有24页所用酶类
4、所用酶类n nT4噬菌体聚合酶：诱变几率65%n nT7噬菌体聚合酶：3-5外切活性强，持续合成DNA的能力强，遇到引物时会停止。诱变几率83%n nKlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链时，可能会替换。诱变几率36%第十页，本课件共有24页影响因素影响因素n n1 引物：热动力学（配对），突变碱基的左右8-10bpn n2 T4连接酶n n3 5端磷酸化n n4 单链结合蛋白：解决颈环结构第十一页，本课件共有24页n n基因扩增（gene amplification）主要内容：1.1.体外扩增体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基
5、因的扩增。4.程序基因扩增 5.5.进化过程中的基因扩增进化过程中的基因扩增第十二页，本课件共有24页n nPCRPCR技术技术 在在19831983年，美国年，美国CetusCetus公司人类遗传研公司人类遗传研究室的科学家究室的科学家K.B.MullisK.B.Mullis发明的。发明的。PCR PCR是一种在体外快速扩增特定基是一种在体外快速扩增特定基因或因或DNADNA序列的方法，有称之为体序列的方法，有称之为体外扩增法。外扩增法。第十三页，本课件共有24页(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 2553333335555(d)(d)新引物新引物新引物新引物5533靶靶靶靶DNAD
6、NA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链5 5 3 3 3355引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)第十四页，
7、本课件共有24页温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）9494727260609494变性变性变性变性（1min1min）60 60 退火退火退火退火（1min1min）72 72 延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNADNADNA变性、引变性、引变性、引变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图
8、中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是应参数是应参数是应参数是94949494变性变性变性变性1min1min1min1min，60 60 60 60 退火退火退火退火1min1min1min1min，72 72 72 72 延伸延伸延伸延伸1.5min1.5min1.5min1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。产物的
9、数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。第十五页，本课件共有24页Reaction Condition for a Typical PCR AssayReaction Condition for a Typical PCR Assay第十六页，本课件共有24页Typical PCR Thermal ProfileTypical PCR Thermal Profile*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any*This cycle is normally included in a PCR
10、assay in order to allow any“unfinished”product from previous amplification to achieve its full length“unfinished”product from previous amplification to achieve its full length第十七页，本课件共有24页Some DNA Polymerases Used in PCR第十八页，本课件共有24页Characteristics of Taq PolymeraseCharacteristics of Taq Polymerase
11、第十九页，本课件共有24页n nPCR引物：与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。1.其长度通常在1530个核苷酸之间。2.简并引物 atggctant 3.嵌套引物嵌套引物 PCR扩增的长度：2kb第二十页，本课件共有24页n nPCR技术的应用：1.基因组克隆 突变体的鉴定和在PCR过程中有目的的添加核算序列。第二十一页，本课件共有24页第二十二页，本课件共有24页n n反相反相反相反相PCRPCR(reverse PCR)(reverse PCR)与染色体步移与染色体步移与染色体步移与染色体步移第二十三页，本课件共有24页n n不对称PCR(asymmertric PCR)用来制备单链的DNA 特点：两种引物的浓度不同，低浓度的限制引物和高浓度引物，两者浓度相差约100倍。获得单链核苷酸的另一种方法是通过固相支持物作DAN链的特意洗脱。（生物素链霉素包裹的磁珠）第二十四页，本课件共有24页