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1、特殊光学特殊光学显微微镜的原理与使用的原理与使用第1页，本讲稿共22页暗视野显微镜暗视野显微镜相差显微镜相差显微镜荧光显微镜荧光显微镜偏光显微镜偏光显微镜干涉显微镜干涉显微镜体视显微镜体视显微镜倒置显微镜倒置显微镜共聚焦显微镜共聚焦显微镜第2页，本讲稿共22页暗视野显微镜暗视野显微镜根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜。的显微镜。不让直射光线进入物镜的镜头，而是先让直射光线经过暗视野聚光不让直射光线进入物镜的镜头，而是先让直射光线经过暗视野聚光器后改变途径，使其斜向射向被检物体。器后改变途径，使其斜向射向被检物
2、体。能观察到明视野下看不到的极其微小的物体，可判断物质颗能观察到明视野下看不到的极其微小的物体，可判断物质颗粒的存在与否。最高分辨率可达粒的存在与否。最高分辨率可达0.004um,”超显微镜术超显微镜术“1.换上暗视野聚光器并在聚光器透镜的上表面滴上镜头油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片下表面缓缓接触。只有在油滴与载玻片的底面相接触后，光线才能射向标本。2.将视场光圈适当缩小，用10倍物镜找到被检物体，同时可在视场中看到视场光圈的轮廓像。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈的像清晰可见。步骤步骤第3页，本讲稿共22页相差显微镜的相差显微镜的特点特点光光线线通通过过比比较较透透明明的的标标本本时
3、时，光光的的波波长长（颜颜色色）和和振振幅幅（亮亮度度）都都没没有有明明显显的的变变化化。因因此此，用用普普通通光光学学显显微微镜镜观观察察未未经经染染色色的的标标本本（如如活活的的细细胞胞）时时，其其形形态和内部结构往往难以分辨。态和内部结构往往难以分辨。相相差差显显微微镜镜能能通通过过其其特特殊殊装装置置环环状状光光阑阑和和相相板板，利利用用光光的的干干涉涉现现象象，将将光光的的相相位位差差转转变变为为人人眼眼可可以以察察觉觉的的振振幅幅差差（明明暗暗差差），从从而而使使原原来来透透明明的的物物体体表表现现出出明明显显的的明明暗暗差差异异，对对比比度度增增强强，使使我我们们能能比比较较清清
4、楚楚的的观观察察到到普普通通光光学学显显微微镜镜和和暗暗视视野野显显微微镜镜下下都都看看不不到到或或看看不不清清的的活活细细胞胞及及细细胞胞内的某些细微结构内的某些细微结构第4页，本讲稿共22页相差显微镜的相差显微镜的成像原理成像原理镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光线束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环所成的像恰好发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生落
5、在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，别将通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明
6、体的光线使人眼不可分辨相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。的相位差转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。第5页，本讲稿共22页相差显微镜的相差显微镜的结构和装置结构和装置1、环状光阑、环状光阑具有环形开孔的光阑。位于聚光器的具有环形开孔的光阑。位于聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相应的光阑聚光器。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。转到光路即可
7、。第6页，本讲稿共22页相差显微镜的相差显微镜的结构和装置结构和装置2、相板、相板位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫区域，直射光通过的部分叫“共轭面共轭面”，衍，衍射光通过的部分叫射光通过的部分叫“补偿面补偿面”。带有相板的。带有相板的物镜叫相差物镜，常以物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样标在物镜字样标在物镜外壳上。外壳上。相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线吸收掉薄膜，它能
8、把通过的光线吸收掉60%93%，相，相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位推迟的光线相位推迟1/4波长。波长。第7页，本讲稿共22页相差显微镜的相差显微镜的结构和装置结构和装置3、合轴调节望远镜、合轴调节望远镜是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和衍射须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被该吸收的衍
9、射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符号），用于符号），用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚看到一明镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再
10、转动聚光器上的环状光阑的两个调一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面暗节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面暗环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检应更换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。观察。第8页，本讲稿共22页相差显微镜的相差显微镜的结
11、构和装置结构和装置4、绿色滤光片、绿色滤光片由于使用的照明光线的波长不同，由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。滤光片来调整光源的波长。Olympus厂家生产的相差显微镜在厂家生产的相差显微镜在镜检时要使用该厂规定的镜检时要使用该厂规定的IF550绿色绿色滤光片作为配套器件。滤光片作为配套器件。第9页，本讲稿共22页相差显微镜的相差显微镜的使用范围使用范围相差显微镜能观察到透明样品的细相差
12、显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。因此，是微生物学、细构的观察。因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。究的必备工具。第10页，本讲稿共22页相差显微镜的相差显微镜的操作步骤操作步骤（1）根据观察标本的性质及要求，挑选适合的相差）根据观察标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。物镜。（2）将标本片放到载物台上。）将标本片放到载物台上。（3）进行光轴中心的调整。）进
13、行光轴中心的调整。（4）取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，调整环状）取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合，然后取下光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合，然后取下合轴调节望远镜，换回目镜。在使用中，如需要更换合轴调节望远镜，换回目镜。在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。环吻合的调整。（5）放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检操）放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检操作与普通光学显微镜方法相同。作与普通光学显微镜方法相同。第11页，本讲稿共22页相差显微镜的相差显微镜的注
14、意事项注意事项（1）视场光阑与聚光器的孔径光阑必须）视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。部分光。（2）不同型号的光学部件不能互换使用。）不同型号的光学部件不能互换使用。（3）载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，）载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，不能过薄或过厚。不能过薄或过厚。（4）切片不能太厚，一般以）切片不能太厚，一般以510m为为宜，否则会引起其他光学现象，影响成像宜，否则会引起其他光学现象，影响成像质量。质量。第12页，本讲稿共22页荧光显微镜荧光
15、显微镜荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。本的荧光图像。荧光是什么？荧光是什么？第13页，本讲稿共22页第14页，本讲稿共22页荧光显微镜荧光显微镜-光源光源多采用多采用200W的超高压汞灯作光源的超高压汞灯作光源国产超高压汞灯国产超高压汞灯GCQ-200型性能型性能良好，可以代替良好，可以代替HBO-200等型的等
16、型的进口灯泡进口灯泡第15页，本讲稿共22页荧光显微镜荧光显微镜-滤色系统滤色系统滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板型号，各厂家名称常不统一。滤板一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面各厂家名称常不统一。滤板一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。字母代表玻璃，数字代表型号特点。第16页，本讲稿共22页荧光显微镜荧光显微镜-滤色系统滤色系统1激发滤板激发滤板根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板
17、，提供一定波长范围的激发光。一定波长范围的激发光。紫外光激发滤板：此滤板可使紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，以下的紫外光透过，阻挡阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为以上的可见光通过。常用型号为UG-1或或UG-5，外加，外加一块一块BG-38，以除去红色尾波。，以除去红色尾波。紫外蓝光激发滤板：此滤板可使紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300450nm范围内的光范围内的光通过。常用型号为通过。常用型号为ZB-2或或ZB-3，外加，外加BG-38。紫蓝光激发滤板：它可使紫蓝光激发滤板：它可使350490nm的光通过。常用的光通过。常用型号为型号为QB24（BG12）。）
18、。最大吸收峰在最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素）可用以上者的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板（如蓝绿滤板（如B-7）激发。）激发。第17页，本讲稿共22页荧光显微镜荧光显微镜-滤色系统滤色系统2压制滤板压制滤板压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应滤压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围的荧光。与激发滤板相对应，常用以下长范围的荧光。与激发滤板相对应，常用以下3种压制种压制滤板：滤板：紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与外光通过。能与UG-1或或UG-5组合。常用组合。常用GG-3K430或或GG-6K4
19、60。紫蓝光压制滤板：能通过紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤长的荧以上滤长的荧光（绿到红），能与光（绿到红），能与BG-12组合。通常用组合。通常用OG-4K510或或OG-1K530。紫外紫光压制滤板：能通过紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的以上波长的荧光（蓝到红），可与荧光（蓝到红），可与BG-3组合，常用组合，常用OG-11K470AK490，K510。第18页，本讲稿共22页荧光显微镜荧光显微镜-目镜目镜在荧光显微镜中多用低倍目镜，如在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5和和6.3。第19页，本讲稿共22页荧光显微镜荧光显微镜标本制作要求标本制作要求载玻片厚度应在载玻片厚度应
20、在0.81.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。光。有时需用石英玻璃载玻片。盖玻片厚度在盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发
21、光，这种反射的激发光女镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。可激发标本。组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.59.5时较亮，时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9
22、.09.5的碳酸盐缓冲液的等的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。量混合液作封裱剂。般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。质量略有影响。第20页，本讲稿共22页使用荧光显微镜的使用荧光显微镜的注意事项注意事项（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序（2）应在暗室中进行检
23、查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯515min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。（4）检查时间每次以）检查时间每次以12h为宜，超过为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射荧光减弱；标本受紫外线照射35min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超后，荧光也明显减弱；所以，最多不得
24、超过过23h。（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。源。（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中塑料袋中4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。（7）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即）荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一一”无或可见微弱荧光。无或可见微弱荧光。“+”仅能见明确可见的荧光。仅能见明确可见的荧光。“+”可见有明亮的荧光。可见有明亮的荧光。“+”可见耀眼的可见耀眼的荧光。荧光。第21页，本讲稿共22页第22页，本讲稿共22页